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Impact damendements organiques sur


la structure des communauts microbiennes
des sols:
Choix des mthodes, validation et rsultats

C. Leyval(1), C. Steinberg(2), M.P. Norini(3), T. Beguiristain(1), V. Edel-Hermann(2), P. Leglize(1),


N. Gautheron(2), T. Lebeau(3) et S. Houot(4)
1) Laboratoire des Interactions Microorganismes-Minraux-Matire Organique dans les Sols, UMR 7137 Nancy Universit CNRS,
Facult des Sciences BP70239 54506 Vandoeuvre-les-Nancy cedex, France
2) UMR INRA-Universit de Bourgogne, Microbiologie du Sol et de lEnvironnement et Gochimie des Sols,
17 rue Sully - BP 86510, 21065 Dijon cedex, France
3) Plate-forme Technologique Agrosystmes, IUT Colmar, Universit de Haute-Alsace, BP 50568,
68008 COLMAR cedex, France
4) INRA, UMR Environnement et Grandes Cultures, 78850 Thiverval Grignon, France

RSUM
Lanalyse des communauts microbiennes, bactriennes et fongiques prsentes dans un sol peut permettre dvaluer la capacit des
cosystmes rpondre des changements de conditions environnementales. Ltude prsente ici a pour objectif destimer lim-
pact de produits rsiduaires organiques (PRO) de natures diffrentes sur la structure des communauts microbiennes dans les sols
(bactriennes et fongiques, incluant les champignons mycorhiziens) en utilisant deux techniques danalyse de lADN extrait des sols:
la PCR-TTGE et la PCR-T-RFLP. Des chantillons de sol et de racines ont t prlevs sur le dispositif exprimental de Feucherolles
(78) entre septembre2004 et octobre2006, et plus prcisment sur des parcelles Tmoin sans azote (-N), Tmoin fertilis (T+N), avec
apport de compost dordures mnagres rsiduelles avec fertilisation (OMG+N), et apport de compost de dchets verts et boue et
fertilisation (DVB+N). Les analyses de la structure des diffrentes communauts tant effectues par diffrentes techniques et par trois
laboratoires diffrents, une validation inter-laboratoires a t ncessaire. Le principe de chacune de ces techniques, leur application aux
chantillons prlevs sur le site de Feucherolles et une synthse des rsultats obtenus sont prsents. La structure des communauts
bactriennes et fongiques dpend de la mthode dextraction dADN utilise et du laboratoire qui fait lanalyse. Cependant, les extraits
dADN obtenus avec les diffrentes mthodes dextraction permettent daboutir la mme conclusion quant la discrimination des
traitements. Les rsultats montrent que les communauts bactriennes et fongiques du sol du site de Feucherolles semblent assez
stables et peu influences par les traitements (OMR+N, DVB+N, T+N), ou que leffet des traitements est masqu par dautres effets
comme un effet temporel ou une variabilit spatiale.
Mots cls
Bactrie, champignon, mycorhize arbuscules, ADN, sol, structure molculaire des communauts microbiennes, TTGE, T-RFLP,
compost, boue, amendement organique.

Reu: mai 2009; Accept: septembre 2009 tude et Gestion des Sols, Volume 16, 3/4, 2009 - pages 299 312
300 C. Leyval et al.

SUMMARY
IMPACT OF ORGANIC AMENDMENTS ON MICROBIAL COMMUNITY STRUCTURE IN SOIL:
Choice of methods, validation, and results
The analysis of microbial (bacterial and fungal) community structure in soil can be used to evalutate the ecosystem ability to cope with
changes in environmental parameters. The objective of the present study was to assess the impact of different residual organic matter
(PRO) amendments on a field site (Feucherolles, 78) on microbial (bacterial and fungal, including mycorrhizal) community structure in
soil, using two DNA analysis techniques: PCR-TTGE and T-RFLP. Soil and root samples were collected on the field experimental site
at Feucherolles (78) between september 2004 and october 2006, on fertilized control plots (T+N), non fertilized control (T-N), plots with
urban waste compost and fertilization (OMG+N) and plots with green compost and sludge and fertilizationz (DVB+N). Since microbial
community structures were analysed using different techniques and were performed by three different laboratories, an inter-laboratory
validation was performed. The principle of both techniques, results of the interlaboratory validation, and a selection of the results obtained
with the soil samples from Feucherolles are presented. Bacterial and fungal community structure differed with the DNA extraction and
analytical method and with laboratories. However, the conclusions about the effect of the treatments were comparable. Results showed
that bacterial and fungal communitites on Feucherolles site were rather stable and not influenced by the treatments (OMG+N, DVB+N,
T+N), or that their effects was overwhelmed by temporal and spatial variations.
Key-words
Bacteria, fungi, arbuscular mycorrhizas, DNA, soil, molecular structure of microbial communities, TTGE, T-RFLP, compost, sludge,
organic amendment.

