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1. Introduccin
El neurocrneo es una estructura embrionaria que genera estructuras craneofaciales
esenciales incluyendo la bveda del crneo, la base del crneo y el paladar. El paladar y
la base del crneo estn conectados y demarcan las regiones prechordal, o anterior, y
poschordal, o posterior, del neurocranium, respectivamente. El mapeo extenso del
destino en especies de tetrpodos demuestra que la cresta neural y el mesodermo
contribuyen al neurocrneo prechordal y poschordal, respectivamente ( Couly et al.,
1992 , 1993 , Crumb et al., 2004 , Eberhart et al., 2006 , Gross et al. , 2008 , Kntges y
Lumsden, 1996 , McBratney-Owen y otros, 2008 , Wada et al., 2011 ). A pesar de
nuestro conocimiento de los orgenes de los tejidos del neurocrneo, los estudios
mecansticos del desarrollo se han centrado de manera abrumadora en el neurocrneo
prechordal, mientras que la regin postchordal ha sido dejada en gran parte descuidada.
Fgfs son parte de una gran familia de molculas de sealizacin intercelular ( Itoh, 2007
) que emanan de mltiples fuentes de tejido en la cabeza. Tambin son cruciales en
numerosos aspectos del desarrollo craneofacial, incluyendo la migracin apropiada, la
supervivencia y el patrn de la cresta neural ( Creuzet et al., 2004 , Crump et al, 2006 ,
Hu et al, 2009 , Wilson y Tucker, 2004 ), as como la formacin de sutura craneal ( Nie
et al., 2006 , Rice et al., 2000 ). Adems, los Fgfs estn implicados en una serie de
trastornos craneofaciales congnitos con defectos en la base del crneo descritos,
incluyendo el sndrome de Apert y Crouzon ( Aggarwal et al., 2006) , Tokumaru et al .
Sin embargo, el papel que juegan Fgfs en el desarrollo neurocraneal postcordal
temprano es desconocido.
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2. Resultados
2.1. El neurocrneo postcordal requiere fgf8a y fgf3
Higo. 1
El neurocraneal postcordal requiere sealizacin Fgf. (AE) Wholemned pez cebra
neurocrania con la viscerocrania eliminado a los 5 das post-fertilizacin. Anterior es a
la izquierda. (A) Tipo salvaje, que muestra las regiones precordiales frente a las post -...
Fgf8 y Fgf3 seal de forma cooperativa para patrn del cerebro posterior, haciendo de
estos dos Fgfs candidatos principales para nuestros anlisis. Se utiliz una combinacin
de gentica y morfolino basado en la prdida de funcin de estos Fgf ligandos, cada uno
de los cuales result en similares fenotipos ( Fig. 1 , Suplementario Fig. S1 ). Mientras
que ni los mutantes nicos fgf8a ni fgf3 muestran ningn defecto neurocraneal
postcordal profundo ( Fig. 1B y C en comparacin con la Fig. 1A ), la gran mayora del
neurocrneo postcordal est ausente en los mutantes fgf8a , fgf3 ( Fig.1E , punta de
flecha) Con slo el neurocraneal prechordal y los arcos occipital restantes. Adems,
incluso la prdida de un solo alelo de fgf3 en un fondo mutante de fgf8a da lugar a
defectos neurocraneales posquirordiales variables, incluyendo la prdida de cartlago
anterior de la parte anterior de la base y parachordal ( Fig. 1D , puntas de flecha). Estos
mutantes tambin tienen defectos viscerocraneales severos (no mostrados, Crump et al.,
2004 ). Debido a que, por lo menos, fgf8a est expresado en la madre ( Reifers et al.,
1998 ), ampliamos nuestros anlisis utilizando los morfolinos bien caracterizados contra
cada uno de estos Fgfs ( Crump et al., 2004 ; Laves et al., 2003 ; Al., 2002 ).
