Practica No.

3: Coloraciones bacterianas

El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con
el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el
medio que la rodea. El modo ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de
colorantes.

3.1Logro de aprendizaje: Conoce las tcnicas para la coloracin de bacterias y su

importancia para su reconocimiento.

3.2 Marco terico

Si se desea simplemente aumentar el contraste de las clulas para la microscopa, son

suficientes los procedimientos que usan unos solo colorantes llamados de tincin simple.
Sin embargo, a menudo se utilizan mtodos que no tien de igual modo todas las clulas,
es el proceso denominado tincin diferencial. Uno muy usado en microbiologa es la tincin
Gram. Basndose en su reaccin a la tincin Gram, las bacteras pueden dividirse en dos
grupos: grampositivas y gramnegativas. Esta tincin tiene gran importancia en taxonoma
bacteriana ya que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas
bacterias. Mientras que las bacterias gramnegativas son constantes en su reaccin, los
microorganismos grampositivos pueden presentar respuestas variables en ciertas
condiciones (son gramlbiles). Por ejemplo, los cultivos viejos de algunas bacterias
grampositivas pierden la propiedad de retener el cristal violeta, y en consecuencia, se tien
por la safranina apareciendo como gramnegativas. Anlogo efecto se produce en
ocasiones por cambio en el medio del organismo, o por ligeras modificaciones en la
ejecucin de la tcnica. Por este motivo, es preciso atenerse, en la prctica, al
procedimiento establecido. Para explicar el mecanismo de la tincin de Gram se han
propuesto varias hiptesis fundadas en la naturaleza qumica de las paredes celulares de
los microorganismos. Aqu puedes ver las diferencias estructurales y qumicas de los dos
tipos de pared bacteriana:
 Reaccin y coloracin de las bacterias

Productos que
se utilizan

GRAM + GRAM -
1) Cristal Clulas color violeta Clulas color violeta
violeta
2) Lugol Se forma el complejo CV-I. Las clulas Se forma el complejo CV-I. Las
solucin continan teidas de color violeta. clulas continan teidas de color
violeta.
iodada
3) Alcohol Se deshidratan las paredes celulares. Eliminacin por extraccin de
Se contraen los poros. Disminuye la grasas de las paredes celulares.
permeabilidad. El complejo CV-I no sale Aumenta la porosidad. El
de las clulas que continan teidas de complejo CV-I se separa de la
color violeta. clula.

4) Safranina Clulas no decoloradas; quedan teidas Clulas decoloradas; se tien de

de color violeta. color rosado.

3.3. Materiales e Instrumentos

Reactivos para coloracin Gram

Mechero
Lminas porta-objeto
Hisopos estriles, papel toalla
Asa de siembra.

Otros materiales: lminas montadas de bacterias con coloracin Gram y Zeilh Neelsen.
Microscopios compuesto lente de 100x y accesorios de limpieza.
Aceite de inmersin
3.4 Procedimiento

1. Muestra de Sarro Dental en Agar Nutritivo

Extensin:
1. En el portaobjeto bien limpio (esterilizado con alcohol, papel de filtro y flameado) se coloc
una gota de agua destilada con ayuda del asa de siembra.
2. Con ayuda del asa de siembra, previamente esterilizada a la llama, se tom una colonia de
bacterias de nuestra muestra de sarro dental sembrado en agar nutritivo y con el asa se
extiende a la gota y las bacterias sobre el portaobjeto.
3. Finalmente se fija la extensin por el calor, calentando suavemente a la llama del mechero
hasta que se seque.
4. Luego pasamos a la coloracin de nuestra muestra siguiendo los pasos a continuacin.
Coloracin:
a) 1 minuto en cristal violeta (colorante inicial)
b) se lava con agua destilada
c) 1 minuto en lugol (mordiente)
d) se decolora con alcohol de 95
(decolorante)
e) se lava con agua destilada
f) 1 minuto en fucsina bsica (colorante de
contraste)
g) se lava con agua corriente
h) se seca suavemente y sin frotar con papel de
filtro

Una vez que nuestra preparacin est totalmente seca, ponemos una gota muy pequea
de aceite de cedro y observar al microscopio con el objetivo de inmersin.

