Identificacin de la sangre:

12.1. Propiedades biolgicas:

La sangre constituye aproximadamente el 8% del peso en el cuerpo de un humano sano. El plasma es la
porcin fluida de la sangre. La porcin celular de la misma est conformada por glbulos rojos, glbulos
blancos y plaquetas, todas las cuales se encuentran suspendidas en el plasma. (Figuas 12.1 y 12.2).
12.1.1. Glbulos Rojos:
Estas clulas son llamadas tambin eritrocitos. Su perodo de vida en los humanos es de 3 a 4 meses
aproximadamente. En adicin, los eritrocitos humanos maduros no tienen ncleo celular y, por lo tanto,
carecen de ADN nuclear. Los glbulos rojos estn formados por hemoglobina protena que es responsable
del transporte del oxgeno-. La mayora de la hemoglobina adulta est conformada por ciatro cadenas
polipptidas, dos de ellas y las otras . De este modo, la hemoglobina adulta es designada como 22.
Otras formas de hemoglobina sern discutidas en el captulo 18. Bajo condiciones fisiolgicas normales,
cada subunidad de hemoglobina contiene una hemofraccin que se ata al oxgeno (Figura 12.3). Una hemo
molcula est constituida por un componente orgnico conocido como protoporfirina y un ion de hierro
ferroso (Fe2+) (Figura 12.4), una hemo molcula tambin conocida como ferroprotoporfirina. El ion ferroso
del hemo, forma cuatro enlaces con los nitrgenos de la protoporfirina IX, en adicin con un quinto enlace
con una cadena de hemoglobina y un sexto con una molcula de oxgeno O2. Otras sustancias qumicas
como el monxido de carbono y el cianuro tambin se conectan al hierro ferroso de la hemo molcula y
pueden causar asfixia qumica. Los hemo grupos pueden tambin estar presentes en la sangre de diversos
animales y en protenas como mioglobina en los msculos y neuroglobina en el cerebro.
12.1.2. Glbulos Blancos:
Tambin son llamados leucocitos, los glbulos blancos estn subdivididos en tres tipos: granulocitos,
linfocitos y monocitos. Estn involucrados en defender al cuerpo en contra de infecciones. Tienen ncleo
y, por tanto, representan la principal fuente de ADN nuclear de la sangre.
12.2.3. Plaquetas:
Estas clulas tambin son conocidas cono trombocitos, y juegan un papen fundamental en la coagulacin
sangunea. Se congregan en sitios con lesiones vasculares y de los vasos sanguneos. Como los eritrocitos,
carecen de ncleo celular.
Figura 12.1. Composicin bsica de la sangre. La sangre puede ser separada en dos fases bajo la presencia
de un anticoagulante. La porcin lquida, llamada plasma, recoge aproximadamente un 55% del volumen
en la sangre. Los elementos celulares incluyen eritrocitos, leucocitos y plaquetas. ( Richard C. Li).

Figura 12.2. Clulas sanguneas. ( Richard C. Li).

12.2. Pruebas presuntivas para identificacin.
12.2.1. Mecanismos de las pruebas presuntivas: Los anlisis de sangre estn diseados para detectar
trazas de sangre. Estos ensayos estn basados en el principio bsico de oxidacin reaccin de reduccin
catalizada por la hemofraccin de la hemogloblina-. Como resultado, los sustratos incoloros catalizados
por hemo pasan por una reaccin de oxidacin causando quimilumniscencia, fluorescencia o cambio de
color. Son muy sensibles y pueden detectar sangre en muestras con 10-5-10-6 diluciones decimales. Una
reaccin positiva indica la posibilidad de presencia de sangre. Adicionalmente, la mayora de ellos no
interfieren con anlisis forenses de ADN.
Figura 12.3. Hemoglobina adulta humana. Cuadro subunidades. Son mostradas dos cadenas y dos .
Cada subunidad de hemoglobina contiene una hemofraccin. ( Richard C. Li).