RESUMEN
IMPACTO DE ENMIENDAS ORGNICAS SOBRE LA ESTRUCTURA DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS DE LOS SUELOS:
Eleccin de mtodos, validacin y resultados
El anlisis de las comunidades microbianas y fngicas presentes en un suelo puede permitir evaluar la capacidad de los ecosistemas
a contestar a cambios de condiciones ambientales. El estudio presentado aqu tena como objetivo estimar el impacto de productos
residuales orgnicos (PRO) de naturaleza diferente sobre la estructura de las comunidades microbianas en los suelos (bacterianas y
fngicas, incluyendo hongos micorrizianos) usando dos tcnicas de anlisis del ADN extrado de los suelos: la PCR-TTGE y la PCR-T-
RFLP. Se tomaron muestras de suelo y de races en el dispositivo experimental de Feucherolles (78) entre Septiembre 2004 y Octubre
2006, y ms precisamente sobre las parcelas testigo sin nitrgeno (-N), testigo fertilizado (F+N), con aporte de compost de basuras
domesticas residuales con fertilizacin (OMG+N), y aporte de compost de desechos verdes y lodos y fertilizacin (DVB+N). Como los
anlisis de la estructura de las diferentes comunidades se efectuaron por diferentes tcnicas y por tres laboratorios diferentes, una
validacin inter-laboratorios fue necesaria. Se presenta el principio de cada tcnica, su aplicacin a las muestras tomadas en el sitio de
Feucherolle y una sntesis de los resultados obtenidos. La estructura de las comunidades bacterianas y fngicas depende del mtodo
de extraccin del ADN usado y del laboratorio que hace el anlisis. Sin embargo, los extractos de ADN obtenidos con los diferentes
mtodos de extraccin permiten llegar a la misma conclusin en cuanto a discriminacin de los tratamientos. Los resultados muestran
que las comunidades bacterianas y fngicas del suelo del sitio de Feucherolles parecen bastante estables y poco influenciadas por los
tratamientos (OMG+, DVB+N, T+N), o que el efecto de los tratamientos est encubierto por otros efectos como un efecto temporal o
una variabilidad espacial.
Palabras clave
Bacterias, hongos, micorrizas arbusculares, ADN, suelo, estructura molecular de las comunidades microbianas, TTGE, T-RFLP, compost,
lodo, enmiendas orgnicas.

Etude et Gestion des Sols, 16, 3/4, 2009


Impact damendements organiques sur les communauts microbiennes des sols 301

L
es sols sont des rservoirs de microorganismes, dont communauts affectes et selon la nature des amendements
les interactions avec les constituants minraux et organiques (Edel-Hermann et al., 2008; Prez-Piqueres et al.,
organiques conditionnent le fonctionnement des cycles 2006). Lanalyse des communauts bactriennes et fongiques
biogochimiques. Actuellement, les sols sont de plus en plus prsentes dans un sol peut, plus gnralement, permettre
influencs par des activits anthropiques dorigines diverses, dvaluer les modifications des cosystmes en rponse des
agricoles, urbaines, industrielles, et deviennent des rcepteurs de changements de conditions environnementales (Kiikkila et al.
polluants varis. La prsence de ces composs potentiellement 2001; Lejon et al., 2008).
toxiques dans les sols des concentrations parfois trs Dans le cadre du programme Qualiagro, des produits
leves peut avoir des consquences non ngligeables sur les rsiduaires organiques (PRO) de natures diffrentes ont t
organismes et, par voie de consquence, sur le fonctionnement apports sur le site de Feucherolles (78) et leur impact sur les
biologique des sols. Cet effet des polluants sur les organismes qualits agronomiques des sols a t valu. Sur la base dun
mrite dtre prcis et tudi, et la rponse de la microflore plan exprimental en blocs comprenant des parcelles tmoins,
pourrait tre utilise comme indicateur de la qualit biologique des pandages de composts dordures mnagres rsiduelles
des sols (Janvier et al., 2007). (OMR) sur certaines parcelles et de composts de dchets verts
Dans le sol, les bactries et les champignons participent au plus boues dpuration (DVB) sur dautres parcelles ont t
droulement des cycles biogochimiques et aux processus de raliss en octobre2004 (Houot et al., 2009).
dcomposition, la transformation et au transport de la matire Une approche microbiologique est cependant ncessaire
organique, la mobilit et au transfert sol-plante des lments pour complter les donnes agronomiques. En rponse
nutritifs, mais aussi des polluants. Ces microorganismes ont lappel projets sur les Bioindicateurs de lADEME, lobjectif de
un rle central dans le fonctionnement des cosystmes et la prsente tude tait dvaluer limpact de ces amendements
constituent un rservoir gntique important. Les champignons sur la structure des communauts bactriennes et fongiques
mycorhiziens, qui vivent en symbiose avec les racines de la dans les sols et des champignons mycorhiziens dans les
majeure partie des espces vgtales, amliorent la croissance racines en utilisant deux techniques molculaires danalyse
des plantes et les protgent en conditions de stress (attaques de de lADN extrait des sols: la PCR-TTGE (Polymerase Chain
pathognes, stress hydrique, prsence de polluants) (Smith et Reaction -Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis)
Read, 1997; Leyval et al., 1997; Leyval et Binet, 1998), sont aussi et la PCR-T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length
des partenaires importants de la qualit biologique des sols et Polymophism). Ces techniques sont appliques lanalyse de la
des systmes sol-plante. structure des communauts bactriennes et des communauts
Les microorganismes dans leur ensemble sont des fongiques par lutilisation damorces spcifiques des diffrents
organismes cls du fonctionnement des cosystmes et sont groupes microbiens. Ces analyses ont t ralises sur des
les premiers touchs dans le cas dune contamination des sols prlvements effectus dans les diffrentes parcelles (4 blocs)
ou des eaux. Lvaluation des risques cotoxicologiques lis avant lpandage, 2 mois aprs lpandage et rgulirement
aux intrants dorigine anthropique sur la qualit des sols repose ensuite pendant 2 ans afin de mesurer travers la rponse
souvent sur le suivi dun groupe bactrien particulier utilis de la microflore la rsistance et la rsilience du sol cette
comme indicateur (Brandt et al. 2006), de mesures dactivit perturbation. La technique de TTGE a t utilise par la Plate-
globales (Saison et al., 2009) ou de profils physiologiques de Forme technologique Agrosystmes (IUT de Colmar) pour
communauts bactriennes (Viti et al., 2008), plus rarement sur tudier la structure des communauts bactriennes, et par le
la prise en compte de lensemble du microbiota que les auteurs LIMOS (Nancy Universit CNRS) pour tudier la structure des
rduisent trop souvent aux seules communauts bactriennes communauts fongiques et mycorhiziennes. La technique de
(Boivin et al., 2006; Lazzaro et al., 2006; Zabaloy et al., 2008). T-RFLP a t utilise par le Laboratoire de Microbiologie du Sol
Par ailleurs, le risque cotoxicologique est valu par rapport et de lEnvironnement et Gochimie des Sols (INRA, Universit
lutilisation de pesticides (Centofanti et al., 2008) ou de de Bourgogne) pour tudier la structure des communauts
pollution dorigine industrielle (Wilke et al., 2008). Le caractre bactriennes et fongiques.
cotoxicologique de produits rsiduaires organiques est en Les analyses ayant t effectues dans trois laboratoires
gnral tudi en relation avec le devenir dune matire active diffrents, une tape de validation inter-laboratoires pralable
particulire (Vieubl-Gonod et al, 2007) mais leffet global des techniques a t ncessaire. Les rsultats de cette
de diffrents types de produits rsiduaires organiques sur le intercalibration sont prsents et discuts ainsi quune partie des
microbiota de sols agricoles est beaucoup moins mesur. A rsultats obtenus sur lensemble de ltude.
linverse, la plus value attendue damendements organiques
divers apports des sols agricoles a suscit le dveloppement
de mthodes permettant de mesurer leur impact sur lensemble
du biota et a rvl des effets variables selon la ractivit des