Los morfolinos que atacan fgf8a o fgf3 inyectados en los mutantes fgf3 o fgf8a ,
respectivamente, recapitulan los defectos neurocraneales postcordales observados en los
mutantes dobles ( Fig. S1 suplementaria ). Los embriones inyectados con fgf3
morfolinos muestran una prdida poco frecuente de la comisura de la sutura bsica
anterior (24%, n = 6/24 , Fig. S1 suplementaria ), sin embargo el resto del neurocrneo
en estos embriones est bien desarrollado. Los embriones inyectados con fgf3
morfolinos tambin tienen consistentemente otolitos fundidos ( Fig. S1 suplementaria )
as como defectos viscerocraneales variables, incluyendo fusiones de cartlago de
Meckel y el palatoquadrato y prdida de los cartlagos ceratobranquiales (datos no
mostrados, Crump et al., 2004 ) . Al igual que en nuestro anlisis de mutantes,
encontramos una fuerte sinergia entre fgf8a y fgf3 en el desarrollo del neurocrneo post-
coronal.
Higo. 2
El mesodermo y el ectodermo neural son fuentes de Fgf requeridas para la formacin
neurocraneal posquiral (A-E, A'-E ') 24 h despus de la fecundacin de imgenes
confocales de tejidos de tipo salvaje trasplantado en fgf3, fgf8 morpholino-inyectado
hosts ...
La sealizacin Fgf a partir del ectodermo neural induce la plactica tica ( Lger y
Brand, 2002 , Sai y Ladher, 2015 ). Por lo tanto, el rescate parcial por ectodermo neural
podra ser indirecto, debido a una seal retransmitida desde el placode. Si esta
sealizacin indirecta era responsable del rescate, entonces la prdida de la plactica
tica debe fenocopiar fgf8a; fgf3 doble embriones de prdida de funcin. La placoda
tica se pierde en embriones co-inyectados, pero no se inyectan individualmente , con
dlx3b y foxi1 morfolinos ( Solomon et al., 2002 , 2003 ). Se encontr que, como se
esperaba, la inyeccin de dlx3b y foxi1 caus una prdida completa de la plactica tica
a 24 hpf ( Solomon et al., 2004 , Fig. S3 suplementaria ). Sin embargo, en estos
embriones slo faltaba la comisura de la parte anterior de la sutura anterior ( Fig. S3
suplementaria ). De hecho, los cartlagos parachordales pueden ser expandidos. Por lo
tanto, la plactica tica puede proporcionar seales que regulan el desarrollo postcordal
neurocraneal, y futuros experimentos de anlisis de un solo doble o doble prdida de
funcin de los embriones que ayudara a caracterizar este papel. Sin embargo, los
defectos de la plactica tica en s no explican la prdida extensa del neurocraneal
postcordal encontrado en los embriones de prdida de funcin fgf3; fgf8 .
Higo. 3
El neurocrneo post-cordal del pez cebra se deriva tanto de los tejidos del mesodermo
como de la cresta neural. (A-F) Las imgenes confocales de 5 das despus de la
fertilizacin de pez cebra plana neurocrania de (A y B) sox10: KikGR , (C y D) sox10:
Cre; ubiRSG , y (E y ...
El primero y el segundo arcos sufren movimientos morfogenticos dinmicos que
implican numerosos reordenamientos celulares especficos de la cresta neural ( Crump
et al., 2004 , 2006) , y Eberhart et al . Para dilucidar qu arco farngeo contribuye
clulas de cresta neural al neurocrneo post-coronal, se realiz el mapeo de destino con
sox10: embriones de Kaede . Hemos fotoconvertido el primer o segundo arco a 26 hpf (
Crup et al., 2006 ), y encontramos que la segunda cresta del arco contribuy a la cpsula
auditiva lateral ( Fig. S4 suplementaria ), mientras que la primera cresta del arco
Contribuyeron a la regin lateral y anterior de la comisura capsular anterior ( Fig. S4 ).
En conjunto, estos resultados muestran que la cresta neural del primer y segundo arco
contribuyen a las regiones adyacentes del neurocrneo postcordal.
