TEMA 18.

BIOTECNOLOGA

1. Qu es la Biotecnologa?
2. Microorganismos utilizados en Biotecnologa.
3. Principales tcnicas empleadas en Biotecnologa.
3.1 Tecnologa del ADN recombinante o clonacin gnica.
3.2 Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).
3.3 Mtodo de secuenciacin de Sanger.

1. QU ES LA BIOTECNOLOGA?

Aunque con el trmino Biotecnologa se designa un conjunto de tcnicas surgidas hace poco ms
de dos dcadas, no se trata en realidad de algo nuevo: desde hace siglos, los seres humanos han
utilizado, aun sin saberlo, procesos biotecnolgicos en la elaboracin del pan, el vino, el queso y la
cerveza.

En sentido amplio, la Biotecnologa consiste en la utilizacin de seres vivos (microorganismos,

clulas animales y vegetales) para obtener o modificar un producto, o mejorar una variedad de planta o
especie animal, todo ello con fines industriales.

Como se puede deducir de la definicin, la Biotecnologa depende de la Ingeniera Gentica,

ciencia que se ocupa del conjunto de tcnicas que permiten manipular el genoma de un ser vivo. Esta
manipulacin consiste en: introducir nuevos genes en un genoma, eliminar genes ya existentes en un
genoma o modificar la informacin contenida en un gen determinado.

En la actualidad, la palabra biotecnologa se identifica, frecuentemente, con la aplicacin

industrial de la ingeniera gentica, que utiliza microorganismos modificados genticamente para producir
compuestos de gran inters para el hombre, como la insulina humana, la hormona del crecimiento
humana, interfern, vacunas, enzimas, antibiticos, etc. As mismo, la manipulacin del genoma de
organismos superiores ha hecho posible la creacin de especies de animales y vegetales transgnicos,
para mejorar o aumentar la productividad agrcola o ganadera.

2. MICROORGANISMOS UTILIZADOS EN BIOTECNOLOGA.

Los procesos industriales que utilizan los microorganismos como base para la obtencin de
productos comerciales tiles para el hombre, constituyen la llamada Microbiologa Industrial o
Biotecnologa Microbiana.

La Microbiologa Industrial tradicional emplea los microorganismos, tal y como se encuentran en

la naturaleza, para transformar algunas molculas en otras que tienen ms utilidad, como son los
productos de la fermentacin que llevan a cabo algunos microorganismos; para la obtencin de vacunas,
...

Los microorganismos que sintetizan productos tiles para nuestra especie son varios centenares
de especies de entre las ms de 100.000 que existen en la naturaleza.

Se pueden distinguir tres grupos de microorganismos de inters industrial: las bacterias, las
levaduras y los mohos. En la siguiente tabla aparecen algunos de estos microorganismos, junto con los
productos industriales obtenidos gracias a ellos.

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Biologa. Biotecnologa 1
 MICROORGANISMOS PRODUCTO

Saccharomyces cerevisiae (L) Pan , cerveza, vino, etanol, bebidas destiladas (ron, brandy, whisky, ...)

Streptococcus termophilus (B) Yogur

Lactobacillus bulgaricus (B) Yogur

Penicillium chrysogenum (M) Penicilinas

Otros antibiticos (estreptomicina, cloranfenicol, eritromicina y
Streptomyces sp. (B) tetraciclina)

Escherichia coli (B) Insulina, somatotropina (hormona del crecimiento)

Bacillus thuringiensis (B) Insecticidas

L= levadura, B= bacteria, M= moho

3. PRINCIPALES TCNICAS UTILIZADAS EN BIOTECNOLOGA.

3.1 TECNOLOGA DEL ADN RECOMBINANTE O CLONACIN GNICA.

La Ingeniera Gentica ha desarrollado una serie de tcnicas que permiten introducir material
gentico forneo en el interior de las clulas. A estas tcnicas se les ha dado diferentes nombres como
tecnologa del ADN recombinante (ya que se obtiene una combinacin de segmentos de ADN que no
se encuentran juntos de manera natural), manipulacin gentica y clonacin gnica.

Gracias a estas tcnicas se han obtenido, mediante microorganismos manipulados

genticamente, productos de gran inters para el hombre. Ejemplo bien conocido es la transferencia del
gen de la insulina humana a la bacteria Escherichia coli o el de la hormona del crecimiento humana.

