La Arabidopsis thaliana :

MYB26 protenas que

interactan y objetivos
directos

Wilson Patricio Orozco Freire

Proyecto de Investigacin 1
La manipulacin gentica de plantas MSc.
Fertilidad masculina -
Pertinencia hbrido
Instituto Internacional de Investigacin del
Controlar la fertilidad masculina es Arroz, 2006
una meta importante para la
reproduccin de plantas y la cra
selectiva .
Vigor hbrido se traduce en mejores
tasas de crecimiento y un aumento
del rendimiento de los hbridos en
comparacin con lneas
consanguneas.
Generacin hbrido es costoso y lleva
mucho tiempo.
 Permite la fertilizacin cruzada y
supera la necesidad de la
castracin manual, que es un
momento- y laborioso proceso.

Introduccin Tallo joven

Vstago intermedio
La Arabidopsis thaliana

Planta modelo biolgico

Los genomas ms pequeos entre la Tallo maduro
floracin
50.000 polimorfismos

Fcil aislamiento de genes mutantes

Miles de semillas de slo una planta Leaf

Grandes ndices de transformacin

En la actualidad diferentes recursos

genmicos estn disponibles, incluyendo Raz madura
un gran nmero de mutaciones de
insercin secuenciados y microarrays de
DNA
Raz joven
Modificado de Rybel et al. , 2016
 El desarrollo de la antera en Arabidopsis
thaliana

El estambre primordios en el tercer verticilos del

meristema floral emerge.

Generar la morfologa de la antera y el filamento.

Las trazas de imgenes confocales de solo los

lbulos de la W23 de maz endogmica se colorea
para mostrar la progresin de la celda destino
especificacin y antera patterning lbulo.

Modificado de Wilson et al. , 2011

Modificado de Kelliger et al. , 2014

Engrosamiento secundario
Endotecio es iniciada en la tercera fase , entonces el
engrosamiento secundario ocurre durante la undcima etapa .

Tiene lugar en el endotecio en donde la celulosa , hemicelulosa y

lignina se depositan en sus celdas .
Soltar el polen

Modificado de Yang et al. , 2007

Scott et al. , 2004

 La dehiscencia de las anteras y liberacin de polen en
Arabidopsis
Thaliana
epidermis conocido como
stomiun que sufre una ruptura
ltica .

hinchazn del endotecio celdas.
una contraccin diferencial.

Modificado de Wilson et al. , 2011

Https://youtu.be/zmD4vjylHPE
 Factores de transcripcin MYB

MYB es una gran familia de protenas que tiene varias funciones.

Sin embargo la mayora de ellos actan como factores de transcripcin.

Control de los procesos celulares esenciales: el metabolismo o la
diferenciacin celular - diferente nmero de repeticiones de dominio
enlazar con varios objetivos de los genes.
125 genes detectados en
La Arabidopsis thaliana
codificacin para R2R3-
MYB protenas

AtMYB26/MS35 que
controla el
engrosamiento de la
pared secundaria en
anteras

Modificado de Dubos et al .,
2010
 MYB26 factor de
transcripcin

R2R3-MYB.
En la parte superior del brazo del
cromosoma 3 de Arabidopsis thaliana.
Expresado en el ncleo de los
diferentes tejidos, como las anteras,
estilo y nectarios.
TF que regula la maduracin
endothecial y engrosamiento
secundario el desarrollo en una
celda de forma concreta en la
antera.
Modificado de Yang et al. , 2007
 Red transcripcional controlan el
engrosamiento secundario en
La pared celular Interactuar A5G25560 CHYR

Chi-tipo dedo de
zinc

Las protenas Protena

At1g08320 TGA9
MYB26

La red reguladora Objetivo directo Factor de transcripcin bZIP

Protenas de la familia
completa queda claro .
Dos genes de dominio NAC, A2G39110 PKSP
NAC
La protena kinasa superfamilia de
Pared secundaria-factor protenas
promotor1 ( NST1 ) y NST2
tambin son
Expresado en el
endotecio celdas.
MYB26 funciones delante de la
va de la biosntesis de lignina:
NST1 y NST2 genes estaban
regulados por abajo