Con el fin de caracterizar lo que sucede a esta poblacin de mesoderma en FGF prdida
de funcin de los embriones, es necesario comprender su ubicacin en el embrin
temprano. Utilizamos la fotoconversin de Kaede para etiquetar y rastrear grupos de
clulas de 24 hpf a 4 das despus de la fecundacin (dpf), cuando el neurocrneo
postcordal est bien formado en el pez cebra ( Figura 4A-D ). Se inyectaron embriones
fli1: EGFP , que marca la cresta neural temprana en el desarrollo pero todo el cartlago
posterior, con ARNm de Kaede y clulas fotoconvertidas apenas dorsales a los arcos
farngeos para nuestro anlisis, una localizacin que debe contener mesodermo. En las
imgenes, la intensa fluorescencia de EGFP enmascara la fluorescencia de Kaede
mucho ms tenue verde tan slo el rojo, fotoconvertido, Kaede es aparente. Se encontr
que a 24 hpf, las clulas que contribuyen al neurocrneo postcordal se colocan dentro de
la cabeza en relativo acuerdo con su ubicacin a 4 dpf ( Fig. 4E y E ' , vase la S6 de
datos complementarios para los datos individuales). Basado en nuestros anlisis en la
Fig. 3 estas clulas son de origen mesodrmico. En general, ningn cambio relativo en
la posicin de estas clulas marcadas ocurri entre 24 hpf y 4 dpf. Las clulas marcadas
anteriormente de la cpsula tica (oc) mantienen esta posicin a 4 dpf ( Fig. 4E y E ' ,
color gris oscuro). Las clulas marcadas ms medial y posterior a la cpsula tica a 24
hpf poblan reas medianas y posteriores 4 dpf ( Fig. 4E y E ' , gris y gris claro). Durante
este mismo perodo de tiempo, las clulas de la cresta neural parecen sufrir grandes
reordenamientos celulares en la formacin de estructuras esquelticas ( Crump et al.,
2006 ; Le Pabic et al., 2014 ). Encontramos poca dispersin de clulas mesodermales
etiquetadas, lo que sugiere una falta de reordenamientos similares en el esqueleto
derivado del mesodermo. En conjunto, estos datos muestran que los progenitores del
neurocrneo postcordal se colocan adecuadamente a lo largo del eje anterior a posterior
a 24 hpf.
Higo. 4
La organizacin anterior / posterior de las clulas postcordales se fija por 24 h despus
de la fecundacin (hpf). (A-C) Imgenes confocales de un embrin inyectado de Kaede
en (A) 24 hpf y (B y C) 4 das despus de la fertilizacin (dpf). Anterior es a la
izquierda. (A) A las 24 ...
Nuestro mapa de destino del neurocrneo post-coronal muestra que estos precursores de
cartlago estn en su lugar por 24 hpf. Para investigar si estos precursores estn
presentes en embriones que carecen de fgf3 y fgf8a , analizamos la expresin del
marcador prechondrogenic sox9a y el marcador de cartlago col2a1a . En comparacin
con los mutantes fgf8a inyectados con morfolino y no inyectados , los embriones fgf8a
de doble funcin fgf3fgf8a presentan una prdida de col2a1a en el mesodermo ceflico (
Fig. 5D, en comparacin con A-C , Piotrowski y Nusslein-Volhard , 2000 ). La tincin
notocrica para col2a1a se conserva en doble embriones de prdida de funcin, lo que
demuestra la especificidad del efecto ( Fig. 5D , las puntas de flecha denotan notocorda
anterior). Adems, el marcador pre-cartlago sox9a tambin se pierde en estos fgf3
morpholino- inyectados mutantes fgf8a ( Fig. 5H, en comparacin con E-G ). En
conjunto, estos datos sugieren que el mesodermo paraxial de la cabeza que generar
estos cartlagos es bien mislocalized o incorrectamente especificado cuando Fgf
sealizacin es atenuado.