Desde hace tiempo se sabe que la transferencia de material gentico entre clulas se produce en
la naturaleza entre algunas bacterias, proceso denominado transformacin, pero para que sea operativo
debe ocurrir entre bacterias de la misma especie y el material gentico ha de integrarse en el cromosoma
bacteriano.

Para realizar la transferencia de forma artificial, as como para su anlisis, se han desarrollado
unas tcnicas de ingeniera gentica. En esencia son las siguientes:

1. Obtencin del fragmento de ADN que contiene el gen que se quiere clonar.
2. Insercin de dicho fragmento en una molcula de ADN apropiada, que sirve como vehculo o
vector de clonacin.
3. Introduccin del vector de clonacin con el gen de inters en una clula de otro organismo
diferente, a la que se denomina clula hospedadora. O lo que es lo mismo, transformacin
de clulas mediante vectores.
4. Deteccin y seleccin del gen clonado.

- Fragmentacin del ADN.

El ADN de cualquier organismo puede ser cortado en fragmentos lo suficientemente cortos para
ser analizados y manipulados, gracias a las enzimas de restriccin o restrictasas. Estas enzimas son
endonucleasas presentes en muchas bacterias, y que tienen la propiedad de cortar el ADN extrao que
penetra en ellas. Lo cortan por sitios especficos dentro de la secuencia de reconocimiento, formada
por 4 pares de bases, que, en la bacteria original, estn protegidas (por metilacin de algunas bases)
para evitar que se destruya su propio ADN.
Estas enzimas, que actan como autnticas "tijeras biolgicas", cortan el ADN de forma que en
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Biologa. Biotecnologa 2
cada extremo queda un trozo de hebra monocatenaria formado por las bases de la secuencia de
reconocimiento (no todas las enzimas cortan de esta manera). Estos extremos se denominan cohesivos
o "pegajosos", ya que es por ellos por donde se pueden unir otros fragmentos de ADN cortados por la
misma enzima de restriccin, al ser sus bases complementarias.

Por ltimo, los fragmentos obtenidos se pueden separar por tamaos (segn el nmero de pares
de nucletidos que llevan) mediante electroforesis sobre geles.

Con esta tcnica, la mezcla de fragmentos de ADN se mueven sobre un gel, en el que hay un
campo elctrico, de manera que los fragmentos ms grandes se mueven ms lentamente.

Posteriormente se cortan las bandas de gel y se ponen en distintas soluciones, consiguiendo as

la separacin de los distintos fragmentos.

Lgicamente antes de fragmentar el ADN habr que obtener ste de la clula. Esto se puede
hacer de dos maneras:

Obtencin del ADN de una clula procariota.

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Biologa. Biotecnologa 3
 Se utiliza este procedimiento cuando el gen que se desea clonar procede de una clula
procariota, que no contiene intrones.
Para obtener el ADN de un extracto celular (resultado de romper un conjunto de clulas), se
aplica un tratamiento con alcohol. Las molculas de ADN se unen entre s formando unos
agregados que se enrollan fcilmente en una varilla de vidrio.
Posteriormente, las grandes molculas de ADN se pueden obtener puras mediante una
centrifugacin, debido a su elevada densidad.

Obtencin de un ADN complementario del ARN mensajero (ADNc).

Este procedimiento se utiliza para clonar genes procedentes de clulas eucariotas, cuyo
ADN contiene intrones (algunos genes tienen ms de 50 intrones, informacin gentica no
codificante).
En general, el tejido donde se exprese un determinado gen suele contener gran cantidad del
correspondiente ARNm (por ejemplo en el pncreas se encuentra mucho ARNm de la
insulina). El ARNm aislado sirve de molde para producir ADN complementario mediante el
proceso de transcripcin inversa dirigido por la transcriptasa inversa o retrotranscriptasa.
Pero para ello se necesita un cebador, en este caso es un oligonucletido-T, ya que las
molculas de ARNm eucaritico contienen una cola poli A en el extremo 3'.
En una primera etapa se forma una molcula hbrida constituida por una cadena de ARN y
otra de ADN. Despus la cadena de ADN forma una especie de lazo que hace de cebador
para la otra cadena de ADN.