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CHOIX DES MTHODES UTILISES dtecter des mutations ponctuelles dans des squences
dADN humain avant dtre applique, par Muyzer et al. (1993),
(PRINCIPES, AVANTAGES ET ltude de la diversit microbienne. Dans ce cadre dtude, les
INCONVNIENTS) fragments dADNr amplifis par PCR partir dADN extrait du
sol sont soumis une lectrophorse dans un gel dacrylamide
Lapproche retenue pour lanalyse de la structure et la
dont la temprature augmente progressivement au cours de la
diversit des communauts microbiennes du sol est une
migration. Le principe de la TTGE consiste utiliser ce gradient
approche molculaire qui permet de saffranchir du caractre
de temprature pour modifier la mobilit lectrophortique
cultivable ou non de ces microorganismes (Prosser, 2002). La
des fragments dADN (figure1). En effet, laugmentation de
premire tape de cette approche consiste extraire et purifier
la temprature dnature partiellement lADN bicatnaire et
lADN prsent dans le sol. LADN extrait sert ensuite de matrice
ralentit, voire arrte, sa migration dans le gel. La temprature
pour lamplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) de
de dnaturation dun fragment dADN dpend de sa squence
fragments de gnes codant lADN ribosomique (ADNr)(16S
nuclotidique et conditionne par consquent sa localisation
bactrien, 18S ou ITS (Internal Transcribed Spacer) fongiques).
dans le gel la fin de la migration. Pour viter une dnaturation
Ltape damplification par PCR permet dobtenir un mlange
complte des fragments dADN, la PCR est ralise avec une
de molcules dADN de tailles voisines mais de squences
amorce clampe, qui consiste ajouter 35 40 bases G et C
nuclotidiques diffrentes. Une des manires danalyser les
son extrmit 5. Cette technique permet en thorie de sparer
amplicons dADN ribosomique obtenus partir dchantillons
des fragments dADN diffrents dune paire de base (Miller et al.,
environnementaux consiste les cloner et les squencer. De
nos jours, bien que le squenage soit devenu plus routinier, 1999).
lanalyse de milliers de clones reste une tche assez lourde, Lanalyse des profils de bandes (nombre, localisation) obtenus
laborieuse et coteuse. Cest pourquoi plusieurs techniques pour chaque chantillon environnemental permet de comparer
alternatives, comme la TTGE ou la T-RFLP permettant de sparer rapidement la structure des communauts microbiennes de ces
ces amplicons, ont t dveloppes. chantillons. De plus, les bandes du gel peuvent tre excises,
r-amplifies par PCR, pour squencer lADN prsent dans ces
bandes et identifier lespce microbienne par comparaison aux
La TTGE banques de donnes de squences.
La TTGE consiste raliser une sparation lectrophortique La TTGE, comme la DGGE (Denaturing Gradient Gel
de fragments dADN base sur des diffrences de squences Electrophoresis) o la dnaturation est ralise non pas par un
nuclotidiques. Cette technique a dabord t utilise pour gradient de temprature mais par un gradient de dnaturants

Figure 1: Reprsentation
schmatique de la procdure
danalyse par TTGE (Temporal
Temperature Gradient Gel
Electrophoresis) de fragments
dADN amplifis par PCR laide
dune amorce clampe et
spars par lectrophorse dans
un gradient de temprature.
Figure 1: Graphical presentation
of the TTGE (Temporal
Temperature Gradient Gel
Electrophoresis) analytical
procedure of DNA fragments
amplified with clamp primers
and separated on temperature
gradient electrophorese.

