5.

4 Comparacin de clulas PAMPA y Caco-2

5.4.1 Ensayo de Permeabilidad de Membranas Artificiales

Paralelas (PAMPA)
El modelo PAMPA se introdujo por primera vez en 1998 (Kansy et
al., 1998) y desde entonces se han publicado numerosos informes
que ilustran la aplicabilidad general de este modelo como una
herramienta de cribado de permeabilidad de alto rendimiento. El
modelo consiste en un material de filtro hidrfobo recubierto con
una mezcla de lecitina / fosfolpidos disueltos en un disolvente
orgnico inerte tal como dodecano creando una barrera de
membrana lipdica artificial que imita el epitelio intestinal. Se
demostr que la velocidad de permeacin a travs de la barrera de
membrana se correlaciona bien con el grado de absorcin del
frmaco en humanos. El uso de placas de microtitulacin de 96
pocillos junto con el anlisis rpido usando un lector de placas
espectrofotomtricas hace de este sistema un modelo muy atractivo
para cribar un gran nmero de compuestos y bibliotecas. PAMPA
es mucho menos intensiva en mano de obra que los mtodos de
cultivo celular, pero parece mostrar una previsibilidad similar. Una
de las principales limitaciones de este modelo es que la PAMPA
subestima la absorcin de compuestos que se absorben activamente
a travs de los transportadores de frmacos. A pesar de la
limitacin, PAMPA puede servir como una invaluable pantalla de
permeabilidad primaria durante el proceso de descubrimiento
temprano de frmacos debido a su capacidad de alto rendimiento

5.4.1.1 Protocolo del Estudio PAMPA

Una placa de microtitulacin de 96 pocillos y una placa de filtro de

96 pocillos (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.) se ensamblaron en
un "emparedado" de manera que cada pocillo compuesto se separ
por un disco de microfiltro de 125 m (poros de 0,45 m). El
material de filtro hidrfobo de la placa de filtro de 96 pocillos se
recubri con 5 l de la solucin de lpido pION y se agit
suavemente para asegurar un recubrimiento uniforme.
Posteriormente, se coloc la placa de filtro en la placa de
microtitulacin que contena 200 L de los compuestos de ensayo
de 100 m (disueltos en DMSO al 1% tampn), que constituan el
pocillo donador. La solucin donante que contena el compuesto de
ensayo se prepar por dilucin (100 veces) a partir de una solucin
madre 10 mM en DMSO usando la solucin tampn pION a pH
7,4 seguido por filtracin a travs de un filtro de 96 pocillos de
fluoruro de polivinilideno (PVDF) de 0,20 m. Los pocillos
receptores (es decir, la parte superior de los pocillos) del sandwich
se hidrataron con 200 L de la solucin tampn inica
especializada. El sistema se incub entonces a temperatura
ambiente durante 4 h. Al final del tiempo de incubacin, se
retiraron las muestras de los pocillos receptor y donante y se
analizaron mediante un lector de placas UV. Los estudios de
permeabilidad se realizaron por triplicado (es decir, tres pocillos
por compuesto). El coeficiente de permeabilidad aparente se
estim utilizando el software proporcionado por pION.

5.4.2 Clulas Caco-2

El modelo de clulas Caco-2 ha sido el modelo celular ms popular

y ms extensamente caracterizado en el examen de la
permeabilidad de los frmacos tanto en la industria farmacutica
como en la academia. Las clulas Caco-2, un adenocarcinoma de
colon humano, experimentan una diferenciacin enteroctica
espontnea en el cultivo y se convierten en clulas polarizadas con
uniones estrechas bien establecidas, parecidas al epitelio intestinal
en humanos. Tambin se ha demostrado que la permeabilidad de
los frmacos a travs de las monocapas de clulas Caco-2 se
correlaciona muy bien con el grado de absorcin oral en seres
humanos. En los ltimos 10-15 aos, las clulas Caco-2 se han
utilizado ampliamente como una herramienta in vitro para evaluar
la propiedad de permeabilidad de los compuestos de
descubrimiento y para realizar estudios mecnicos en profundidad
5.4.2.1 Cultura de clulas Caco-2

Se obtuvieron clulas Caco-2 de la American Type Culture

Collection y se cultivaron como se describe a continuacin. Las
clulas se sembraron en una membrana de filtro de policarbonato
de 24 pocillos (insertos HTS - Transwell \ gamma R, superficie:
0,33 cm2) a una densidad celular de 80.000 clulas / cm2 Las
clulas se cultivaron en medio de cultivo que consista en medio
Eagle modificado por Dulbecco suplementado con suero bovino
fetal al 10%, aminocidos no esenciales al 1%, L-glutamina al 1%,
penicilina-G 100 U / ml y estreptomicina 100 g / ml. El medio de
cultivo se reemplaz cada 2 das y las clulas se mantuvieron a 37
C, 95% de humedad relativa y 5% de CO2. Los estudios de
permeabilidad se llevaron a cabo con las monocapas cultivadas
durante aproximadamente 21 das con el nmero de pasajes
celulares entre 50 y 80. Las monocapas de clulas Caco-2 con
valores TEER mayores de 400 Cm2.

5.4.2.2 clulas Caco-2 protocolo de estudio

El medio de transporte utilizado para los estudios de permeabilidad

fue el tampn HBSS que contena 10mM de HEPES. Antes de
todos los experimentos, cada monocapa se lav dos veces con
tampn y TEER se midi para asegurar la integridad de las
monocapas. La concentracin de los compuestos de ensayo oscil
entre 10 y 200 M en este ensayo. Los estudios de permeabilidad
se iniciaron aadiendo un volumen apropiado de tampn que
contena el compuesto de ensayo al lado apical (para transporte
apical a basolateral, A a B) o basolateral (para el transporte
basolateral a apical, B a A) de la monocapa. Las monocapas se
colocaron entonces en una incubadora a 37C. Se tomaron
muestras del compartimento apical y basolateral al final del
perodo de incubacin (tpicamente a las 2 h) y se analizaron las
concentraciones del compuesto de ensayo mediante un mtodo de
cromatografa lquida de alto rendimiento como se describi
anteriormente (Chong et al., 1996). El coeficiente de permeabilidad
(Pc) se calcul de acuerdo con la siguiente ecuacin:

Pc = dA/( dtSCo )
Donde dA / dt es el flujo del compuesto de ensayo a travs de la
monocapa (nmol / s), S es el rea superficial de la monocapa
celular (cm2), y Co es la concentracin inicial (M) en el
compartimiento donante. Los valores de Pc se expresaron como nm
/ s. Todos los datos de permeabilidad reportados en este captulo se
generaron en el PRI de Bristol-Myers Squibb. Una variacin menor
en el procedimiento experimental a menudo dio lugar a una
diferencia significativa en la medicin de la permeabilidad,
haciendo una comparacin de datos entre laboratorios muy difcil.
Por lo tanto, tambin se incluye como punto de referencia el
protocolo de estudio del ensayo de permeabilidad celular PAMPA y
Caco-2.