Xilema irregulares1 ( IRX1 ) ,

IRX3 , IRX8 e IRX12
Modificado de Zhong et al. , 2010
 Objetivos - Estrategia gentica reversa y
enfoques moleculares
La Levadura Analizar solo mutantes de insercin SALK
hbrida 2
Interactuar
Anlisis de trastes Lneas y crear un doble mutante entre
Estas lneas.
Las A5G25560 CHYR
protenas Generar mutante pcrk1-1
Chi-tipo dedo de zinc
tga9tga10 mutantes dobles
Protena
Y2H560 chyr1 mutantes dobles
At1g08320 TGA9
Transcripcin bZIP
Factor de protenas Cruz El MYB26 Reporter
Lne
de la familia as
(MYB26Prom::GUS y MYB26Prom::MYB26-
GR-YFP) en la doble lnea de mutantes.

MYB26 Transformar el tipo salvaje Arabidopsis con

Sobreexpresin construcciones para el A5G25560

( CHYR) y At1g08320 ( TG9 ). Resultante de la
pantalla
A2G39110 PKSP Los transgnicos para cambios en la expresin
 gentica y
La protena kinasa superfamilia de Los cambios en la enseanza secundaria de
protenas engrosamiento.
DIRECT La cromatina

Objetivos INMUNO de PKSP

Precipitacin En el tipo salvaje y myb26 Antecedentes.
 La gentica reversa y enfoques moleculares
Anlisis in silico -
La mutacin del gen de inters
semillas de
centro de
acopio NASC

Extraer ADN o
Solo los mutantes Arn

PCR
Microscopio estereoscpico Adn de
genotipado

duplicar o triplicar el nmero de Arabidopsis
Orificios para revelar el oculto 65% menos de 3.000 genes.
Fenotipo.

La extraccin de Lneas homocigotas

ARN, la sntesis de
adnc, PCR/QPCR

Seleccin de los mutantes dobles:

Genotipado Microscopio Fenotipo
estereoscpico
Anlisis de
OBSERVTION Resultados

Transformacin

Sobre-expresin
Modificado de Yang et al. , 2007
 Conclusiones
Las clulas de la pared endotecio sufren un engrosamiento secundario de la deposicin, lo
cual es esencial para la liberacin de polen y la dehiscencia de las anteras.

Fertilidad masculina que dependen de la liberacin de polen, en lugar de generacin de

polen, pueden ofrecer buenas oportunidades para el futuro desarrollo de hbridos.

Hay varios genes relacionados con el engrosamiento secundario y dehiscencia de

los procesos que se han caracterizado, a pesar de la completa red regulatoria
queda claro .

26 gen MYB es crtica para el desarrollo de engrosamiento secundario en la antera

endotecio y la subsiguiente dehiscencia.

Con este estudio, ser posible identificar el papel de A5G25560 CHYR ,

At1g08320 TGA9 y A2G39110 PKSP engrosamiento secundario en la red
transcripcional y tambin, la relacin entre ellos y MYB26 como objetivos
directos o interaccin de protenas.
 Referencias
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Ishiguro S, un Kawai-Oda, Ueda J, Nishida I, Okada K (2001) El defectuoso en la dehiscencia de las anteras1 gen
codifica una novela fosfolipasa A1 cataliza el paso inicial de la biosntesis de cido jasmonic, que sincroniza la
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13:2191-2209.

Kelliher T, Egger RL, Zhang Walbot H, V (2014), cuestiones an no resueltas en pre-meiticas antera el desarrollo. Las
fronteras de la ciencia de planta 5: 1-9.

Scott RJ, Spielman M, Dickinson HG (2004) Estructura y funcin de estambre. La clula vegetal 16: S46-S60.

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botnica experimental 62: 1633-1649.

Yang C, Xu Z, Cancin J, K Conner, barrena, G, Wilson (2007) Z Arabidopsis MYB26/masculino estril35 regula engrosamiento
secundario en el endotecio y es esencial para la dehiscencia de las anteras. La clula vegetal 19: 534-548.