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Impact damendements organiques sur les communauts microbiennes des sols 303

chimiques, est une technique qui permet de comparer de manire par PCR de lADNr 16S, ou de lADNr 18S en utilisant un couple
rapide, reproductible, simultane et peu coteuse un grand damorces spcifiques de chacune de ces communauts. Une
nombre dchantillons environnementaux (Muyzer, 1999). Cette des deux amorces de chaque couple est marque son extrmit
technique est particulirement adapte lanalyse de populations par un compos fluorescent. Les produits damplification sont
microbiennes et permet de suivre leur volution en fonction du ensuite soumis une digestion par une enzyme de restriction,
temps ou des variations des conditions environnementales gnrant des fragments de restriction terminaux fluorescents
(Muyzer et Smalla, 1998). Cependant, comme de nombreuses de diffrentes tailles, en fonction des squences dADNr des
mthodes molculaires, la TTGE dpend grandement de microorganismes prsents dans la communaut analyse (Liu
lefficacit et de la qualit de ltape dextraction et de purification et al., 1997; Marsh et al., 2000). Les fragments de restriction
de lADN du sol. Cette technique ne permet de mettre en vidence terminaux fluorescents sont spars en fonction de leur taille sur
que les espces les plus abondantes et elle peut prsenter un squenceur capillaires. La communaut microbienne est
galement certaines limitations dues au fait quune bande ne caractrise par la taille des fragments qui la composent ainsi
reprsente pas ncessairement une seule espce (co-migration) que par leur intensit mesure par la hauteur des pics. Lanalyse
(Gelsomino et al., 1999) o quun mme microorganisme puisse T-RFLP fournit ainsi une valuation semi quantitative de la
gnrer plusieurs bandes (plusieurs copies dADNr lgrement
structure de la communaut en rvlant labondance relative des
diffrentes) (Gelsomino et al., 1999; Maarit-Niemi et al., 2001).
composantes de cette communaut.
Cette mthode trs sensible a t dveloppe pour rvler la
La T-RFLP structure des communauts bactriennes des environnements
Lanalyse dADNr par T-RFLP permet de caractriser naturels ou anthropiss (Moeseneder et al., 1999; Braker et
des communauts bactriennes ou fongiques en rvlant al., 2001). Des efforts mthodologiques ont ensuite permis
le polymorphisme de longueur des fragments de restriction de proposer cette approche pour caractriser galement la
terminaux de la rgion dADNr cible pour chacune de ces structure des communauts fongiques (Lord et al., 2002; Edel-
communauts (figure2). La mthode implique une amplification Hermann et al., 2004) et galement celle dautres composantes

Figure 2: Reprsentation schmatique de la procdure danalyse par T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)
du polymorphisme de longueur des fragments de restriction terminaux de squences dADN amplifies par PCR laide dune amorce
marque par un fluorochrome et digres par une enzyme de restriction (daprs Gruntzig et al., 2002).
Figure 2: Graphical presentation of the T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) procedure for analysis of length
polymorphism of terminal restriction DNA fragments after PCR amplification with fluorochrome labelled primer and digestion with
restriction enzyme (after Gruntzig et al., 2002).

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du biota comme les protozoaires et les nmatodes (Edel- prlvement. Ces prlvements de terre (chantillon moyen
Hermann et al., 2008). Cette approche permet en particulier partir de plusieurs sous-chantillons) ont t tamiss 2mm et
dapprcier la dynamique dvolution de ces structures sous homogniss sur place, rpartis en flacons de 150g (3 flacons
linfluence de facteurs externes, l encore naturels ou dorigines par laboratoire et par chantillon). Ils ont t congels le plus
anthropiques (Prez-Piqueres et al., 2006), et ventuellement rapidement possible et envoys congels aux trois laboratoires.
didentifier les groupes microbiens associs ou impliqus
dans la rponse de la microflore (Marschner et al., 2003;
Nagashima et al., 2003; Suzuki et al., 2005). Lidentification des
Validation inter-laboratoires
microorganismes par squenage et recherche dhomologie Lchantillonnage et la conservation des chantillons avant
dans des banques de squences nest cependant pas possible analyse sont des tapes cruciales pour la validit des rsultats
directement et ncessite une tape de clonage (Marsh, 1999; de celle-ci. Lanalyse de la structure des communauts
Mengoni et al., 2002). Enfin, une surestimation de la diversit microbiennes par les deux techniques mentionnes a t
est possible si la digestion par les enzymes de restriction est effectue sur un chantillon moyen par parcelle. Compte tenu
incomplte, et les rsultats sont difficilement comparables si les des diffrences entre les protocoles dextraction des diffrents
enzymes de restriction sont diffrentes. laboratoires, protocoles dj homogniss et dj valids au
Outre son niveau de rsolution important, la T-RFLP ralise niveau de chaque laboratoire, et des diffrentes techniques
sur squenceur capillaires fournit des donnes numriques danalyse de lADN extrait, une validation inter-laboratoires sest
qui constituent une base de donnes dans laquelle sont stocks rvle ncessaire. Elle a t ralise partir des 3 chantillons du
tous les profils permettant des comparaisons dchantillons 2e prlvement (T1) (T+N205, OMR301 et DVB201). Elle a consist
issus danalyses indpendantes ou de prlvements raliss au en une extraction en triplicat, par chacun des 3 laboratoires
cours du temps. impliqus dans ltude, de lADN des trois chantillons, reus
congels, suivie de lanalyse des communauts microbiennes
dans ces extraits, ainsi que dans les extraits provenant des
deux autres laboratoires, reus prcipits dans lthanol.
MATRIEL ET MTHODES Chaque laboratoire a donc analys 27 chantillons (3 extraits x
3 laboratoires x 3 rplicats) par ses propres techniques: PCR-
TTGE au LIMOS et lUHA et PCR-T-RFLP au MSE.
Echantillons de terre analyss
Les chantillons de sol et de racines ont t prlevs sur le
dispositif exprimental de Feucherolles entre septembre2004 et Extraction dADN du sol
octobre2006 (Houot et al., 2009). Les analyses ont port sur des Lextraction de lADN du sol est une tape dlicate et
chantillons de terre de 3 parcelles diffrentes (pour Tmoin) ou dterminante pour le succs des techniques danalyse des
de 4 parcelles diffrentes pour les 3 autres traitements, soit au communauts microbiennes, comme la TTGE et la T-RFLP. Il
total 15 parcelles de sol. Les parcelles taient plantes avec du existe un grand nombre de mthodes publies pour extraire lADN
mas en 2005 et du bl en 2006. Le code de ces parcelles est (Braid et al., 2003; Fortin et al., 2003; Griffith et al., 2000) souvent
indiqu ci-dessous entre parenthses. adaptes un type dtudes, mais il nexiste pas de mthode
T-N: Tmoin sans azote (208, 309, 410) universelle et les biais relatifs aux procdures dextraction ont
T+N: Tmoin fertilis (102, 205, 303, 404) t mis en vidence (Martin-Laurent et al., 2001). Or la nature de
OMR+N: Apport de compost dordures mnagres rsiduelles lenvironnement do sont prlevs les chantillons peut varier et
+fertilisation (103, 202, 301, 405) ncessiter des ajustements mthodologiques. La comparaison
DVB+N: apport de compost de dchets verts et boue +fertilisation des rsultats obtenus pour diffrents chantillons par lune ou
(104, 201, 305, 401) lautre de ces mthodes nest possible que si les protocoles
Le calendrier de prlvement des chantillons et la nomenclature des utiliss, depuis lextraction de lADN du sol jusqu la sparation
dates sont les suivants: des fragments, sont identiques pour tous ces chantillons.
Prlvement Date du prlvement Dans le cadre de ce travail, deux protocoles dextraction
T0 1/09/2004 Avant le 1er pandage dADN diffrents, dvelopps et employs par les diffrents
T1 28/10/2004 2 mois aprs lpandage laboratoires, ont t utiliss pour les analyses par TTGE et
T2 12/04/2005 7 mois aprs lpandage T-RFLP. Ces protocoles diffrents ont t volontairement
T3 14/06/2005 9 mois aprs lpandage conservs, sans souci dhomognisation, pour la comparaison
T4 17/10/2005 13 mois aprs lpandage relative des diffrents chantillons amends ou non en PRO.
T5 1/09/2006 24 mois aprs lpandage
T6 21/10/2006 2 mois aprs un 2e pandage Pour la TTGE, le protocole dextraction dADN de sol,
A chacune des 7 dates, les 15 parcelles ont fait lobjet dun selon le protocole de Corgi et al. (2004) a consist librer