Higo. 5
Los marcadores de cartlago y pre-cartlago col2a1a y sox9a estn ausentes a las 24 h
despus de la fecundacin (hpf) en fgf3; fgf8a knockdown embriones. (A-H) Imgenes
de 24 hpf embriones marcados con (A-D) col2a1a y (E-H) sox9a riboprobe. Vista dorsal
...
Higo. 6
Kaede photoconverted endomesoderm progenitor postcordal-clulas progenitoras
migrar adecuadamente en fgf3; fgf8a knockdown embriones. (A) Esquema de 6 h post-
fecundacin (hpf) embrin de pez cebra que muestra la regin del embrin
fotoconvertido en todos los experimentos posteriores, ...
Debido a la prdida de la expresin del has2 a 10 hpf en los embriones knockdown fgf3;
fgf8a, razonamos que la sealizacin de Fgf se requerira tempranamente para el
desarrollo neurocraneal postcordal. Usando una dosis subptima de SU5402 (Tocris
Biosciences) de 6 a 10 hpf en fgf8a mutantes y hermanos, que slo parcialmente reduce
Fgf-dependiente etv4 expresin a 10 hpf en salvaje y fgf8a tratados con embriones (
Suplementario Fig. S10 ), encontramos que , Mientras que SU5402 tratados con el
desarrollo neurocraneal normal ( Fig. 8B en comparacin con A y E ), ambos
heterocigotos y mutantes fgf8a pez cebra present postcordal defectos neurocraneales,
que afectan a la anterior bsicosapsular comisura en heterozigotos, y la totalidad de la
postcordal neurocraneal en mutantes Fig. 8D en comparacin con A - C y E ). Adems,
la expresin has2 a 10 hpf en los mutantes de fgf8a tratados con SU5402 est
completamente ausente en la regin del neurocraneal postcomordal en desarrollo
(comparar Fig. 8I a F y G ). Del mismo modo, a 24 hpf, tanto col2a1a y sox9a se
reducen en SU5402- fgf8a mutantes tratados ( Suplementario Fig. S11 ). Estos datos
sugieren fuertemente que la sealizacin de Fgf es necesaria durante la gastrulacin,
entre 6 y 10 hpf, para la formacin y especificacin postcordal neurocraneal.
Higo. 8
Desarrollo postcordal neurocraneal requiere Fgf sealizacin durante la gastrulacin.
(A-D) Wholemount zebrafish neurocrania, anterior est a la izquierda. (A y B) La
neurocranea de tipo salvaje tratada con DMSO o SU5402 se desarrolla normalmente.
(C) Fgf8a tratada con DMSO ...
Nuestros datos muestran que la sealizacin Fgf, que se origina del mesodermo y
ectodermo neural, es necesaria en el desarrollo del neurocrneo postcordal. Informes
anteriores han demostrado la importancia de la sealizacin Shh de la notocorda en este
proceso ( Balczerski et al., 2012a ). Teniendo en cuenta nuestros datos, Fgf y Shh juntos
pueden formar una jerarqua de sealizacin necesaria para el desarrollo postcordal
neurocraneal. As, investigamos la funcin del notocordio y Shh en la formacin del
neurocrneo post-coronal.
Higo. 9
El desarrollo neurocraneal postcordial no requiere la funcin braquial ni una notocorda.
El anterior est a la izquierda en todos los paneles. (A-B, A'-B ') la hialuronan sintetasa
2 ( has2 ) se expresa en regiones ceflicas a las 10 h post-fecundacin ...
Higo. 10
La diferenciacin de condrocitos es particularmente sensible a la interrupcin de la
sealizacin Hh. Todos los paneles son anteriores a la izquierda. (A-B, A'-B ') A las 10 h
post-fecundacin (hpf), el marcador mesodermo temprano has2 se expresa en la ...