5.4.3 PAMPA y clulas Caco-2: sinergias

Los modelos de clulas PAMPA y Caco-2 se usan a menudo en

combinacin para evaluar las propiedades de permeabilidad de un
gran nmero de compuestos en la etapa de descubrimiento
temprano de frmaco. El modelo PAMPA se ha demostrado en los
ltimos aos como un modelo eficiente, econmico y de alto
rendimiento. El modelo de clulas Caco-2, por otra parte, ha sido el
modelo estndar de oro durante ms de una dcada para la
deteccin de permeabilidad en la fase de descubrimiento de
frmacos. PAMPA captura la permeabilidad pasiva transcelular a
travs de la barrera de la membrana lipoidea sin la contribucin de
poros o transportadores de drogas. El modelo de clulas Caco-2 es
capaz de incorporar no slo la permeabilidad pasiva transcelular
sino tambin el transportador mediado (eflujo y flujo) y los
componentes paracelulares del transporte. La Figura 5.2 demuestra
que se puede obtener una prediccin razonablemente buena del
grado de absorcin en humanos para ~ 22 frmacos
comercializados por los modelos de clulas Caco-2 y PAMPA. La
Tabla 5.3 enumera los valores de permeabilidad en estos dos
modelos y la fraccin absorbida en humanos para el conjunto de
validacin. Estos frmacos se seleccionaron de diferentes reas
teraputicas y representan diversas estructuras y propiedades
fisicoqumicas. Adems, son bien conocidos por ser absorbidos
pasivamente sin implicacin de transportador principal conocido.
Es evidente que para los frmacos absorbidos pasivamente, ambos
modelos de permeabilidad mostraron correlacin similar. Los dos
modelos tambin comparten varias otras caractersticas que son
bastante comunes. El rango dinmico de los valores de
permeabilidad (es decir, el aumento del doble en el valor de
permeabilidad para los frmacos altamente absorbidos en
comparacin con los frmacos mal absorbidos) fue cercano a dos
rdenes de magnitud en ambos modelos con pendiente similar. La
inclinacin de las pendientes puede reflejar la previsibilidad del
modelo para los frmacos que se absorben moderadamente, y
parece que los dos modelos tienen predictibilidad similar para los
frmacos con permeabilidad moderada. La figura tambin
demuestra que es muy difcil diferenciar los frmacos en el rango
medio debido a una gran variabilidad en el rango medio de la
curva. Sin embargo, ambos modelos pueden funcionar muy bien al
clasificar los frmacos candidatos en categoras amplias (alta,
media, baja) basndose en sus valores de permeabilidad, pero
pueden carecer de la sensibilidad para predecir con precisin
pequeas diferencias en los valores de permeabilidad. Los dos
modelos tambin muestran una variabilidad similar de los datos
(20-30% de coeficiente de variacin) y los problemas de
recuperacin del balance de masa (muchos compuestos tenan una
recuperacin incompleta).
 FIGURA 5.2. Correlacin de (a) permeabilidad de PAMPA y (b)
permeabilidad de clulas Caco-2 con el grado de absorcin en
seres humanos para frmacos comercializados. Se sabe que estos
frmacos se absorben principalmente va pasiva difusiva. Cada
 punto es la media de tres o ms repeticiones. La lnea de puntos
representa un corte de 100 nm / s.

TABLA 5.3. Los valores de permeabilidad celular PAMPA y

Caco-2 de los frmacos comercializados

La Figura 5.3 representa la correlacin observada entre los dos

modelos de permeabilidad para ~100 compuestos de investigacin
internos de varios programas de descubrimiento de frmacos. Los
compuestos se seleccionaron cuidadosamente de varios programas
de investigacin y reflejaron una gran diversidad de propiedades
qumicas y fsico-qumicas. Los valores de permeabilidad para
estos compuestos se determinaron en ambos modelos usando
condiciones experimentales estndar descritas anteriormente. A
continuacin, los compuestos se clasificaron en recipientes de
permeabilidad "baja" y "alta" basados en datos de calibracin
interna. El valor de permeabilidad de ~ 100 nm / s se seleccion
como punto de corte para ambos modelos. Una mirada superficial a
la cifra de correlacin podra sugerir una falta de correlacin lineal
entre los dos modelos en trminos de sus valores de permeabilidad.
Sin embargo, la incorporacin de la estrategia de agrupamiento
(utilizando 100 nm / s como el valor de corte) sugiere que los dos
modelos demuestran un acuerdo aceptable. Alrededor del 80% de
los compuestos ensayados se asignaron a la misma caja (es decir,
los resultados estaban de acuerdo) por ambos modelos. Estos
compuestos estn representados en los cuadrantes 2 y 3 de la
figura. Casi la mitad de estos compuestos se clasificaron como de
"baja" permeabilidad por ambos mtodos (cuadrante 3) y la otra
mitad fueron de "alta" permeabilidad (cuadrante 2). Los
compuestos que caan en los cuadrantes 1 y 4 eran las
desconexiones entre los dos modelos de permeabilidad. El
desacuerdo observado para ~ 20% de los compuestos resalta la
diferencia fundamental entre los dos modelos. PAMPA es un
modelo de absorcin que captura la difusin transcelular no
contaminada a travs de las bicapas lipdicas. Est completamente
desprovisto de cualquier afluencia / efluencia de transportadores o
poros paracelulares. Por otro lado, las uniones estrechas de clulas
y varios transportadores de frmacos (eflujo: PepT1 y eflujo: Pgp,
MRP2, BCRP, etc.) se expresan en la monocapa de clulas Caco-2.
Los compuestos mostrados en el cuadrante 4 (alta PAMPA y baja
permeabilidad de las clulas Caco-2) probablemente sean sustratos
de transportadores de eflujo que limitaran su permeabilidad en el
modelo de clulas Caco-2.