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Impact damendements organiques sur les communauts microbiennes des sols 305

lADN prsent dans un chantillon (0,5g) par agitation en Analyse par TTGE
prsence de 0,8ml de tampon dextraction et de billes de
Pour lanalyse des champignons prsents dans les
verre de tailles diffrentes. Ce tampon dextraction contenait
sols, le fragment dADN cibl fait partie de lADNr 18S.
du PVPP (polyvinylpolypyrrolidone) et du CTAB afin de piger
Le fragment analys par TTGE est le produit de 2 PCR
une partie des contaminants organiques co-extraits avec successives. La premire PCR utilise les amorces MH2 et
lADN. A lissue de cette tape, lADN extrait, en solution dans MH4 (Vandenkoornhuyse et Leyval, 1998) dont les squences
le tampon, a t purifi par sparation de phase en prsence sont: MH2: 5-TTCGATGGTAGGATAGAGG-3 et MH4:
dun mlange phnol/chloroforme/alcool isoamylique, suivie 5-GTCTCACTAAGCCATTC-3. La seconde PCR (PCR
dune prcipitation en prsence disopropanol. Le culot dADN niche) est ralise partir des produits de la premire PCR
est sch puis resuspendu dans 100l de tampon. LADN et utilise les amorces GC-MH2 (amorce MH2 additionn
ainsi obtenu a t ensuite analys par lectrophorse sur gel dun GC-clamp) et TTGE 2 dont la squence est: TTGE2:
dagarose afin dvaluer sa quantit et sa qualit et a servi de 5-ATCCTAGAAACCAACAAAATA-3. Aprs avoir vrifi
matrice pour lamplification par PCR. la qualit et la quantit des amplicons ainsi obtenus par
Pour la T-RFLP, lextraction a t ralise partir dun lectrophorse sur gel dagarose, ces amplicons (550 pb) sont
gramme de sol selon la mthode dcrite par Edel-Hermann et al. analyss par TTGE. La TTGE est ralise sur gel dacrylamide
(2004). Lextraction est ralise par agitation du sol en prsence 6 % en conditions partiellement dnaturantes (6 M dure).
de 4ml de tampon dextraction (Tris, EDTA, NaCl, SDS) et de La migration est ralise 130V entre 54,5C et 59C raison
billes de verre de tailles diffrentes, suivie dune prcipitation en de 0,7C.h-1. Aprs coloration au bromure dthidium, une image
prsence disopropanol puis de passages successifs sur deux digitale du gel est ralise. Grce cette image, la prsence et
colonnes de compositions diffrentes (PVPP puis Spharose la position des bandes sur le gel dlectrophorse sont notes
4B). Ces tapes aboutissent lobtention dune suspension et analyses. Les rsultats sont prsents par une analyse en
contenant lADN total mais galement de nombreuses composantes principales (ACP).
impurets dorigine tellurique. Dans le cas des chantillons Pour lanalyse des champignons mycorhiziens prsents dans
du sol de Feucherolles, une purification en deux temps sest les racines de mas prleves en 2005, le fragment dADN cibl
avre absolument ncessaire ce stade de la procdure. fait galement partie de lADNr 18S et est aussi le produit de
La suspension bruntre dADN a t dabord passe sur 2 PCR successives. Le gel dacrylamide et les conditions de
une colonne de PVPP qui retient les substances humiques migration de la TTGE sont les mmes que celles utilises pour
contenues dans la suspension. Cette tape de purification a t les champignons prsents dans le sol.
rpte. Puis lluat a t pass sur une colonne Geneclean Pour lanalyse des bactries prsentes dans les sols, le
qui adsorbe l'ADN et permet d'liminer les impurets restantes. fragment dADN cibl fait partie de lADNr 16S. Le fragment
L'ADN a t ensuite lu avec un tampon, quantifi sur gel analys par TTGE est le produit dune seule PCR. Cette
d'agarose par comparaison une gamme d'ADN de thymus de PCR utilise les amorces GC-968f (Feslke et al., 1998) (968f
veau et aliquot (5ng/l) pour tre conserv -20C. additionn dun GC-clamp) et 1401r (Heuer et al., 1999) dont
les squences sont: 968f : 5-AACGCGAAGAACCTTAC-3 et
1401r: 5-CGGTGTGTACAAGACCC-3. Comme prcdemment,
Analyse des champignons mycorhiziens aprs avoir vrifi la qualit et la quantit des amplicons ainsi
dans les racines obtenus par lectrophorse sur gel dagarose, ces amplicons
Au printemps 2005, les parcelles exprimentales du site (475 pb) sont analyss par TTGE. La TTGE est ralise sur gel
de Feucherolles ont t cultives avec du mas. Au temps T3 dacrylamide 6 % en conditions partiellement dnaturantes (8
M dure). La migration est ralise 145V entre 57C et 63C
(juin2005, 9 mois aprs pandage) et T4 (octobre2005, 13
raison de 0,7C.h-1. Aprs coloration au bromure dthidium, une
mois aprs pandage), 3 chantillons de racines par parcelle
image digitale du gel est ralise. La prsence et la position des
ont t prlevs et stocks 20C. LADN gnomique vgtal
bandes sur le gel dlectrophorse ont t notes et analyses.
et fongique prsent dans ces chantillons a t extrait laide
dun kit dextraction commercial (Qiagen). Un fragment de lADN
ribosomique 18S des champignons mycorhiziens arbuscules Analyse par T-RFLP
prsents dans lextrait a t amplifi par PCR grce aux amorces Cette technique a t utilise avec succs pour prciser,
AM1 et NS31 (Helgason et al., 1998) et analys par PCR-TTGE dans deux tudes diffrentes, limpact dapports de matires
(Sonjak et al., 2009). La prsence et la position des bandes sur organiques sur la qualit phytosanitaire de sols agricoles (Perez-
le gel dlectrophorse ont t notes et analyses. Les rsultats Piqures et al., 2006; Steinberg et al., 2004). Elle a montr
sont prsents par une analyse en composantes principales lintrt de prendre en compte simultanment la rponse des
(ACP). communauts bactriennes et des communauts fongiques