Zhong R, Lee C, Ye Z (2010) conservacin evolutiva de la red secundaria de regulacin transcripcional de la biosntesis de la
pared celular. Tendencias en Plant Science 15: 625-632.
Resultados
1. Analizar los mutantes de Salk lneas de insercin y crear un
doble entre esas lneas mutantes
Generar tga9tga10 mutantes dobles
Generar Y2H560 chyr1 mutantes dobles
Generar pksp pksp2 mutante pcrk1-1
a. Y el cruce de genotipado
 CHYR1

1075 bp
730 bp

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 wt wt
wt

HL1
 560 GABI1 560
SALK

1105 bp
92
9
536 bp bp

1 2 3 wt 1 2 3 4 5 6 7 8 9
 WT
HL
1
 560 GABI9
1105 bp

536 bp

1 2 3 4 5 WT
HL1
 TGA9

984 bp

600 bp

WT 1 2 3 4 5 6 7

HL1
 TGA10

1006 bp
443 bp
3 4567
HL1 WT 12
 PKSP PKSP2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
15
HL
1
 PKSP PKSP2

16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37
HL1

PKSP PKSP2

38 39 C- 1 2 3 4 5 6 7 8 C-

HL
1
B. Anlisis de expresin.

CHYR1 9 TGA TGA10 9 TGA TGA10 parcialmente estriles

L B LA BA L B LA BA L B LA B UN L B LA B UN L B LA BA
Tga9 Tga1
0
Tga9 Tga10
HL1 HL1 HL1

Tga9 tga10

L BL L B L B LB L L B L B
wt wt B A A WTA WTA wt wt B A A WTA WTA
HL1 Tga9 Tga10
HL1
 560 GABI9 PCKR1.1

L B L L B L L B L L B L B
wt wt B A A WTA WTA B wt wt B A A WTA WTA

HL1 HL1
C. anlisis fenotpico

COLOMBIA 9 TGA
TGA10
a. Continuar CHYR cruzar 560 x1
lneas homocigotas y verificar el
fenotipo.
b. Analizar9 TGA TGA10 y la viabilidad
de polen de flores
c. Analizar PKSP PKSP2
d. Analizar PKSP PCKR1
e. Doble control de los patrones de
expresin
 2. Cruzar las lneas MYB26 reporter (MYB26Prom::GUS y
MYB26Prom::MYB26-GR-YFP) en la doble lnea de mutantes.
MYB26 editadas (MYB26Prom::GUS) y protenas
(MYB26Prom::MYB26-GR-YFP) actividades en tga9tga10 doble
mutante y Y2H560chyr1 mutantes dobles

a. Tga9 tga10 :: MYB26Prom::GUS

b. Tga9 tga10 ::::Prom26MYB MYB26-GR-YFP GENERADO

La prxima semana el DR. ALISON me ayudar a preparar

muestras
Y el uso de Microscopia confocal

Tipo salvaje, estadio

 3. Transformar el tipo salvaje Arabidopsis con
sobreexpresin construcciones para el A5G1G25560 y
EN08320. Pantalla transgnicos resultantes de cambios en
la expresin gnica y cambios en el engrosamiento
secundario.
PUBC-Y2H560-RFP
PUBN-Y2H320-RFP

Lnea1 Lnea2 WT
 Lnea1 Lnea2
lnea3

Lnea4 Lnea5
lnea6
 LINE7

a. Compruebe los fenotipos

flor, antera, viabilidad del
polen.
 4. Desarrollar construcciones para la sobreexpresin de
PKSP en el tipo salvaje y myb26 Antecedentes. Clonacin de
gateway

a. Diseo de imprimacin para obtener la secuencia

codificante del gen PKSP (con y sin el stop codon)

PSKP_CD_F: ATGAATAATTCTACATCAGTGAAGAGG
PSKP_CD_R_NS: AATAGAAGTAACAAGTTTATGAGACCAAG
PSKP_CD_R: TCAAATAGAAGTAACAAGTTTATGAGACC

PSKP_273_R: GCTGAAGTTCTTGGTAGCGG
PSKP_1080_F: GCAAGGCCAACAATGAGTCA
B. Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad

Prueba 2
SC El NSC

1308 bp

3 prueba
El NSC SC 62C

HL1

1 prueba

4
prueba
El NSC
c. Purificacin mediante PCR QIAquick Kit de
purificacin de un procedimiento de
siembra - reaccin sobresaliendo por la
transformacin de clulas competentes
VECTOR DE
ENTRADA
d. Colonia PCR para confirmar la integracin de PKSP amplicn
en el vector de entrada

SC 1 NSC 1

420 bp 420 bp

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C-
HL1 HL1

SC 2 El NSC 1

El NSC
420 bp
420 bp

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C-

HL1
HL1
E. Preparar el glicerol stock y MiniPrep (debe ser secuenciado)