Higo. 11
La sealizacin de Hh se requiere despus de la sealizacin de Fgf para el desarrollo
neurocraneal postcordal. La expresin de has2 se retiene despus del tratamiento (A-A ')
DMSO o (B-B') ciclopamina de 6 a 10 h despus de la fecundacin (hpf). ...
Higo. 12
Cephalic mesoderm specification and differentiation utilizes Fgf and Hh signaling
pathways. (A) During early postchordal mesoderm specification, Fgf signaling from
both the overlying neuroectoderm and mesoderm is necessary for has2 expression in
mesodermal ...
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3. Discusin
Here we describe a hierarchy of genetic signaling required for the specification and
differentiation of the postchordal neurocranium in zebrafish. The postchordal
neurocranium is a structure primarily derived from mesoderm, and is lost in embryos
with attenuated Fgf or Shh signaling. Fgf signaling plays an early role in the
specification of head mesoderm via has2 . The loss of has2 and subsequent hyaluronic
acid production is at least partly causative of the postchordal neurocranial defects. Shh
signaling is then required for the later differentiation of sox9a and col2a1a -expressing
chondrocytes in the postchordal neurocranium. Together, these results reveal a
previously unknown genetic signaling hierarchy required in the development of the
postchordal neurocranium.
The zebrafish neurocranium originates from the neural crest and mesoderm. Frog,
mouse, and chick fate-maps show similar neurocranial contributions ( Couley et al.,
1993 ; Gross and Hanken, 2008 ; Jiang et al., 2002 ; Kontges and Lumsden, 1996 ;
McBratney-Owen et al., 2008 ). Our results strongly suggest that the ancestral pattern of
neurocranial contribution is neural crest being largely restricted to prechordal regions,
and mesoderm only providing contributions to postchordal regions. The prechordal
neurocranium is exclusively of neural-crest origin. This region of the neurocranium has
received a good deal of characterization in zebrafish ( Eberhart et al., 2006 ; Kague et
al., 2012 ; Mongera et al., 2013 ; Wada et al., 2005 ), therefore, here we will focus on
the postchordal neurocranium.
The vertebrate neurocranium is the product of the mesoderm and the cranial neural
crest, yet requires interactions between multiple tissues. An important regulator of the
development of the neural crest-derived portion of the neurocranium is Fibroblast
growth factor signaling ( Creuzet et al., 2004 ; Crump et al., 2006 ; Monsoro-Burq et al.,
2003 ). Our data reveal a second, and much earlier, role for Fgf signaling in the
mesoderm-derived postchordal neurocranium.
We show that loss-of-function of both fgf3 and fgf8a cause severe defects in postchordal
neurocranial development. The root of this defect is likely the misspecification of
cephalic mesoderm at the end of gastrulation. Notably there is a loss of expression of
the chondrocyte-regulator hyaluronan-synthetase 2 ( has2 ), which is essential for
hyaluronic acid production, positioning has2 downstream of Fgf. In fgf8a mutants, loss
of has2 or hyaluronic acid, led to perturbed postchordal neurocranial defects similar to
fgf3;fgf8 loss-of-function embryos. These data suggest that has2 is necessary for proper
postchordal neurocranial formation in fgf8a -dependent fashion. It will be of interest to
determine if transgenic activation of has2 is sufficient to rescue the Fgf loss-of-function
defects. How has2 expression is activated downstream of Fgf signaling and if Fgf
signals directly to the head paraxial mesoderm remain to be elucidated. Fgf signaling
could maintain has2 expression directly, via STAT3 activation ( Saavalainen et al., 2005
). Indeed, Fgf receptors have been shown to activate HAS2 function in breast cancer
cells via STAT3 ( Bohrer et al., 2014 ). Understanding the requirement of Fgf receptors
in the postchordal neurocranium is of ongoing interest and will be important to
understand the exact mechanism of Fgf-dependent has2 function in the postchordal
neurocranium.