Etude et Gestion des Sols, 16, 3/4, 2009


306 C. Leyval et al.

pour proposer des hypothses quant leurs rles respectifs Analyse des donnes par ACP
dans la suppression de certaines maladies dues des
Les donnes de TTGE (prsence/absence des bandes) et de
champignons phytopathognes dorigine tellurique.
T-RFLP (pics) ont t analyses par Analyse en Composantes
Pour les champignons, lADNr 18S est cibl. Deux amorces Principales (ACP) partir de matrices de covariance. La
ont t utilises, dont une est marque en 5 avec le Dye structure gntique de la communaut microbienne rvle par
Beckman D3 (Proligo). Ces amorces sont: nu-SSU-0817-5 (F): l'analyse TTGE ou T-RFLP d'un chantillon est reprsente par
5-(D3)-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3 (R = G ou A) et nu- la projection d'un point sur un plan factoriel. La position relative
SSU-1536-3 (R): 5-ATTGCAATGCYCTATCCCCA-3 (Y = C ou T) des points reprsentatifs des diffrents chantillons permet
(Borneman et Hartin, 2000). Des problmes defficacit de PCR d'apprcier la variabilit entre les rptitions et les diffrences
dADNr 18S partir de lADN du sol de Feucherolles ont conduit ventuelles entre les traitements.
modifier la procdure de T-RFLP initialement dveloppe,
en utilisant comme amorce marque avec le fluorochrome
D3 lamorce sens nu-SSU-0817-5 et non pas lamorce RSULTATS
rverse nu-SSU-1536-3 (Edel-Hermann et al., 2004). Pour les
bactries, la mme procdure est utilise mais les amorces
sont: 27F: 5-(D3)-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 et 1392R: Validation inter-laboratoires
5-ACGGGCGGTGTGTACA-3. La russite de lamplification est Lanalyse en composantes principales des communauts
vrifie par lectrophorse en gel dagarose. Lexcs damorces fongiques prsentes dans les chantillons utiliss lors de la
et autres soluts prsents peut perturber lanalyse ultrieure validation inter-laboratoires montre une bonne reproductibilit
du polymorphisme et ncessite une purification sur colonnes des rptitions selon le laboratoire au sein duquel lextraction
MinElute (Qiagen). Les produits de PCR purifis sont quantifis des acides nucliques a t ralise (Colmar, Dijon ou Nancy)
sur gel dagarose par comparaison une gamme de Smart (figure 3a). Pour les diffrents traitements analyss (T+N,
Ladder (Eurogentec) pour rpondre aux conditions ncessaires OMG+N et DVB+N), la plus grande discrimination est observe
la digestion par une enzyme de restriction (HaeIII dans le cas de pour les extraits provenant de Dijon. Dans le cas des chantillons
lADNr 16S des bactries, et MspI dans le cas de lADNr 18S des provenant de Colmar et Nancy, mme si cette discrimination est
champignons). Le choix de lenzyme de restriction utilise a t moins forte, elle tend sparer les trois traitements OMG+N, T+N
effectu sur la base dune comparaison de squences dADNr et DVB+N pour Colmar, et discriminer OMG des deux autres
pour chacun des groupes de microorganismes (Edel-Hermann traitements Nancy. Toutefois, on observe un recouvrement
et al., 2004). A lissue de la phase de digestion, les chantillons de certains chantillons provenant de traitements diffrents et
sont prcipits, repris dans un tampon, et analyss laide du dorigines diffrentes comme les chantillons DVB+N-Nancy
squenceur capillaires CEQTM 2000XL (Beckman Coulter) et T+N-Colmar par exemple. Lanalyse des communauts
en prsence d'un standard de taille interne (size standard fongiques des mmes chantillons par PCR-T-RFLP (figure 3b)
600 Beckman). Ils sont dposs dans une plaque de 96 puits a aussi montr une bonne rptabilit entre les 3 rptitions dun
adapte au squenceur. Chaque analyse comprend un multiple mme chantillon obtenues avec la mme mthode dextraction,
de 8 chantillons dposs dans une colonne de la plaque. Les mais une structure des communauts diffrente en fonction
de la mthode dextraction. Concernant les communauts
produits de la digestion d'un chantillon sont distribus dans 3
bactriennes, une bonne rptabilit entre les rptitions a t
puits pour pallier l'ventuel dfaut d'annotation d'un pic par le
galement observe (donnes non prsentes). En revanche,
squenceur, problme rencontr lorsqu'il y a abondance de pics
les rsultats ne sont pas reproductibles, sans doute parce
(polymorphisme important au sein de la communaut analyse).
quen plus de leffet exprimentateur ou laboratoire, les
Le squenceur fournit un lectrophorgramme reprsentant conditions danalyse des chantillons diffrent. Ainsi, lanalyse
les pics du standard et les pics de l'chantillon analys (figure2). de lensemble des donnes montre une discrimination des
Chaque pic reprsente des fragments d'une longueur donne, chantillons en fonction du laboratoire qui a fait lextraction
dtermine en comparaison au standard, et leur abondance aussi bien quen fonction des traitements et ne permet pas de
relative est rvle par l'intensit de fluorescence compare conclure quant leffet des traitements.
la fluorescence totale.
Des outils d'analyse des donnes ont t dvelopps sous
Excel pour prendre en compte la variabilit lie au problme
Analyse de la structure de la communaut
d'annotation des pics trs nombreux obtenus dans le cas des fongique dans le sol
chantillons du sol de Feucherolles pour la caractrisation de la Les rsultats obtenus par TTGE sont prsents (figure 4). Aux
structure gntique des communauts bactriennes. diffrents temps de prlvement, au total 19 espces diffrentes