Figura 12.4. Las estructuras qumicas de hemo, su precursor y derivados. (a) Protporfirina IX. (b) Heme
(ferroprotoporfirina). (c) Hemocromgeno, R=Piridina (piridinaferroprotoporfirina). (d) Hidrxido de
Hematina, R=OH (Hidrxido de ferroprotoporfirina); cloruro de hematina, R=CI (cloruro de
ferroprotoporfirina).
12.2.1.1. Reacciones de oxidacin-reduccin:
Una reaccin de oxidacin-reduccin involucra un cambio en el estado de oxidacin de la molcula.
Especficamente, la oxidacin de una molcula significa que ha perdido electrones y, la reduccin de una
molcula significa que los ha ganado. Las sustancias qumicas que pueden ser reducidas y, por tanto, ganar
electrones de otras molculas son llamados oxidantes. En contraste, los reductores son sustancias que
pueden ser oxidadas y por consiguiente pierden electrones a otras molculas. En reacciones bioqumicas,
la oxidacin a menudo coincide con la prdida de hidrgeno. La Figura 12.5 representa un ejemplo de una
reaccin de oxidacin-reduccin para identificacin sangunea. En estas pruebas, heme es utilizada como
el catalizador, y el perxido de hidrgeno es usado como el oxidante para la reaccin. En la presencia de
heme, un sustrato incoloro es oxidado, produciendo un producto con color, quimiluminiscencia o
flourescencia.
12.2. Pruebas Colorimtricos:
12.2.2.1. Prueba de Fenolftalena: La fenolftalena, un miembro del grupo de los indicadores y las tintas,
es usada en valoraciones de minerales y cidos orgnicos como la mayora de los lcalis. La prueba de la
fenolftalena para la identificacin sangunea es tambin conocida como la prueba Kastle-Meyer. Kastle
public un estudio en 1901, presentando los resultados de una reaccin en la cual la fenolftalena, un
compuesto incoloro, es catalizado por heme con perxido de hidrgeno como el oxidante (Figures 12.6 y
12.7). El resultado derivado es la fenolftalena que aparece como rosada bajo condiciones alcalinas.
12.2.2.2. Prueba de Verde de leucomalaquita (LMG): El verde malaquita es un tinte trifenilmetano. La
forma leuco base del verde malaquita es incoloro y puede ser oxidado por la catlisis de heme para
producir un color verde. La reaccin es llevada a cabo bajo condiciones cidas con perxido de hidrgeno
como el oxidante (Figuras12.8 y 12.9).
12.2.2.3. Bencidina y sus derivados: Histricamente, la bencidina ha sido usada en la fabricacin de tintes
(Figura 12.10). En consecuencia, fue utilizada como una prueba para la presencia de la sangre luego del
descubrimiento de que la oxidacin de la bencidina puede ser catalizada por heme y producir un color que
vara del azul al azul oscuro (en soluciones cidas). Dado que el color azul puede eventualmente tornarse
caf la reaccin debe ser leda inmediatamente.

Figura 12.5. Reaccin de oxidacin reduccin como la base para las pruebas de identificacin sangunea.
Sustrato AH2; A, sustrato oxidado.

Figura 12.6. Reaccin qumica de una prueba de fenolftalena.

Figura 12.7. Fotografa de los resultados de las pruebas de fenolftalena. Reaccin negativa (izquierda) y
positiva (derecha). ( Richard C. Li).

Figura 12.8. Reaccin qumica de la prueba de Verde malaquita.

Figura 12.9. Fotografa de los resultados de la prueba de verde malaquita. Reaccin negativa (izquierda)
y positiva (derecha). ( Richard C. Li).
 Figura 12.10. Estructuras qumicas de la bencidina y sus derivados: (a) bencidina; (b) Ortotolidina; (c)
Tetrametilbencidina.
La bencidina fue catalogada como cancergena y por consiguiente, ya no es usada para anlisis forence. La
ortotolidina es un dimetil derivado de la bencidina. Su oxidacin puede ser catalizada por heme al producir
una reaccin de color azul bajo condiciones cidas. (Figura 12.11). Tambin es considerada como un
cancergeno potencial basados en estudios en animales, y, por esta razn, ha sido reemplazada por la
tetrametilbencidina que es un tetrametil derivado de la bencidina. La oxidacin de TMB puede ser
catalizada por heme al producir un color verde a azul-verde en condiciones cidas y an sigue siendo
utilizado. El kit de pruebas Hemastix (Laboratorios Miles) es un test basado en el TMB que utiliza un
dispositivo que contiene lneas de TMB. Un test es llevado a cabo aplicando una muestra humedecida a
una lnea de Hemastix. La aparicin de un color verde o verde-azul indica la presencia de sangre.
12.2.3. Quimiluminiscencia y pruebas de fluorescencia:
Otros compuestos orgnicos cuya oxidacin tiene productos con propiedades quimiluminiscentes o
flourescentes son utilizados para la aplicacin de pruebas. En las pruebas quimiluminiscentes, la luz es
emitida como producto de una reaccin qumica. En esta categora, el luminol produce quimiluscencia
cuando la sangre est presente. En contraste, una prueba de fluorescencia requiere la exposicin a un
producto oxidado como la fluoroscena a una longitud de onda particular de una exitacin por parte de
una fuente de luz. Entonces, la fluorescencia es emitida a longitudes mayores que las de la fuente de luz.
Una de las ventajas de los reactivos quimiluminiscentes y fluorescentes es que pueden ser rociados sobre
largas reas donde las manchas de sangre estn potencialmente localizadas. Una reaccin positiva
identifica la sangre y puede revelar patrones de impresiones sangrientas como pisadas o huellas digitales.
Estos mtodos son muy sensibles y pueden determinar los lugares de incluso pequeas trazas de sangre.
Adicionalmente, son tiles para detectar sangre en escenas del crimen que han sido limpiadas y no
muestran teido visible. Una de las desventajas de los reactivos quimiluminiscentes y fluorescentes son
las precauciones que deben tomarse si las manchas son muy pequeas o han sido lavadas.
Figura 12.11. Reaccin
qumica de la prueba de
ortotolidina.
El rociado de reactivos de pruebas puede disolver una muestra y por tanto llevar a dificultades en el
aislamiento de suficientes cantidades de ADN para anlisis forenses.
12.2.3.1. Luminol (3-Aminophthalhydrazide)1:
El luminol es usado usualmente como reactivo quimiluminiscente. La reaccin de oxidacin del luminol es
catalizada por heme produciendo luz en la presencia de un oxidante (Figuras 12.12 hasta la 12.14.). La luz
emitida de una reaccin positiva puede ser visualizada slo en la oscuridad, lo que limita las aplicaciones
del luminol. La documentacin fotogrfica de un patrn aumentado por el luminol debe hacerse
inmediatamente antes de que desaparezca.
Figura 12.12. Reaccin
qumica de una prueba de
luminol.

