MATERIALES Y METODOS:

Tabla 1. Materiales empleados

Para determinar la actividad amilsica se trabaj con almidn como sustrato de la enzima,
este proporcionado por los laboratorios de la Universidad de La Salle. Se trabaj con la
metodologa denominada como densidad ptica (espectrofotometra) basado en la reaccin
del yodo con el almidn. En la primera parte, se hizo una dilucin de 25 mL de almidn
que se distribuyeron en 5 tubos de ensayo ms un ltimo que es el blanco (Solucin tampn
pH: 5) de la toma de datos. A continuacin, se aadi 1 mL de solucin reveladora (I 2
(0,006%)- KI (0,06%)) con el fin de determinar el almidn remanente en la solucin de
incubacin, y se prosigui a medir absorbancia a una longitud de onda de 640 nm.
Ahora para la determinacin de la cintica enzimtica, con el sobrante de la dilucin se le
agreg el extracto enzimtico (0,02 g) proporcionado por los laboratorios de microbiologa
1. Dmendez17@unisalle.edu.co, 43131017, ingeniera de alimentos, marzo
30 de 2017
2. Ccobaleda23@unisalle.edu.co, 43131023, ingeniera de alimentos,
marzo 30 de 2017
de la Universidad de La Salle, estando el sobrante a una temperatura de 37C +/- 2 que es la
temperatura optima en que trabaja la enzima, se contabilizaron tiempos de 0, 5, 10, 20 y 30
minutos, donde respectivamente se hacan toma de absorbancia con el fin de ver el trabajo
realizado por la enzima -amilasa.
RESULTADOS Y ANLISIS:
- Masa almidn: 0,00025 g
- Masa -amilasa: 0,02 g

El estudio se realiz
Tabla 2.
evaluando el efecto de la
Tubos para la curva
solucin Buffer y agua
de calibracin destilada, por eso se exponen
resultados de ambas

Tabla 3. Curva de Calibracin

Tabla 4. Cintica enzimtica

1. Dmendez17@unisalle.edu.co, 43131017, ingeniera de alimentos, marzo

30 de 2017
2. Ccobaleda23@unisalle.edu.co, 43131023, ingeniera de alimentos,
marzo 30 de 2017
-

1.600

1.400 f(x) = 1.4x + 0.08

R = 0.98

1.200 f(x) = 1.32x - 0.04

R = 0.96
1.000 Solucin Buffer (1)
f(x) = 0.95x + 0.06 Linear (Solucin Buffer
R = 0.95
0.800 Solucin Buffer (2)
Absorbancia (640 nm)
Linear (Solucin Buffer
f(x) = 0.74x + 0
0.600 R = 0.95 Solucion agua de (1)
Linear (Solucion agua
0.400 Solucion agua de (2)
Linear (Solucion agua
0.200

0.000
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

[Almidn %]

Cantidad de almidn en gramos:

Grafica 1. Curva de calibracin para cada tratamiento

Tabla 5. Cantidad en gramos de almidn para cada tratamiento.

1. Dmendez17@unisalle.edu.co, 43131017, ingeniera de alimentos, marzo
30 de 2017
2. Ccobaleda23@unisalle.edu.co, 43131023, ingeniera de alimentos,
marzo 30 de 2017
La tabla 5 y la grfica 1 nos muestran la cantidad de almidn en cada uno de los
tratamientos utilizados, como se puede ver para los tratamientos donde se utiliz solucin
buffer (1) y (2) para hacer las diluciones los datos entre cada uno de los 2 varia un 1x10 -10
tiene una desviacin de estndar muy baja ya que los dos fueron trabajados con las mismas
sustancias (la solucin buffer fue la misma, estableciendo un pH: 5). De igual manera
sucede con los datos experimentales de las diluciones hechas con agua destilada (pH: 7)
Los datos de ambos tratamientos varan un 5x10-11 de igual manera una desviacin estndar
muy baja y por ende la similitud de datos se debe a la misma sustancia con que se hicieron
las diluciones.
f(x) = 1.6
R = 0

1.4

f(x) = 7947.48x - 0.85

1.2 R = 0.95

1 Solucin Buffer (1)

Linear (Solucin Buffer (1))
0.8 f(x) = 4667.16x - 0.31 Solucin Buffer (2)
Absorbancia (640 nm)
R = 0.79 Linear (Solucin Buffer (2))
0.6 Solucion agua de (1)
Linear (Solucion agua de (1))
0.4 Solucion agua de (2)
Linear (Solucion agua de (2))

0.2

0
0 0 0 0 0 0 0

Peso almidon (g)

La variabilidad de resultados entre los tratamientos Buffer y agua destilada se debe

bsicamente al pH de las dos soluciones (5 Y 7, respectivamente) ya que la solucin
reveladora solucin I2 (0,006%) KI (0,06%) sometida a pH ligeramente acido reacciona
de manera ms lenta que a pH bsicos y/o alcalinos (Harris, 2007).