Etude et Gestion des Sols, 16, 3/4, 2009


Impact damendements organiques sur les communauts microbiennes des sols 307

Figure 3: Analyse en composantes principales de la structure Figure 4: Analyse en composantes principales de la


de la communaut fongique estime par a) PCR-TTGE et b) structure de la communaut fongique du sol de Feucherolles
T-RFLP lors de la campagne de validation inter-laboratoires. estime par PCR-TTGE, regroupant les donnes de tous les
Figure3: Principal component analysis of fungal community traitements et tous les temps de prlvements.
structure estimated by a) PCR-TTGE and b) T-RFLP within the Figure 4: Principal component analysis of fungal community
inter-laboratory validation. structure in Feucherolles soil estimated by PCR-TTGE, taking
into account the data of all treatments and all sampling dates.
a Axe2 : 19,80 %

Axe2 : 18,48 %
n)
jo

Tmoin
T moin+
+NN (Dijon)
i
(D

Axe2 : 19,80 % (Dijon)


N

Axe2 : 18,48 %
B+

DVB+N (Dijon)
DV

) ar)
(Colm
Colmar DV
DVB+N (
DVB+N B+DVB+N (Nancy)
N(
Na
OMR+N n(Nancy) cy
)
Tmoin+N (Colmar)
Axe 1 : 27,20 % OM
R+ Tmoin+N (Nancy)
N(
Na OMR+N (Dijon) Axe 1 : 18,78 %
nc
y)
OM
R+
N
(D
ijo
n)

OMR+N (Colmar)
T0
T1
T2
T3
T4
T5
T6
DV

b
B+
N
(N
an
cy
)

ar) note, par rapport au T0, un dplacement des chantillons vers


olm
(C
DVB+N (Dijon) B+
N la droite suite lpandage (T1), puis un regroupement de ceux
DV
) Axe 1 : 34,80 %
correspondant aux chantillons de 2005 (T2, T3, T4), ensuite une
Tmoin+N (Dijon) ncy volution (entre T3, T4 et T5) vers les chantillons de 2006, avec
(Na cy)
+N (Nan
oin +N
cette fois un effet moins net du nouvel pandage (T6 par rapport
Tm OMR+N (Colmar) OMR

OM
T5). Si les rsultats de lanalyse faite par T-RFLP ne sont pas
R+
N(
Dij
strictement les mmes, en revanche leur analyse conduit aux
Tmoin+N (Colmar) on
) mmes conclusions (donnes non prsentes).

Analyse de la structure de la communaut


Axe2 : 14,50 %

bactrienne dans le sol


En ce qui concerne la communaut bactrienne, des
conclusions similaires ont t obtenues, que lanalyse de la
communaut ait t ralise par TTGE ou par T-RFLP, et par
lun ou lautre des laboratoires. Les analyses ralises sur les
de champignons ont t dtectes dans les chantillons de diffrents prlvements, dont un exemple obtenu par T-RFLP
sol et entre 6 et 12 espces selon les chantillons. Lanalyse est prsent (figure 5), montrent une structuration de la
des donnes de chaque prlvement ne montre pas de communaut bactrienne dans le temps (P < 0,001) mais pas de
discrimination claire entre les chantillons des diffrents diffrenciation des traitements tmoins et amends.
traitements. Le regroupement de lensemble des donnes
de tous les traitements et de tous les temps de prlvements
sur une mme ACP fait cependant apparatre une volution
temporelle de la structure de la communaut fongique. Ainsi, on