FIGURA 5.3. Correlacin de la permeabilidad de PAMPA con la

permeabilidad de clulas Caco-2 para ~100 compuestos de
investigacin internos de los laboratorios Bristol-Myers Squibb.
Cada punto es la media de tres o ms repeticiones
Debido a que la PAMPA es una simple bicapa de lpidos, la
permeabilidad de los compuestos en el cuadrante 4 permanece alta.
Un puado de compuestos del cuadrante 4 fueron evaluados para
su potencial de sustrato de P-gp realizando un estudio de transporte
bidireccional en clulas Caco-2. Como era de esperar, todos se
mostraron como sustratos con una relacin de eflujo (relacin de B
a A / A a B) mayor que 3. El cuadrante 1 representa compuestos
que tienen alta permeabilidad de clulas Caco-2 y baja
permeabilidad de PAMPA. Es probable que los compuestos en el
cuadrante 1 penetren la monocapa de clulas Caco-2 a travs de
poros paracelulares y / o transportadores de afluencia. En general,
se espera un buen acuerdo entre los dos modelos de permeabilidad
para compuestos pasivamente absorbidos. Si hay desacuerdo entre
estos dos modelos, puede proporcionar una pista de que la
afluencia especfica o los transportadores de eflujo estn
involucrados. Y los estudios de seguimiento que utilizan modelos
ms mecansticos (por ejemplo, lnea celular con transportador
especfico expresado, oocitos de xenopus, etc.) podran estar
justificados.
A menudo se usa una combinacin de clulas PAMPA y Caco-2
para evaluar la permeabilidad de los compuestos de ensayo de la
manera ms rentable. El modelo PAMPA se prefiere en virtud de su
fcil configuracin y funcionamiento rpido. Se trata de un ensayo
de bajo costo (costo por prueba es una fraccin del costo de las
clulas Caco-2) y es menos recurso y tiempo. El modelo
automatizado PAMPA impulsado por robot es capaz de filtrar miles
de compuestos por semana. Caco-2 clulas, por otro lado, es un
coste y recurso de ensayo intensivo y no se puede ultra HTS. Para
obtener la mxima informacin de permeabilidad / absorcin en el
menor tiempo posible con un uso mnimo de recursos, cada vez es
ms popular una combinacin de PAMPA junto con clulas Caco-2
unidireccionales (permeabilidad A a B). La Figura 5.4a muestra los
valores de permeabilidad celular Caco-2 obtenidos para una serie
de compuestos dentro de un quimiotipo de un programa de
investigacin tpico. La mayora de los compuestos tenan valores
de permeabilidad "bajos" por debajo de 100 nm / s en el modelo de
clulas Caco-2. Generalmente se supondra que estos compuestos
con baja permeabilidad de las clulas Caco-2 eran pobremente
absorbidos en seres humanos y no pueden hacer que el corte inicial
se mueva hacia adelante (es decir, de baja prioridad). Sin embargo,
un ensayo de combinacin (PAMPA y clula Caco-2
unidireccional) proporciona una mejor comprensin de las
caractersticas de absorcin de estos compuestos.

FIGURA 5.4. (A) Permeabilidad de las clulas Caco-2 (A a B) para una lista
de compuestos dentro de un programa de investigacin. Los valores de
permeabilidad se obtuvieron usando clulas Caco-2 cultivadas durante ~21
das, seguidas de estudios de transporte a 200 M. (B) Permeabilidad de las
clulas Caco-2 bidireccionales y valores de permeabilidad PAMPA para
algunos compuestos seleccionados aleatoriamente dentro del programa. Se
realiz el estudio PAMPA a 100 M
Un conjunto seleccionado aleatoriamente de compuestos con
valores de permeabilidad de clulas Caco-2 inferiores a 100 nm / s
fue evaluado para su permeabilidad PAMPA as como su
permeabilidad bidireccional en el modelo de clulas Caco-2. Los
resultados de estos dos modelos de permeabilidad se muestran en
la Fig. 5.4b. El ensayo de combinacin demostr que la baja
permeabilidad de la clula A a B Caco-2 de muchos compuestos se
deba al hecho de que son sustratos de P-gp (es decir, la
permeabilidad B a A es mucho ms alta que la permeabilidad A a
B) A baja permeabilidad intrnseca del compuesto. La alta
permeabilidad de PAMPA unida a una baja permeabilidad de las
clulas Caco-2 indicara un proceso de eflujo activo (en clulas
Caco-2) y no necesariamente una baja permeabilidad intrnseca del
compuesto de ensayo. Puede esperarse que estos compuestos
tengan permeabilidad intestinal ms que adecuada si la P-gp
intestinal est saturada debido a la alta concentracin de frmaco
en el intestino. De hecho, muchos de estos compuestos mostraron
una buena biodisponibilidad oral en modelos animales preclnicos.
A pesar de ser un sustrato de P-gp, estos compuestos fueron bien
absorbidos in vivo, y el alto valor de permeabilidad PAMPA fue
reflejo de la absorcin in vivo
Una combinacin de modelos de permeabilidad de clulas
PAMPA y unidireccionales (A a B) Caco-2 puede proporcionar
sinrgicamente una valiosa evaluacin de la permeabilidad /
absorcin de los compuestos de ensayo. Si tanto PAMPA como la
permeabilidad de las clulas A a B Caco-2 son bajas, entonces el
compuesto puede ser privado de una permeabilidad intrnseca baja
y, por lo tanto, probable que tenga una pobre absorcin en seres
humanos. Sin embargo, si la permeabilidad de clulas A a B Caco-
2 es baja pero PAMPA es alta, entonces es probable que el
compuesto sea un sustrato de P-gp y no necesariamente un
compuesto poco permeable in vivo. A un nivel de dosis oral
relevante, la P-gp puede saturarse para permitir una absorcin
adecuada en seres humanos. Una evaluacin paralela de la PAMPA
y la permeabilidad de las clulas A a B Caco-2, seguida de un
anlisis bidireccional ms detallado de clulas Caco-2, podra ser
un camino prudente para los programas de investigacin.
La absorcin del frmaco se produce principalmente en el
intestino delgado, donde el pH puede variar de cido a neutro y
ligeramente bsico (Dressman et al. , 1990; Russell et al. , 1993).
En la parte superior del intestino delgado, donde es probable que el
pH sea ms cido, los frmacos dbilmente cidos existen
principalmente como forma sindicalizada y la va transcendental
pasiva se convierte en la va de permeacin dominante. Por el
contrario, los frmacos dbilmente bsicos estarn principalmente
en forma de especies ionizadas y, por consiguiente, la va
transcelular pasiva desempea un papel secundario. Por lo tanto, el
pH apical utilizado en el ensayo de permeabilidad se vuelve crtico.
Los ensayos de permeabilidad de clulas PAMPA y Caco-2 se
realizan tpicamente a un solo donante pH 6,5 para mantener un
rendimiento adecuado (es decir, el nmero mximo de compuestos
evaluados en un marco de tiempo mnimo). El pH de donante nico
es perfectamente apropiado para compuestos neutros y
zwiterinicos en los que no se espera que un cambio en el pH
afecte al estado de ionizacin. Sin embargo, la mayora de los
nuevos frmacos candidatos son bases dbiles o cidos dbiles. Por
lo tanto, la permeabilidad de los frmacos candidatos con grupos
ionizables depende significativamente del pH experimental
utilizado. La Tabla 5.4 enumera un puado de frmacos (cidos y
bases) junto con sus valores de permeabilidad en el modelo
PAMPA bajo dos condiciones experimentales de pH diferentes.
TABLA 5.4. Efecto del pH en la permeabilidad de PAMPA