Grafica 2. Cintica enzimtica.

1. Dmendez17@unisalle.edu.co, 43131017, ingeniera de alimentos, marzo

30 de 2017
2. Ccobaleda23@unisalle.edu.co, 43131023, ingeniera de alimentos,
marzo 30 de 2017
 Tabla 6. Peso de almidn (sustrato) en accin directa con la enzima.

Tabla 7. Velocidad enzimtica

Tabla 8. Linealizacin y Parmetros cinticos Vmax y Km.

1. Dmendez17@unisalle.edu.co, 43131017, ingeniera de alimentos, marzo

30 de 2017
2. Ccobaleda23@unisalle.edu.co, 43131023, ingeniera de alimentos,
marzo 30 de 2017
 Tabla 9. Actividad enzimtica.

Los parmetros cinticos obtenidos por el mtodo Lineweaver-Burk mostrados en la tabla 8

y la actividad enzimtica de cada uno de los tratamientos mostrados en la tabla 9, describen
las diferentes condiciones a las que estaba sometida la enzima, para la solucin (1) de agua
destilada los valores de Vmax y Km dan bastante altos a comparacin de los otros
tratamientos, esto se debe a que al no estar en condiciones ptimas tanto de pH como
temperatura, la enzima -amilasa demora mucho en actuar frente al sitio activo del sustrato
(almidn) (Garrido, NF). Adems de eso se necesita una mayor cantidad de enzima para
hidrolizar una unidad de sustrato. Lo que conlleva un mayor gasto energtico por parte de
la enzima, los mejores resultados se dieron en las 2 soluciones Buffer, a comparacin del
tratamiento de agua (1) se vio un mayor rendimiento descrito en los parmetros cinticos
Km y Vmax. La actividad enzimtica se vio reducida ya que al estar en ptimas
condiciones de desarrollo toda la enzima alcanza una saturacin por los sitios activos de
sustrato, llegando as a su fase de decadencia, es decir, la concentracin de sustrato
disminuye, cosa que podemos observar en la tabla 6.
En la solucin de agua 2 se ven anomalas en datos de parmetros cinticos, esto se debe al
control de las condiciones ptimas en que trabaja la enzima. la -amilasa es una enzima
muy termosensible que se desnaturaliza a temperaturas de 40 C por lo que su accin frente
al almidn fue mucho menor a nivel de velocidad y concentracin de enzima respecto a los
otros tratamientos (Chvez et al., 1990).

1. Dmendez17@unisalle.edu.co, 43131017, ingeniera de alimentos, marzo

30 de 2017
2. Ccobaleda23@unisalle.edu.co, 43131023, ingeniera de alimentos,
marzo 30 de 2017
 250.000
f(x) = 0.05x - 167.41
R = 0.91
200.000

Solucin Buffer (1)

150.000 Linear (Solucin Buffer (1))
Solucin Buffer (2)
1/V f(x) = 0.03x - 128.33
100.000 Linear (Solucin Buffer (2))
R = 0.6
f(x) = 0.02x - 77.92 Solucion agua de (1)
R = 0.77 Linear (Solucion agua de (1))
50.000
Solucion agua de (2)
Linear (Solucion agua de (2))
0.000
0.000 5000.000
f(x) = 10000.000 15000.000
R = 0
1/[S]

Grafica 3. Cintica de -amilasa.

En la grfica 3 se muestra las fases de la cintica enzimtica de la -amilasa.

Fase I: Consumo e incremento de sustrato por parte de la enzima
Fase II: Saturacin enzimtica (consumo de sustrato)
Fase III: Fase de decadencia, disminucin de sustrato.

CONCLUSIONES:
El anlisis de los datos recopilados en esta experiencia arroja como condiciones ptimas la
solucin buffer y una temperatura de 37C +/- 2C. comparando la actividad enzimtica, la
concentracin de sustrato hidrolizado y parmetros cinticos, adems de eso a manera de
recomendacin el cuidado constante en la temperatura de accin de la enzima, ya que este
puede ser un limitante en futuros estudios realizados para cuantificar la actividad
enzimtica de la -amilasa.

REFERENCIAS:
- Daniel C. Harris. (2007). Anlisis qumico cuantitativo. Mxico: Reverte, ISBN.
- Agustn Garrido. (NF). Actividad enzimtica de -amilasa. NE.
1. Dmendez17@unisalle.edu.co, 43131017, ingeniera de alimentos, marzo
30 de 2017
2. Ccobaleda23@unisalle.edu.co, 43131023, ingeniera de alimentos,
marzo 30 de 2017
- Chvez, M. A., Daz, J., Prez, U., Delfn, J. 1990. Temas de enzimologa. La
Habana, Cuba: Ed. Min. Educacin Superior. 567 p.

1. Dmendez17@unisalle.edu.co, 43131017, ingeniera de alimentos, marzo

30 de 2017
2. Ccobaleda23@unisalle.edu.co, 43131023, ingeniera de alimentos,
marzo 30 de 2017