- Insercin del fragmento de ADN en un vector de clonacin.

Una vez obtenido el fragmento de ADN con el gen elegido, debe unirse a un vector de clonacin
antes de introducirlo en la clula hospedadora.

Los vectores de clonacin son pequeas molculas de ADN, generalmente circulares, que tienen
capacidad para autorreplicarse dentro de las clulas hospedadoras, independientemente de los
cromosomas de stas. Los vectores de clonacin ms empleados son: plsmidos, virus bacterifagos y
csmidos (vectores sintticos, que combinan caractersticas de plsmidos y de fagos).

Lo que se hace para insertar el fragmento de ADN, que contiene el gen de inters, en un vector
de clonacin, es cortar con la misma enzima de restriccin, tanto el ADN que se desea insertar, como el
ADN del vector, con el fin de que ambos presenten extremos cohesivos capaces de unirse.

La unin se realiza por medio de otras enzimas, denominadas ADN ligasas, que sellan la unin
formando enlaces covalentes entre bases nitrogenadas adyacentes. El resultado es una molcula de
ADN recombinante, que contiene fragmentos de ADN de distinta procedencia.

- Introduccin del ADN recombinante en clulas hospedadoras.

Una vez obtenida la molcula de ADN recombinante, es necesario introducirla en una clula
hospedadora para que se replique dando nuevas copias y para que el gen de inters pueda expresarse y
producir protenas.

Escherichia coli es el organismo ms utilizado con este fin. Pero, incluso con las mejores tcnicas
slo un pequeo nmero de bacterias capta realmente el ADN. Por esa razn es necesario disponer de
algn mtodo para seleccionar las clulas que se han transformado. Lo que se suele hacer es marcar
selectivamente los vectores usados, es decir, aadirles genes que les proporcionen caractersticas
fcilmente identificables. Por ejemplo genes que les den resistencia a uno o ms antibiticos y que les
capacita para crecer en un medio con dicho antibitico.

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Biologa. Biotecnologa 4
- Deteccin y seleccin de clulas con ADN clonado.

Algunas veces los genes clonados se expresan en la clula hospedadora, esto ocurre cuando la
maquinaria de transcripcin y traduccin es semejante a la de la clula de la que procede. En este caso,
se detecta directamente la protena producto del gen de inters.

Sin embargo, en otros casos, el producto del gen clonado no se puede detectar tan fcilmente,
por lo que se recurre a otros mtodos:
Como ya se ha mencionado, adems del gen clonado, el vector de clonacin lleva
tambin otro gen, de fcil deteccin fenotpica, al que se denomina gen marcador.
En otros casos, el gen se detecta mediante una sonda, que consiste en una cadena de
ADN, complementaria de una de las hebras de ADN del gen clonado, marcada
radiactivamente.
Esta cadena hibridar con el gen clonado, revelando su presencia por autorradiografa.
Otro mtodo empleado consiste en la utilizacin de anticuerpos especficos para la
protena codificada por el gen.

3.2 REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR).

En los trabajos de Biotecnologa se necesitan mltiples copias de un determinado fragmento de

ADN para poder manipularlas. Para conseguirlo se utilizan dos mtodos:
- La clonacin gnica o tecnologa del ADN recombinante (que acabamos de ver)
- La reaccin en cadena de la polimerasa o PCR (Poymerase Chain Reaction).

Gracias a la PCR se pueden replicar pequeos fragmentos de ADN "in vitro" (sin necesidad de
utilizar clulas vivas), a una velocidad muy superior a la lograda mediante clonacin. Esta tcnica es
capaz de generar 100.000 millones de molculas idnticas en una tarde, a partir de una sola molcula de
ADN. Este ADN puede proceder de una muestra de un tejido de un hospital, de un cabello humano, de
una gota de sangre o de semen en la escena del delito, de tejido de cerebro momificado o de un mamut
muerto hace 40.000 aos y conservado enterrado en el hielo.
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Biologa. Biotecnologa 5
 La tcnica de la PCR es la siguiente. En primer lugar, se disean dos oligonucletidos sintticos
(de 18 a 30 nucletidos). Sus secuencias han de ser complementarias a los dos extremos 3' de la regin
de ADN que se quiere amplificar. Estos oligonucletidos se utilizarn como cebadores para la replicacin
de cada hebra de ADN.