El valor de permeabilidad es consistentemente bajo a pesar de la absorcin

completa en humanos
Como se esperaba, los frmacos cidos (por ejemplo, ibuprofeno,
cetoprofeno, piroxicam, etc.) mostraron una permeabilidad
significativamente mayor cuando se estudiaron a pH 5,0 que 7,4, y
los frmacos bsicos (por ejemplo, metoprolol, timolol, etc.) Tena
una permeabilidad mucho ms alta a pH 7,4 que 5,0. Todos los
frmacos enumerados estn casi completamente absorbidos en
humanos (> 90%). Sin embargo, la permeabilidad de estos
frmacos cuando se utiliz pH apropiado es comparable a los
frmacos que no se absorben en absoluto. Por lo tanto, parece que
debe utilizarse un pH de donante apropiado dependiendo de las
propiedades fisicoqumicas de los compuestos de ensayo. El grado
de dependencia del pH es a menudo muy difcil de estimar porque
el pKa de un gran nmero de frmacos candidatos no puede
medirse experimentalmente debido a la limitacin de recursos. Para
minimizar la aparicin de falsos negativos (es decir, clasificado
como poco permeable cuando no lo es), se hace necesario realizar
el ensayo en dos condiciones de pH diferentes (bajo de pH ~ 5 y
pH alto ~ 7,4) que simula el entorno de pH dinmico En el
intestino para capturar la verdadera permeabilidad intrnseca.
Debido a un potencial de rendimiento ms alto, el modelo PAMPA
puede usarse en el estudio de permeabilidad dependiente del pH de
primer nivel para quimiotipos similares. Una vez que se identifica
un pH ptimo, todos los estudios posteriores (incluyendo estudios
basados en clulas, basados en tejidos) se pueden llevar a cabo a
ese pH. Sin embargo, debe reconocerse que los estudios de
permeabilidad realizados a pH mltiple afectaran negativamente el
rendimiento y el coste involucrado.

5.4.4 Clulas PAMPA Caco-2: Advertencias

5.4.4.1 Absorcin mediada por transportador y paracelular

El PAMPA es un modelo de permeabilidad basado en no celdas de

alto rendimiento que proporciona estimaciones de la propiedad de
permeabilidad transcelular pasiva. La falta de transportadores de
frmacos funcionales y poros paracelulares en PAMPA lo convierte
en un modelo inapropiado para compuestos que se absorben a
travs de procesos mediados por transportador y poros. Sin
embargo, la falta de permeabilidad mediada por transportador y
poros puede ser una ventaja del modelo PAMPA. Debido a que la
PAMPA proporciona una permeabilidad pasiva transcelular no
contaminada, podra ser ms til en la construccin de la relacin
estructura-permeabilidad en el banco de qumica. La lipofilicidad
(ms comnmente expresada como valores Log P o Log D)
desempea un papel importante en la difusin pasiva. Se requiere
una lipofilicidad adecuada para que un permeante se desplace a
travs de la membrana de fosfolpidos. Sin embargo, como se
muestra en la Fig. 5.5, la permeabilidad PAMPA de 22 frmacos
comercializados (enumerados en la Tabla 5.3) no demostr ninguna
correlacin con la lipofilia sola.

FIGURA 5.5. Correlacin de la permeabilidad de PAMPA con

lipofilicidad. El valor de Log D (pH 7,4) se calcul utilizando el
mdulo ACD / Log D.