Figura 12.13. Resultados obtenidos de la prueba de una gota de sangre en un platillo de vidrio con luminol.
De izquierda a derecha: gota de sangre luego de ser rociada con luminol; gota de sangre luego de ser
rociada con luminol y vista en la oscuridad. Una quimiluminiscencia azul indica la presencia de sangre. (De
Bergervoet, P.W., et al., J Hosp Infect, 68, 329-33. Con permiso).

1
No se logr encontrar una traduccin para esta sustancia.
Figura 12.14. Deteccin de manchas de sangre latentes en un piso con luminol. Izquierda: Con la luz
encendida; derecha: inmediatamente despus de apagar las luces. Una quimiluminiscencia azul indica la
presencia de trazas de sangre. (De Bergervoet, P.W., et al., J Hosp Infect, 68, 329-33. Con permiso).
12.2.3.2. Fluorescina: Es otro reactivo qumico que es usado para evaluar la presencia de manchas de
sangre en una escena del crimen (Figuras 12.15. y 12.16.). Cuando es oxidado y catalizado por heme, la
fluorescina demuestra propiedades fluorescentes. Usualmente, las manchas rociadas con esta sustancia
son expuestas a la luz en el rango de 425-485 nm usando un dispositivo de luz alternativo. En una reaccin
positiva, la fluorescina oxidada emite una luz intensa amarillenta-verde, lo que indica la presencia de trazas
de sangre. La luz emitida de las manchas rociadas con fluorescina dura ms que la del luminol.
12.2.4 Factores que afectan los resultados de las pruebas presuntivas:
Las pruebas catalticas discutidas en las secciones anteriores no son especficas slo para la sangre, lo que
puede llevar a la observacin de falsos positivos o falsos negativos (Figura 12.17.).
12.2.4.1. Oxidantes: Las sustancias que son fuertes oxidantes pueden causar una reaccin de falso
positivo. stas pueden catalizar la reaccin de oxidacin incluso en la ausencia de heme y resultar en
reacciones falso positivas. Algunas sales de metal, como las de cobre y nquel, blanqueadores hogareos
y limpiadores que contengan iones de hipoclorito y productos de tinte de cabello que tengan perxido de
hidrgeno, trabajan como oxidantes. Para afrontar este problema, una prueba cataltica de dos pasos debe
ser realizada.
Figura 12.15. Estructura qumica de la fluorescina.

Figura 12.16. Deteccin de

manchas de sangre diluidas
en algodn negro con
fluorescina (izquierda) y
Bluestar (derecha). (De
Finnis, J., y Davidson, A., Sci
Justice, 53, 178-186, 2013.
Con permiso).