Resultados

Con ayuda de nuestro microscopio observamos en nuestra muestra lo siguiente:

Bacterias Gram positivas (+) y Gram negativas (-)

 Cocos

Muestra de la Superficie de la Mesa de Laboratorio

1. En el portaobjeto bien limpio (esterilizado con alcohol, papel de filtro y flameado) se coloc
una gota de agua destilada con ayuda del asa de siembra.
2. Con ayuda del asa de siembra, previamente esterilizada a la llama, se tom una colonia de
bacterias de nuestra muestra de la superficie de la mesa de laboratorio y con el asa se
extiende a la gota y las bacterias sobre el portaobjeto.
3. Finalmente se fija la extensin por el calor, calentando suavemente a la llama del mechero
hasta que se seque.
4. Luego pasamos a la coloracin de nuestra muestra siguiendo los pasos a continuacin.

Coloracin:
a) 1 minuto en cristal violeta (colorante inicial)
b) se lava con agua destilada
c) 1 minuto en lugol (mordiente)
d) se decolora con alcohol de 95 (decolorante)
e) se lava con agua destilada
f) 1 minuto en fucsina bsica (colorante de contraste)
g) se lava con agua corriente
h) se seca suavemente y sin frotar con papel de filtro
Una vez que nuestra preparacin est totalmente seca, ponemos una gota muy pequea
de aceite de cedro y observar al microscopio con el objetivo de inmersin.

Resultados

Con ayuda de nuestro microscopio observamos en nuestra muestra lo siguiente:

Cocos negativos

Bacilos

3.5 Conclusiones
3.6 Cuestionario

1. Qu forma tienen las bacterias observadas?

Las bateras observadas tenian la forma de:

Cocos: son bacterias de forma esfrica, estas tienen la capacidad de vivir solas o
enlazarse hasta formar cadenas y estas pueden causar infecciones a la piel e
intoxicacin alimenticia.

Bacilos: Son bacterias caractersticas por su forma de barras o cilndricas, pueden

ser gram positivo o negativo, estas causan distintas enfermedades como la
tuberculosis.

2. Las bacterias aparecen aisladas o agrupadas? En caso de que aparezcan

agrupadas indicar el tipo de asociacin.

Las bacterias observadas en el experimento aparecen agrupadas

3. Qu tipo de Gram son las bacterias?

Hubo del tipo de GRAM (+) y GRAM (-)

4. Cul es la diferencia bacteriana para la tincin de Gram positiva y

negativas?

La diferencia es que las bacterias que quedan teidas de azul son Gram positivas
y bacterias teidas de rosa son Gram negativas (Para ver mejor las bacterias
Gram negativas se aplica otro colorante llamado fucsina, que dan un color rosa a
las bacterias.)

5. Por qu utilizar el mechero en el momento de la coloracin?

 Porque nos ayudara a secar el lquido que se qued en la laminay adems nos
ayudara a esterilizar el aza de siembra y evitar que se contaminen de otras
bacterias la placa Petri al momento de la colocacin de las colonias.

3.7 Recomendaciones

Debemos hacer uso de nuestros materiales para evitar contaminacin

(guantes, gorro, mascarilla, mandil)

El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo

por s solo tiene poca afinidad con las clulas.

La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin

las clulas Gram positivas.

EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso del

tiempo para obtener resultados satisfactorios.

Al momento de realizar nuestra fijacin, debemos tener en cuenta a hacerlo

cerca de un mechero para evitar mayor contaminacin.

Debemos esterilizar nuestra asa de siembra por cada procedimiento que

realicemos.
 Manipular cuidadosamente el microscopio. En el caso de usar el objetivo x100

debemos realizarlo utilizando el aceite de cedro en nuestra muestra.

Despus de utilizar el objetivo de inmersin debe limpiarse con alcohol.

3.8 Bibliografa

1. Murray, P. Microbiologa mdica. 6a. ed.Espaa: Elsevier; 2009.

2. Koneman, Allen et al. Diagnstico Microbiolgico. Texto y atlas en color. 6ta ed. Argentina:
Mdica Panamericana; 2008.
3. Tortora, G. Introduccin a la microbiologa. 9na. Ed. Editorial mdica Panamericana. 2007
4. Jawetz, E. Microbiologia Mdica. 23a ed. Mxico: El Manual Moderno; 2005.
5. Brooks, G. Microbiologa y Parasitologa. 23 a ed. Mxico: El Manual Moderno; 2005.