Como se espera, en la definicin de la permeabilidad pasiva

general de cualquier compuesto intervienen otros factores (por
ejemplo, rea superficial polar, volumen molecular / flexibilidad,
enlace de hidrgeno, etc.) adems de la lipofilidad. Aunque los
transportadores de frmacos farmacuticamente importantes (por
ejemplo, PEPT1, OCT, OAT, etc.) se expresan funcionalmente en
clulas Caco-2 (Sun et al., 2002, Anderle et al., 2004; Behrens et
al. Cuantitativamente inferior al expresado en comparacin con la
situacin in vivo. Por ejemplo, los antibiticos beta-lactmicos (por
ejemplo, cefalexina, amoxicilina) e inhibidores de la ECA, que son
sustratos inequvocos conocidos de transportadores de dipptidos,
son poco permeables a travs de la monocapa de clulas Caco-2 a
pesar de que estn completamente absorbidos in vivo (Chong et
Al., 1996). Este modelo es probable que genere falsos negativos
con los candidatos de frmacos que son transportados por el
proceso mediado por el transportista. Las clulas Caco-2 tienen
uniones estrechas que son significativamente ms estrictas en
comparacin con el intestino humano y no diferencian los frmacos
que son absorbidos principalmente va paracelular. Los compuestos
hidroflicos de bajo peso molecular (por ejemplo, metformina,
ranitidina, atenolol, furosemida, hidroclorotiazida, etc.) mostraron
una permeabilidad pobre (es decir, igual o menor que el manitol)
en las clulas Caco-2 a pesar de una absorcin adecuada (superior
al 50% en humanos). Por lo tanto, modelos tales como las clulas
PAMPA y Caco-2 slo pueden servir como una pantalla
unidireccional de tal manera que los compuestos con alta
permeabilidad en estos modelos son tpicamente bien absorbidos,
sin embargo, los compuestos con baja permeabilidad no pueden
descartarse como compuestos pobremente absorbidos en seres
humanos.
5.4.4.2 Balance de masa incompleta debido a uniones no
especficas
La unin inespecfica de frmacos a dispositivos y clulas de
plstico durante el estudio de permeabilidad es un problema comn
que a menudo hace difcil la interpretacin de datos. La
permeabilidad se calcula en funcin de varios factores: la cantidad
de frmacos aparecida en el compartimento receptor, la
concentracin inicial en el compartimiento donante y el rea
superficial de la barrera fsica (por ejemplo, bicapas lipdicas y
monocapa celular). Cuando se produce una prdida significativa de
frmaco durante la incubacin debido a una unin inespecfica,
ocurren dos cosas: (1) se reduce la concentracin en el
compartimiento donante (una fuerza motriz) y (2) se reduce
artificialmente la concentracin en el compartimiento receptor.
Esto llevar a una subestimacin de las estimaciones de
permeabilidad, y potencialmente conducir a falsos negativos. Se
ha utilizado "cacofilicidad" o "retencin de membrana" como un
trmino para describir la unin del frmaco a la monocapa de
clulas Caco-2, y la unin significativa da como resultado una
recuperacin incompleta. La recuperacin incompleta es
particularmente comn con frmacos candidatos lipfilos. Algunos
enfoques pueden ser capaces de minimizar la unin no especfica.
En lugar de usar la concentracin inicial del donante, se puede usar
la concentracin final del donante al final de la incubacin. La
suposicin es que la unin inespecfica se produce con relativa
rapidez, por lo tanto, la concentracin final del donante es una
mejor estimacin del gradiente de concentracin entre dos
compartimentos. Para ciertos frmacos candidatos con mala
recuperacin, los resultados pueden ser significativamente
diferentes dependiendo del mtodo de clculo utilizado. Otro
enfoque implica la adicin de protenas sricas (albmina de suero
bovino en el caso de clulas Caco-2) o tensioactivos (en el caso de
PAMPA) al compartimento receptor para minimizar la unin no
especfica, por lo tanto, mejorar la recuperacin del ensayo y la
predictibilidad general del modelo (Aungst et al. 2000; Krishna et
al. , 2001; Saha y Kou, 2002).

5.4.4.3 Solubilidad acuosa inadecuada

Los frmacos candidatos en la etapa de descubrimiento temprano a
menudo se optimizan en trminos de SAR alrededor de la potencia
y la actividad farmacolgica, y el SAR generalmente conduce a
candidatos ms lipoflicos y poco solubles (solubilidad en tampn
acuoso <0,01 mg / ml). Como resultado, un porcentaje significativo
de nuevos farmacos candidatos no puede evaluarse en los modelos
de permeabilidad debido a su escasa solubilidad acuosa. Esto es
particularmente problemtico en el modelo basado en clulas
porque las clulas no toleran muy bien los cosolventes orgnicos
tpicos (por ejemplo, DMSO, PG, etc.). Ms all de un pequeo
porcentaje de codisolvente (> 1%), la unin hermtica de la clula
se compromete fcilmente haciendo la interpretacin de datos
difcil o imposible (Dimitrijevic et al. , 2000; Rege et al. , 2001,
2002). Por consiguiente, para algunos programas de
descubrimiento, los datos de permeabilidad no pueden
proporcionarse para una mayora (> 95%) de nuevos compuestos
porque tienden a provenir de un quimiotipo similar que puede
compartir un farmacforo problemtico en trminos de solubilidad
acuosa.

FIGURA 5.6. Efecto de DMSO sobre la permeabilidad de PAMPA

El modelo PAMPA tiene una ventaja significativa sobre las clulas

Caco-2 en este sentido. La Figura 5.6 muestra el efecto de varias
concentraciones de DMSO sobre la permeabilidad PAMPA de
algunos compuestos de sonda (compuestos de Pc alto y bajo).
Contrariamente a un modelo basado en clulas, donde ms de 1%
de DMSO comprometera la monocapa celular conduciendo a
resultados no fiables, la permeabilidad de PAMPA era consistente
en presencia de DMSO hasta 10%. Tener una mayor concentracin
de cosolvente no slo aumenta el porcentaje de compuestos que
pueden ser estudiados con xito en un ensayo de permeabilidad,
sino que tambin mejora la recuperacin del balance de masa. Es
probable que una concentracin de disolvente ms alta minimice la
prdida fsica (por ejemplo, unin no especfica al diseo y la
membrana) durante el estudio de permeabilidad.

5.4.4.4 Otra Variabilidad Experimental

Est bien documentado que la permeabilidad celular Caco-2 del
mismo conjunto de farmacos obtenidos de diferentes laboratorios
vara significativamente (Walter y Kissel, 1995; 2004; Balimane
Ungell, y Chong, 2005a). Hay una gran variedad de factores que
pueden influir en el resultado. Pequeas diferencias en las
condiciones de cultivo celular (por ejemplo, la densidad de
siembra, la frecuencia de alimentacin y composicin de los
medios celulares, etc.), un protocolo experimental (por ejemplo,
concentracin inicial de los farmacos , la composicin del tampn
de permeabilidad, el pH y las etapas de lavado monocapa, etc.) y la
edad de las clulas (por ejemplo, nmero de pasaje, duracin del
cultivo y estrechamiento de unin) pueden producir diferencias
dramticas en los valores de permeabilidad. Adems, la funcin de
los transportadores de frmacos expresada en los modelos basados
en clulas puede fluctuar significativamente con la diferencia en las
condiciones de cultivo (Walter y Kissel, 1995; Anderle et al. ,
2004). Por otra parte, el modelo de permeabilidad PAMPA es un
modelo relativamente rgido menos propenso a los problemas de
variabilidad interlaboratorios. La solucin lipdica utilizada para
crear la membrana bicapa es el nico componente del modelo que
puede incorporar fluctuaciones en el valor de permeabilidad.
Adems, puesto que el PAMPA captura slo la permeabilidad
difusiva pasiva y est desprovisto de cualquier protena
transportadora, otros factores experimentales desempean un papel
insignificante.