Por esta razn no se puede amplificar una regin de ADN si no se conoce la secuencias de sus
dos extremos.

La PCR se lleva a cabo en 3 etapas:

1. Desnaturalizacin. El fragmento de ADN que se desea replicar se desnaturaliza para

separar las dos hebras de la doble hlice. Esto se consigue calentando el ADN a
temperaturas elevadas, entre 68 y 95 C.
2. Templado o hibridacin. A continuacin se lleva a cabo un enfriamiento rpido (entre 37 y
65C) que permite la hibridacin de cada hebra con un oligonucletido (cebador).
3. Elongacin o replicacin. Etapa en la que la ADN polimerasa elonga los cebadores,
empleando como molde ambas hebras originales. La replicacin transcurre en sentido 5'3'
a partir del extremo 3' de cada cebador, empleando como sustrato los 4 dNTPs, hasta
terminar la lectura del molde o hasta que comience una nueva etapa de desnaturalizacin
(siguiente ciclo).

Las tres etapas que se acaban de describir constituyen un ciclo de sntesis y dura unos 5
minutos.
Para conseguir una amplificacin til se requiere una sucesin de ciclos de desnaturalizacin,
hibridacin y replicacin (entre 20 y 40). Con 20 ciclos se consiguen un milln de copias. Hoy en da se
realiza de forma automtica mediante instrumentos especializados (termocicladores).

Cuando la PCR se emple por primera vez, la ADN polimerasa utilizada en el proceso se obtena
de E. coli. Pero debido a la elevada temperatura para lograr la desnaturalizacin del ADN bicatenario, la
enzima se desnaturalizaba tambin y era preciso aadirla de nuevo en cada ciclo, lo que encareca el
proceso. El problema se resolvi utilizando la ADN polimerasa de Thermus aquaticus, una bacteria
termfila que vive en aguas termales, por lo que todas sus enzimas, incluidas las ADN polimerasas, son
funcionales a temperaturas muy elevadas.

La ADN polimerasa de esta bacteria, conocida como Taq polimerasa, es estable hasta 95 C.

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3.3 MTODO DE SECUENCIACIN DE SANGER.

Otra tcnica propia de la Ingeniera Gentica es la determinacin de la secuencia de nucletidos

de un ADN. Hasta los aos 70 era difcil y costoso secuenciar incluso fragmentos de slo 5 a 10
nucletidos. Primero fue el mtodo qumico de Maxan y Gilbert (1977), y despus el mtodo enzimtico
de Sanger (1980), los que abrieron camino a este gran objetivo.

Estos dos mtodos pioneros de la secuenciacin tienen en comn algunos aspectos, como la
utilizacin de fragmentos del ADN original cortados con enzimas de restriccin, el marcaje del ADN de
forma radiactiva o qumica (compuestos fluorescentes), el empleo de mtodos electroforticos para
separar los fragmentos generados, etc.
Con frecuencia, las muestras se amplifican por PCR para disponer de suficiente cantidad.

Actualmente el mtodo qumico de secuenciacin ha sido desplazado por el enzimtico, de ah

que slo estudiemos este ltimo.

MTODO DE SECUENCIACION DE SANGER.

Se denomina tambin secuenciacin didesoxi, por ser necesarios didesoxirribonucletidos.

Los didesoxirribonucletidos (ddNTP) son compuestos similares a los 2'-desoxinucletidos, pero

que tambin han perdido el grupo -OH del carbono 3', en su lugar tienen un grupo -H. Debido a esta
caracterstica, cuando la ADN polimerasa incorpora un 2'-3'-didesoxirribonucletido a la cadena de ADN,
sta ya no puede crecer puesto que carece del grupo -OH en posicin 3', necesario para la formacin del
enlace fosfodister con el siguiente nucletido. Por lo tanto la incorporacin de un ddNTP implica la
terminacin de la cadena.

En este mtodo de secuenciacin podemos distinguir 3 fases: sntesis enzimtica, separacin y

anlisis de los fragmentos y automatizacin.