Other studies have purported that the notochord is also vital in postchordal neurocranial
formation and that shh emanating from this structure mediates the formation of the
postchordal neurocranium via chondrogenesis of the paraxial mesoderm ( Balczerski et
al., 2012a ). Consistent with this report, we find a loss of differentiated chondrocytes in
the postchordal neurocranium. In contrast, has2 expression was retained, albeit
potentially reduced, in smoothened mutants, which completely lack Hh signaling (
Varga et al., 2001 ), and in embryos treated with cyclopamine from 6 to 10 hpf
compared to controls. This shows that, unlike Fgf signaling, Hh signaling may be
dispensable in early specification of postchordal neurocranium precursors, but is
certainly important in their terminal differentiation.
The notochord has been thought to be a critical source of Shh for posterior neurocranial
development ( Balczerski et al., 2012a , 2012b ). Analysis of brachyury mutants, which
transfate the notochord during gastrulation ( Amacher et al., 2002 ; Halpern et al.,
1993 ), showed that the postchordal neurocranium was fully developed and included a
chondrocytic region expanded into the area where the notochord develops. The
expression of shh is maintained in brachyury mutants ( Amacher et al., 2002 ).
Collectively, these findings suggest that the notochord is not a required shh source.
However, the possibility remains that, in wild-type embryos, shh from the notochord
does serve a signaling function to the developing postchordal neurocranium.
Our findings now place Fgf signaling prior to Hh in the formation of the postchordal
neurocranium. Cephalic mesoderm is first specified in an Fgf-dependent manner
beginning at 10 hpf via activation of has2 . Temporal-loss of Fgf signaling via SU5402
treatment also shows that Fgf signaling is required early, from 6 to 10 hpf, for has2
activation. Loss of has2 ultimately results in the loss of the chondrogenic program
resulting in postchordal neurocranial defects in Fgf loss-of-function embryos. Shh, on
the other hand, is not essential for this early activation of has2 , but supports proper
chondrogenic differentiation of this group of cells. Together, these results clarify the
temporal and genetic control required for proper postchordal neurocranial development
in zebrafish.
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All embryos were raised and cared for using established protocols ( Westerfield, 1993 )
with IACUC approval from the University of Texas at Austin. The fgf8a ti282a ( Brand et
al., 1996 ), fgf3 t24149 ( Herzog et al., 2004 ), brachyury b195 ( Schulte-Merker et al.,
1994 ), smoothened b577 ( Varga et al., 2001 ), sox10:Cre ( Kague et al., 2012 ),
sox10:KikGR ( Balczerski et al., 2012b ), sox10:kaede ( Dougherty et al., 2013 ),
ubi:switch ( Mosimann et al., 2011 ), and ubi:RSG ( Kikuchi et al., 2010 ) alleles have
all been described previously. The drl:CreERT2 line was generated using a 3.8 kb
draculin promoter upstream of the ATG start site. Primers used to amplify this promoter
were: for1: ATTGCGGCCGCTTCAATTGTGGTTGAGCAGTC.
rev1:ATTACTAGTCCAAGTGTGAATTGGGATCG. The 3.8KB fragment was
amplified with iProof polymerase (BioRad), then cloned into TOPO-Blunt (Invitrogen).
After verification, the promoter was sub cloned into the Tol2 vector ( Kawakami et al.,
2004 ) upstream of the CRE-ERT2 ( Feil et al., 1996 , PNAS). The Tol2-drl-creert2
vector was co-injected with Tol2 mRNA into AB* in order to establish a founder line.
Tamoxifen was added from 10 to 24 h post-fertilization on the drl:CreERT2 line, and
the sox10:KikGR and sox10:kaede lines were UV-activated at 24 h post-fertilization
using DAPI-filter attached to a Zeiss LSM 710. Embryos were treated in embryo media
with 5 M SU5402 (Tocris Biosciences) from 6 to 10 hpf, and 100 M cyclopamine
(Toronto Research Chemicals) or 1 mM 4-methylumbelliferone (Sigma-Aldrich) from 6
to 10 and 1024 hpf.