Figure 12.17. Factores que afectan los resultados de las pruebas. Fuertes oxidantes y peroxidasa pueden
causar falsos positivos; los reductores, falsos negativos.
El sustrato es aplicado primero a la muestra en cuestin. Un cambio de color que ocurra antes de la adicin
de perxido de hidrgeno indica un falso positivo debido a un posible oxidante en la muestra. Si el cambio
de color es observado despus de la adicin del perxido de hidrgeno, el resultado es un real positivo.
12.2.4.2. Plantas peroxidasas: Muchos tipos de plantas como el rbano picante contienen peroxidasas.
Las peroxidasas vegetales pueden tambin catalizar las reacciones de oxidacin y llevar a falsos positivos.
Sin embargo, usualmente son sensibles al calor y pueden ser activadas por altas temperaturas. Dado que
la molcula hemo es relativamente estable a altas temperaturas, las muestras pueden ser reevaluadas
luego de calentarlas. Esto inactivar cualquier peroxidasa vegetal en la muestras.
12.2.4.3. Reductores: Aunque no son comunes, un falso negativo puede ocurrir cuando un reductor fuerte
est presente en una muestra. Fuertes reductores tales como iones de metal, incluidos el litio y el zinc,
pueden inhibir la reaccin de oxidacin.
12.3. Pruebas confirmativas para identificacin:
12.3.1. Pruebas de microcristales:
Las pruebas de microcristales aplican sustancias para tratar las manchas de sangre, formando cristales de
hemo molculas. Las morfologas de los cristales resultates son distintivas para heme y pueden ser
comparadas con un estndar conocido usando un microscopio. Una prueba de microcristal positiva indica
fuertemente la presencia de sangre. Sin embargo, las pruebas confirmativas no son tan sensibles como las
presuntivas. Adicionalmente, estas pruebas no pueden distinguir entre sangre humana y animal.
12.3.1.1. Prueba de Cristal hemocromgenas: Los hemocromgenos son derivados de heme en los cuales
su hierro ferroso forma dos enlaces con bases de nitrgeno (Figura 12.4.). El mtodo para formar cristales
hemocromgenos fue documentado en 1864. Desde entonces, se han reportado variadas modificaciones.
La prueba del cristal de Takayama, publicada en 1912, ha sido el mtodo preferido por muchos
laboratorios forenses. Una mancha de sangre es tratada con piridina y glucosa (una azcar reductora que
es capaz de producir iones frricos) bajo condiciones alcalinas para formar cristales de piridina
ferroprotoporfirina (Figura 12.18.).

Figura 12.18. Pruebas de microcristal usando el mtodo Takayama. (Richard C. Li.)

Figura 12.19. Pruebas de microcristal usando el mtodo Teichman. (De James, S.H., Nordby, J.J., y Bell, S.,
Forensic Science: An introduction to Scientific and Investigative Techniques, 4ta edicin, CRC Press, Boca
Raton, 2014. Con permiso).
12.3.1.2. Prueba de cristal hemtico: Esta prueba tambin es conocida como la prueba de cristal
Teichmann. En 1853, Teichmann document un mtodo de formacin de cristales de muestras de sangre.
Cuando las muestras eran tratadas con cido actico glacial y sales y, subsecuentemente, calentado, el
cloruro de hematina (Cloruro de ferriprotoporfirina), un cristal prismtico de color caf, es formado (Figura
12.19). La hematina (Figura 12.4), es un derivado de heme; su hierro est en el estado frrico (Fe+3). Esta
prueba tiene una sensibilidad y especificidad similares a las pruebas hemocromgenas. Las pruebas de
hematina tienen la ventaja de ser ms confiables que las hemocromgenas para muestras de sangre
envejecidas.
12.3.2. Otras muestras:
Tcnicas adicionales pueden ser utilizadas para confirmar la presencia de hemoglobina. Por ejemplo, los
mtodos cromatogrficos y electroforticos pueden identificar hemoglobina a travs de sus caractersticas
de movilidad. Los mtodos espectrofotomtricos para identificar hemoglobina estn basados en las
medidas de espectros de luz caractersticos, con picos de absorbancia en 400-425nm, absorbidos por la
hemoglobina y sus derivados. Finalmente los mtodos inmunolgicos utilizan anticuerpos de hemoglobina
antihumana. Este anticuerpo puede ser usado para detectar hemoglobina humana y, por tanto, indica la
presencia de sangre humana.
Recientemente, las pruebas basadas en ARN han sido desarrolladas para identificar sangre. Estas pruebas
estn basadas en el hecho de que ciertos genes estn especficamente expresados en ciertos tipos de
clulas. Por consiguiente, las tcnicas usadas en la identificacin de sangre estn basadas en la deteccin
de especficos mensajeros del ARN (mRNA), que estn expresados exclusivamente en los eritrocitos. Estas
pruebas utilizan transcripciones reversas de los mtodos de reacciones de la cadena de polimerasa (RT-
PCR) para detectar los niveles de expresin de mRNAs para identificacin sangunea. La tabla 12.1 resume
los tejidos utilizados para la identificacin de la sangre. Comparados con las pruebas convencionales que
son usadas para la identificacin sangunea, las basadas en ARN tienen una especificidad ms alta y son
susceptibles para la automatizacin. Sin embargo, una limitacin es que el ARN es inestable a causa de la
degradacin por las ribonucleasas endgena y ambientalmente nacidas.
Fuente: Adaptada de Juusola, J. y Ballantyne, J., Forensic Sci Int, 152, 1-12, 2005; Nussbaumer, C.,
Gharenbah-Schnell, E., and Korschineck, I., Forensic Sci Int, 157, 181-186, 2006.
a
Tambin conocida como sintasa hidroximetilbilana. (HMBS).