5.5 Estudios de P-gp usando clulas Caco-2

El ensayo de permeabilidad bidireccional, en el que la

permeabilidad basolateral a apical (direccin secretor, B a A) se
compara con la permeabilidad apical a basolateral (direccin de
absorcin, A a B), se considera como el patrn oro en la
identificacin de los sustratos P-gp porque Es funcionalmente el
mtodo ms directo para medir las caractersticas de eflujo de los
frmacos candidatos. Los compuestos con una relacin de eflujo
(relacin de B a A / A a B) mayor que 2-3 son tpicamente
considerados como sustratos de P-gp. Sin embargo, es bien
conocido que los transportadores de eflujo distintos de P-gp (por
ejemplo, MRP2, BCRP, etc.) tambin se expresan funcionalmente
en las clulas Caco-2. Por lo tanto, una simple diferencia
bidireccional no puede asegurar que los compuestos que se
ensayan son de hecho sustratos P-gp. Como un estudio
confirmatorio, un experimento de seguimiento bidireccional se
repite rutinariamente en presencia de inhibidores conocidos de P-
gp, BCRP y MRP2. GF120918 a 2-4 M se usa a menudo para
inhibir selectivamente el transporte de eflujo basado en P-gp. Sin
embargo, algunas publicaciones recientes han informado que
GF120918 interacta no slo con P-gp sino tambin con el BCRP
(Maliepaard et al. , 2001; Woehlecke et al. , 2003). Del mismo
modo, MK-571 y FTC se utilizan para inhibir selectivamente la
actividad MRP2 y BCRP, respectivamente. La comparacin de la
relacin de eflujo en ausencia y presencia de estos inhibidores
especficos puede delinear el papel potencial del transportador de
eflujo individual. Debido a que es un ensayo basado en clulas con
una barrera fsica (bicapa lipdica), los compuestos de prueba
deben tener una permeabilidad celular adecuada para el ensayo de
P-gp bidireccional. Un inconveniente principal del ensayo de
permeabilidad bidireccional es que los sustratos de P-gp con
permeabilidad transcelular insuficiente no pueden ser identificados.
Frmacos como famotidina y ranitidina son sustratos para protenas
transportadoras secretoras (Lee et al., 2002), pero a menudo no se
detectan como sustratos de P-gp debido a su baja permeabilidad
pasiva.
Varios transportadores de eflujo (por ejemplo, P-gp, MRP2 y
BCRP) y de afluencia (por ejemplo, PEPT1) se expresan en clulas
Caco-2 en condiciones de cultivo celular estndar. Sin embargo, la
expresin funcional de los transportadores de frmacos en clulas
Caco-2 puede variar significativamente dependiendo del nmero
de pasajes y cambios menores en las condiciones de cultivo. Por
ejemplo, la relacin de eflujo de digoxina o sulfasalazina (ambas
sugeridas como sustrato transportador de eflujo) variaba
drsticamente con el nmero de pasaje.
Es interesante observar que a menudo la falta de expresin
funcional de P-gp se vuelve problemtica espordicamente.
 FIGURA 5.7. Efecto del nmero de paso de clulas Caco-2 sobre
la permeabilidad de sulfasalazina, manitol y metoprolol

No hubo una tendencia identificable con el cambio en el nmero de

pasajes. La Figura 5.7 demuestra que los niveles de expresin de P-
gp en clulas Caco-2 pueden variar significativamente dependiendo
del nmero de pasaje celular. El manitol (un marcador paracelular
hidrfilo) y el metoprolol (marcador transcelular lipfilo)
demostraron valores de permeabilidad consistentes sobre los
diferentes nmeros de pasaje. La reproducibilidad de estos dos
compuestos confirma que las monocapas celulares no estn
comprometidas. Sin embargo, la sulfasalazina, un sustrato de P-gp
que tpicamente tiene un valor de permeabilidad A a B bajo (<30
nm / s), mostr una permeabilidad significativamente mayor (> 120
nm / s) slo para ciertos nmeros de pasaje. La variabilidad en los
niveles de expresin de P-gp se reflej directamente por la
variabilidad en los valores de permeabilidad de la sulfasalazina. De
forma similar, tambin se sabe que los niveles de expresin de P-gp
fluctan ampliamente entre los pozos incluso en un estudio de paso
nico. La relacin de eflujo de digoxina puede variar desde un
valor bajo de 8 a un mximo de 20 en diferentes pozos del mismo
nmero de pasaje Caco-2, destacando la variabilidad en la
expresin del transportador de eflujo
Debido a la expresin funcional de P-gp inconsistente en clulas
Caco-2, la lnea celular que sobreexpresan transportadores de
eflujo puede ser una mejor herramienta in vitro para examinar las
interacciones frmaco-transportador. Las lneas celulares
manipuladas expresan selectivamente el transportador de inters y
facilitan los estudios de interaccin con un transportador especfico
en aislamiento. Los estudios bidireccionales realizados en estas
lneas celulares (sobreexpresando slo un transportador)
demostraran especficamente la implicacin de un solo
transportador sin ninguna interaccin con otros transportadores.
Los estudios de seguimiento se pueden llevar a cabo en presencia
de un inhibidor selectivo para confirmar adicionalmente la
implicacin del transportador (a saber: fenotipificacin del
transportador). Se pueden usar lneas celulares MDCK y LLC-PK1
transfectadas de manera estable con un transportador de eflujo
especfico (por ejemplo, MDR1, mdr1, MRP2 y BCRP) para
eliminar las interacciones transportadoras en la etapa de
descubrimiento temprana. La expresin funcional de los
transportadores en estas lneas celulares parece ser ms estable en
comparacin con las clulas Caco-2.