Kaede mRNA was injected into one-cell stage embryos, with or without morpholinos,
and UV activated at either 6 or 24 hpf using a Zeiss LSM 710 Confocal microscope.
Five and four day postfertilization (dpf) zebrafish embryos were stained with Alcian
blue and Alizarin Red ( Walker and Kimmel, 2007 ), and then were either flat mounted (
Kimmel et al., 1998 ) or had the viscerocrania removed for imaging. Images were taken
with a Zeiss Axio Imager-AI microscope. Graphs were made in Microsoft Excel 2011.
Confocal z-stacks were collected on a Zeiss LSM 710 using Zen software. Images were
processed in Adobe Photoshop CS. Kaede and tissue fate maps were generated in Adobe
Photoshop CS by overlaying images gathered on the Zeiss confocal. Graphs were
generated using Microsoft Excel 2011.
Genetic mosaics were generated as described elsewhere ( Crump et al., 2004 ; Maves et
al., 2002 ; Stafford et al., 2006 ). For neural and otic placode tissue transplants, embryos
were injected at the 1-2 cell stage with 2.5% Rhodamine Alexa 568 dextran. At shield
stage (6 hpf), donor cells were removed and placed into corresponding areas in fgf3;fgf8
morpholino-injected hosts using previously described fate maps ( Kimmel et al., 1990
and Woo and Fraser, 1995 ). Mesoderm transplants were performed at shield stage (4
hpf) using donor tissue cells located at the margin and moved to the margins of fgf3;fgf8
morpholino-injected hosts ( Kimmel et al., 1990 ). For endoderm transplants, donor 1
cell stage embryos were injected with a mixture of 2.5% Rhodamine Alexa 568 dextran
and sox32 mRNA and donor cells located at the margin at shield were transplanted into
the margin of fgf3;fgf8 morpholino-injected hosts ( Stafford et al., 2006 ). For double
mesoderm and neural transplants, donor tissue from 2.5% Rhodamine Alexa 568
dextran injected hosts was transplanted at both sphere (taking cells from the margin)
and shield (taking cells from the neural ectoderm-forming region) into fgf3;fgf8
morpholino-injected hosts. At 24 hpf, all hosts were screened using a LeicaM216F
fluorescence stereomicroscope for substantial and tissue-specific contributions of donor
tissue for subsequent analysis.
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Material suplementario
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Expresiones de gratitud
We wanted to thank the following people for their kind contributions of fish lines,
embryos, and morpholinos in this work: Sharon Amacher for the brachyury embryos;
Gage Crump for the sox10:Kikgr line; Sharon Fischer for the sox10:Cre line; Eric Liao
for the sox10:Kaede line; Alex Neichoporuk for the fgf3 line; and Bruce Riley for the
dlx3b and foxi1 morpholinos. We would also like to thank Georgy Koentges, Ben
Lovely, Patrick McGurk, Anna Percy, and Mary Swartz for reviewing the manuscript.
We would also like to thank Anna Percy for the maintenance and care of all zebrafish
lines. This work was supported by NIH/NIDCR grant R01DE020884 and NIH/NIAAA
grant U24AA014811 (Riley PI) to JKE; endorsed by a Gabriella Giorgi-Cavaglieri
Chair for life sciences and by the Swiss National Fund #31003A_146527 to JYB and
NIH/NIAAA F31AA020731 to NM.
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Neil McCarthy performed all of the experiments, except those noted below, and helped
design all experiments in this manuscript and was the primary author. Alfire Sidik
performed has2 in situ hybridization at 24 hpf and analyzed mesoderm contributions at
48 hpf. Julien Bertrand generated and provided the drl:CreERT2 transgenic line used for
cell fate analysis. Johann Eberhart helped design all experiments and also edited the
manuscript, along with Neil McCarthy, Alfire Sidik, and Julien Bertrand.
Supplementary data associated with this article can be found in the online version at
http://dx.doi.org/10.1016/j.ydbio.2016.04.005 .
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Referencias
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