- Sntesis de un ADN complementario de longitud variable.

Se parte de una hebra sencilla del ADN que se quiere secuenciar. Se aade un cebador,
marcado radiactivamente, que hibride con el extremo 3' de la zona que se quiere secuenciar.

Esta mezcla se coloca en 4 tubos de ensayo, a cada uno de ellos se le aaden los 4 tipos de
nucletidos (dNTPs) necesarios para la sntesis de la nueva hebra de ADN. Adems a cada tubo se
aade uno solo de los didesoxirribonucletidos (ddNTP) terminadores de cadena, en una proporcin* bien
definida entre ste y el desoxirribonucletido correspondiente.

Al aadir a los tubos la ADN polimerasa, comienza la polimerizacin a partir del cebador, pero
cesa al incorporarse un ddNTP. Por ejemplo en el tubo 1, existe ddATP que se incorporar a las cadenas
que se estn sintetizando, y las bloquear. En consecuencia, todas las cadenas nuevas contenidas en
este tubo, comenzarn con el cebador en 5' y terminarn en 3' con el mismo nucletido, en este caso el
ddATP. De igual manera, en el tubo 2 (ddTTP) las cadenas terminarn aleatoriamente en G, el tubo 3 lo
harn en C y en el 4, en G.

* Se usa una cantidad baja de ddNTP, de esta manera se consigue que la interrupcin de la sntesis por la
incorporacin del didesoxirribonucletido tenga lugar no inmediatamente sino a una cierta distancia, variable
aleatoriamente, del cebador.

- Separacin de los fragmentos y anlisis.

A continuacin, el ADN de cada tubo se desnaturaliza, para liberar as la cadena recin

sintetizada, que adems ser radiactiva, ya que se han utilizado nucletidos marcados radiactivamente.

Las muestras de cada tubo son depositadas en un gel de poliacrilamida para separar los
fragmentos en funcin de su tamao (mediante electroforesis) y, finalmente las posiciones de las bandas
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son reveladas por autorradiografa. La sucesin de bandas de cada una de las 4 reacciones,
comparndolas entre s, dan la secuencia del ADN.

Al examinar la secuencia de la figura puede verse que el primer nucletido aadido es G, el

segundo sera C, ...

- Automatizacin.

Han ido surgiendo distintas variantes del mtodo inicial de Sanger, en lo referente al tipo y lugar
de marcaje de los nucletidos, especialmente el aparecer los fluorocromos como alternativa a los
istopos radiactivos.

El usar un fluorocromo distinto en cada una de las cuatro reacciones de sntesis permite
automatizar el mtodo, de forma que "lean" simultneamente las hebras marcadas de las cuatro mezclas.

ACTIVIDADES
1.- Qu es la clonacin gnica?

2.- Qu funcin tienen las endonucleasas de restriccin? Qu utilidades se derivan de la misma?

3.- Dada la secuencia de ADN siguiente:

...A T G C G A A T T C C C G C C A G G T T A T G C A A T T C A T G...
...T A C G C T T A A G G G C G C T C C A A T A C G T T A A G T A C...
Cuntos y cules seran los fragmentos que originara si se corta con la restrictasa EcoRI?

4.- Dado el siguiente fragmento de ARNm:

...U U A C G U U A A G C U A U A G...

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 a) Cul sera el ADN formado por retrotranscripcin o ADN complementario (ADNc)?
b) Sera cortado por la restrictasa EcoRI? En caso afirmativo indica que fragmentos
originara ?

5.- Qu entiendes por ADN recombinante?

6.- Qu es un vector en Ingeniera Gentica? Cules son los principales vectores empleados?

7.- Por qu se utiliza la transcriptasa inversa para introducir genes de clulas eucariotas en clulas
procariotas?

8.- Las reacciones de secuenciacin de un fragmento de ADN segn el mtodo de Sanger son las que
se indican en el dibujo

Realiza la secuenciacin del

fragmento en cuestin

9.- Por qu al situarse un

didesoxinucletido en la
cadena de replicacin se
paraliza la actividad de la
ADN-polimerasa?
ACTIVIDADES P.A.U.

10.- Defina el concepto de biotecnologa y describa una aplicacin de la misma en la que intervengan
bacterias. (Opcin A)

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