5.5.1 Factores experimentales que afectan la relacin de eflujo

Actualmente no existe un protocolo de estudio estndar
universalmente aceptado para llevar a cabo el ensayo de
permeabilidad bidireccional basado en clulas. Diferentes
laboratorios realizan estos estudios bajo diferentes condiciones
experimentales que a menudo muestran una gran variabilidad entre
laboratorios. La normalizacin de las condiciones experimentales
(por ejemplo, el pH, la concentracin de frmaco y la duracin de
la incubacin, etc.) pueden proporcionar una mejor coherencia de
los resultados y reducir considerablemente la aparicin de falsos
negativos (es decir, no se puede identificar un verdadero substrato).
El uso de una concentracin ptima de sustrato es un parmetro
clave para obtener resultados precisos de este modelo. El
rendimiento de los estudios bidireccionales a concentraciones altas
(50 M o ms) a menudo conduce a la saturacin del transportador
de eflujo y dan como resultado una relacin de eflujo de la unidad
incluso para los sustratos bien conocidos de P-gp. La Figura 5.8
muestra el dramtico efecto del uso de la concentracin ms baja
(3 M) para mejorar la utilidad de este modelo.
 FIGURA 5.8. Efecto de la concentracin de sustrato (3 M
frente a 50 M) sobre la relacin de eflujo (relacin de B a A / A
a B) en el estudio bidireccional de clulas Caco-2. La relacin de
eflujo se calcul utilizando los datos medios. El coeficiente de
variacin en los datos de permeabilidad (ambas direcciones) es
tpicamente inferior al 25% entre las repeticiones

Los sustratos clsicos de P-gp tales como verapamilo, quinidina y

dos compuestos de investigacin internos muestran una relacin de
eflujo (relacin de B a A / A a B) de ~ 1 cuando se estudian a 50
M. Sin embargo, cuando se estudiaron con una concentracin
menor de 3 M, demostraron caractersticas inequvocas de eflujo
con una relacin de flujo> 2. La P-gp es saturable a altas
concentraciones de sustratos y por lo tanto a 50 M, la P-gp es
eliminada funcionalmente conduciendo a datos falsos negativos. El
uso de concentraciones de substrato ms bajas (<5 M) podra
potencialmente minimizar la saturacin de los transportadores de
eflujo y puede mejorar significativamente la predictibilidad del
ensayo. Debe reconocerse que el descenso de la concentracin del
sustrato impone un desafo analtico y hay que asegurarse de que la
tcnica analtica es capaz de medir las concentraciones de la
muestra con una precisin adecuada.
La pantalla preliminar a una baja concentracin de sustrato es un
enfoque eficaz para evaluar un gran nmero de compuestos y
mantener un rendimiento suficiente. Sin embargo, la clasificacin
"s o no" puede no ser muy til porque es difcil cuantificar (si es
posible) la importancia clnica del papel potencial de la P-gp en la
disposicin del frmaco. Como estudio de seguimiento, se
recomienda que una gama de concentraciones de sustrato a ensayar
y el valor de Km estimado puedan estar relacionados con las
concentraciones de frmaco relevantes in vivo, ya sea en el
intestino (durante la absorcin) o en la circulacin sistmica
(durante la distribucin y la excrecin). Una de las limitaciones
comunes en la realizacin de un experimento de dependencia de la
concentracin es la falta de solubilidad acuosa adecuada de nuevos
candidatos a frmacos (es decir, una solubilidad pobre no permite
ensayar un amplio intervalo de concentracin).
Otro problema potencial con los modelos basados en clulas es
que la integridad de las uniones estrechas en las monocapas de
clulas Caco-2 puede verse comprometida (es decir, se vuelve
permeable) cuando se incuba con compuestos de ensayo, y la
magnitud del dao es tpicamente dependiente de la concentracin.
La permeabilidad a travs de la monocapa comprometida es a
menudo mucho mayor en comparacin con las monocapas intactas,
y la permeabilidad se hace artificialmente alta en ambas
direcciones. En ese caso, la relacin de eflujo a menudo se
convierte en unidad, y el compuesto de ensayo se clasifica como un
sustrato no, incluso si es un sustrato verdadero (de nuevo falso
negativo). Para detectar el dao celular durante la incubacin, se
puede medir el valor TEER antes y despus del estudio. Pero el
cambio en el valor TEER no es muy sensible para detectar un dao
celular menor. Una manera ms definitiva de detectar el dao
celular es incubar un marcador de ruta paracelular tal como manitol
radiomarcado en la prueba. Tambin es posible ver falsos positivos.
Parece que la membrana basolateral de la monocapa de clulas
Caco-2 es ms sensible que la membrana apical (es decir, el dao
celular es ms frecuente en la direccin B hacia A que en la
direccin A a B). Cuando esto ocurre, la permeabilidad de B a A es
significativamente mayor que la permeabilidad de A a B, y el
compuesto de ensayo se clasifica como sustrato de P-gp incluso si
es un sustrato no (falsos positivos). La Figura 5.9 muestra que el
dao celular debido a BMS-X es dependiente de la concentracin
debido a que la permeabilidad al manitol fue significativamente
mayor cuando se incub con 50 M en comparacin con 10 M de
BMS-X y tambin ilustr que la nica membrana basolateral era
sensible a BMS-X.

FIGURA 5.9. Efecto de las concentraciones de frmaco sobre

la integridad de la monocapa de clulas Caco-2

Cuando la concentracin del sustrato se redujo a 10 M, la

permeabilidad B a A se redujo y se hizo similar a la permeabilidad
A a B. Por lo tanto, la reduccin de la concentracin del sustrato es
una buena manera de minimizar el potencial dao celular y, en
consecuencia, la incidencia de falsos positivos y falsos positivos.
Otro factor experimental que debe ser totalmente optimizado es el
pH utilizado en los estudios de permeabilidad bidireccional. La
optimizacin del pH apical no es tan directa como la concentracin
del sustrato. Basndose en el pKa de los compuestos de ensayo, el
cambio en el pH apical puede conducir a una extensin
radicalmente diferente de las fracciones ionizadas y unificadas en
el compartimiento apical y consecuentemente cambios
significativos en el valor de permeabilidad. La Figura 5.10 muestra
el efecto del pH apical sobre la relacin de eflujo observada para
sustratos de P-gp bien conocidos. La digoxina, un sustrato neutro
de P-gp, no tuvo cambios de ionizacin con el pH y mostr una
relacin de flujo de salida uniforme ~ 10 a los tres pH. Sin
embargo, el saquinavir, una base dbil, mostr un cambio
significativo en la relacin de eflujo donde la relacin era mayor
que 50 a un pH apical de 5,5 en comparacin con la relacin de ~
10 a pH 7,4. Por el contrario, la sulfasalazina (contiene un cido
carboxlico) demostr una mayor relacin de eflujo a un pH apical
de 7,4. La relacin de efluxo ms alta observada con saquinavir y
sulfasalazina a un pH apical de 5,5 y 7,4, respectivamente, se debe
principalmente a menores permeabilidades apicales a basolaterales
(es decir, denominador ms pequeo en el clculo de la relacin)
en lugar de los cambios en la permeabilidad basolateral a apical
Por lo tanto, el pH apical debe optimizarse dependiendo del tipo de
grupo funcional ionizable de los compuestos de inters.

FIGURA 5.10. Efecto del pH apical (5,5, 6,5 y 7,4) sobre la

relacin de eflujo de sustratos de P-gp cidos, bsicos y neutros
en el estudio bidireccional de clulas Caco-2. La relacin de
eflujo se calcul utilizando los datos medios. El coeficiente de
variacin en los datos de permeabilidad (ambas direcciones) es
tpicamente inferior al 25% entre las repeticiones.
La informacin previa sobre el pKa y la naturaleza cida / bsica
del compuesto ser muy til en el ensayo de sustrato de P-gp.m
Otras variables experimentales como la duracin de la incubacin,
la composicin del tampn de transporte, la presencia / ausencia de
suero, las condiciones de cultivo celular, etc. necesitan ser
calibradas usando un conjunto de sustratos P-gp conocidos.
Factores tales como las condiciones de cultivo, la composicin de
los medios, la arquitectura de la placa celular un efecto
significativo sobre la expresin de la P-gp y la variabilidad
interlaboratorio es a menudo significativamente grande. Por lo
tanto, una comparacin directa de los resultados obtenidos de
diferentes laboratorios debe hacerse con cautela.

5.6 Conclusiones

Uno de los desafos ms importantes que enfrenta la industria

farmacutica en la actualidad es desarrollar modelos de deteccin
de alto rendimiento, rentables y altamente predictivos de la
absorcin de frmacos que se pueden utilizar durante el proceso de
toma de decisiones en el descubrimiento temprano de frmacos.
Aunque los parmetros fisicoqumicos tales como la lipofilia, la
carga, el peso molecular, etc. se usan a menudo como indicadores
iniciales de absorcin, a menudo no son confiables debido a su
incapacidad para incorporar las condiciones fisiolgicas. Por otra
parte, los mtodos experimentales convencionales para evaluar las
caractersticas de absorcin no son aerodinmicos para mantener el
ritmo con el gran nmero de compuestos sintetizados por la
qumica combinatoria. Los modelos experimentales disponibles
tienen varios pros y contras y su uso racional puede aumentar la
probabilidad de progresar con frmacos con caractersticas
favorables de absorcin oral. Mtodos fisicoqumicos y / o in silico
que son rpidos y no requieren el uso de tejidos animales deben ser
utilizados como los modelos primarios de cribado en la fase
temprana de descubrimiento de frmacos. Posteriormente, pueden
utilizarse sistemas in vitro automatizados de alto rendimiento
(basados en cultivos celulares o basados en tejidos animales) para
seleccionar y optimizar las derivaciones qumicas para identificar
potenciales candidatos a frmacos. Mltiples modelos de cribado
complementarios que implican mtodos in situ e in vivo tambin
deben utilizarse simultneamente en esta etapa para minimizar los
"falsos positivos" y los "falsos negativos" de entrar en el proceso
de desarrollo.
Las clulas Caco-2 y PAMPA son dos valiosas herramientas de
investigacin que actualmente son el mtodo de eleccin para la
seleccin de compuestos para la absorcin y potencial de
interaccin P-gp. A pesar de la popularidad y aceptabilidad de los
modelos de clulas PAMPA y Caco-2, es importante reconocer las
advertencias asociadas con estos modelos para realizar plenamente
su potencial. La estandarizacin de las variables experimentales
para desarrollar una metodologa "uniforme" es un primer paso
importante antes de la implementacin de estos modelos en el
modo de alto rendimiento. La calibracin de los modelos con
sondas de referencia apropiadas (frmacos comercializados
conocidos as como compuestos internos de investigacin) es
esencial para mantener la validez del modelo. Estos compuestos de
referencia deben cubrir un amplio espacio estructural y fsico-
qumico y deben cubrir un rango de solubilidad / permeabilidad.
Tambin se recomiendan otras sondas que representen el transporte
paracelular y de eflujo (P-gp). Estos compuestos de referencia
deben incluirse como controles de calidad establecidos en cada
ensayo realizado con compuestos desconocidos. Al igual que todos
los otros modelos in vitro, las clulas PAMPA y Caco-2 tienen
fortalezas y debilidades. Una comprensin completa de la razn
subyacente a las advertencias (como la baja recuperacin,
solubilidad, etc) asociados con estos modelos sin duda podra
ayudar a poner los resultados en las perspectivas adecuadas. Los
resultados obtenidos a partir de estos ensayos no deben
interpretarse aisladamente, sino que deben evaluarse
conjuntamente con las caractersticas de solubilidad y estabilidad
de los compuestos. Por ltimo, es importante darse cuenta de que
los modelos in vitro simplistas como las clulas PAMPA y Caco-2
son inadecuados para representar la complicada maquinaria de
absorcin en el tracto intestinal humano. En ltima instancia, es el
uso juicioso de estos modelos en combinacin con estudios in vivo
que mejoraran nuestra capacidad de predecir la disposicin del
frmaco en seres humanos y asegurar que slo los candidatos de
frmacos con un alto potencial de desarrollo sean movidos hacia
adelante en la tubera de desarrollo.