Etude et Gestion des Sols, 16, 3/4, 2009


308 C. Leyval et al.

Figure 5: Analyse en composantes principales de la structure Figure 6: Analyse en composantes principales de la structure
de la communaut bactrienne du sol de Feucherolles de la communaut de champignons mycorhiziens, dans les
estime par PCR-T-RFLP, regroupant les donnes de tous les racines de mas prleves sur le site de Feucherolles aux
traitements et tous les temps de prlvements. temps T3 et T4 et estime par PCR-TTGE.
Figure 5: Principal component analysis of bacterial community Figure 6: Principal component analysis of the community
structure in Feucherolles soil estimated by PCR-T-RFLP, taking structure of mycorrhizal fungi in maize roots sampled in
into account the data of all treatments and all sampling dates. Feucherolles soil at T3 and T4 and estimated by PCR-TTGE.
Axe2 : 10,10 %

Axe 1 : 36,97 %
Axe 1 : 25,80 %

T0
T1
T2
T3

Axe 2 : 20,87 %
T4
T5
T6
juin
octobre

Analyse de la structure de la communaut de


champignons mycorhiziens dans les racines (TTGE, T-RFLP) et par la mme technique mene dans
des laboratoires diffrents. On peut constater que les trois
de mas par TTGE rptitions (trois extractions dADN) dun mme chantillon
Aux deux temps de prlvement, entre 5 et 8 espces de donnent des rsultats souvent trs proches, voire identiques
champignons mycorhiziens ont t dtectes dans les racines de en termes de structure des communauts, quelle que soit
mas avec une moyenne de 5 espces par chantillon pour ceux la technique dextraction ou le laboratoire concern, et quil
rcolts au mois de juin et une moyenne de 6 pour ceux du mois sagisse des bactries ou des champignons. Toutefois, pour
doctobre. La comparaison de la structure de la communaut dautres chantillons, on note des diffrences plus importantes
mycorhizienne observe montre que celle-ci est trs proche entre les rptitions, ce qui dune part souligne les limites de la
pour un temps de prlvement quel que soit le traitement tudi mthode et incite raliser systmatiquement des rptitions
(figure 6). Ainsi, les rsultats montrent surtout une discrimination techniques et dautre part suggre une htrognit de
de la structure de la communaut mycorhizienne en fonction la structure des communauts bactriennes lchelle de
de la saison. Des groupes semblent discrimins en fonction de lchantillon (0,5 1g de sol).
laxe horizontal, mais ils ne correspondent pas des traitements Toutefois, cette tude montre que les rsultats obtenus avec
ou des rptitions particuliers. les diffrentes techniques dextraction dacides nucliques
partir du sol, utilises dans diffrents laboratoires, peuvent
tre sensiblement diffrents, et ne peuvent pas tre compars
directement. En revanche, les rsultats obtenus par un
DISCUSSION
laboratoire partir dune technique dextraction conduisent
La campagne de validation inter-laboratoires a permis i) aux mmes conclusions que celles obtenues dans un autre
dapprhender lhtrognit des chantillons, la rptabilit laboratoire utilisant dautres techniques. Ainsi, dans le cas
et la reproductibilit des techniques dveloppes, ii) de prsent, les rsultats obtenus dans chacun des laboratoires
comparer les rsultats obtenus par diffrentes techniques utilisant ses propres techniques permettent de discriminer de

Etude et Gestion des Sols, 16, 3/4, 2009


Impact damendements organiques sur les communauts microbiennes des sols 309

manire comparable diffrentes communauts microbiennes par des substances organiques comme les hydrocarbures
et aboutissent des conclusions identiques. aromatiques polycycliques (HAP) (Norini, 2007).
Aucune rponse de la microflore aux amendements En revanche, les structures gntiques des communauts
organiques na t mise en vidence dans cette tude, quelle bactriennes et fongiques voluent dans le temps, et ceci
que soit la technique employe, quil sagisse des bactries ou pendant les deux annes dtude. Ce facteur temps qui
des champignons incluant les champignons mycorhizognes. conditionne la structuration des communauts microbiennes
Par contre, les structures gntiques des communauts peut tre li aux variations saisonnires (conditions climatiques),
bactriennes et fongiques voluent dans le temps, et ceci pendant mais galement aux cultures, ainsi quaux pratiques lies ces
les deux annes dtude. Il apparat clairement que lanalyse de cultures (Stark et al., 2007). Il est galement possible que les
la structure des communauts microbiennes est un rvlateur doses apportes rgulirement au sol (tous les 2 ans) soient
du comportement du biota dans le sol mais que la causalit des peu perturbatrices en regard de ces autres facteurs exognes.
variations est difficile identifier dans lagro-cosystme. Cest Par ailleurs, ltude sest inscrite dans une dynamique initie
pourquoi les rsultats relatifs aux communauts microbiennes plusieurs annes auparavant. Un effet perturbateur court
doivent tre associs ceux de paramtres agronomiques terme (0-6 mois) des diffrentes MO, souvent rapport (Prez
des parcelles. Des analyses statistiques de type corrlations Piqueres et al., 2006; Valarini et al., 2003), a pu se produire lors
multiples, co-inerties devraient permettent didentifier les des premiers apports mais disparatre ensuite. Ainsi, la rponse
paramtres pouvant jouer le rle dindicateurs, mais il est certain des communauts microbiennes aux diffrents apports pourrait
que cest dun ensemble de paramtres que cette notion peut se tre plus rapide (de lordre du mois) et transitoire.
dgager et non pas dun seul.
Les rsultats montrent que les communauts bactriennes et
fongiques du sol du site de Feucherolles semblent stables et peu CONCLUSIONS
influences par les traitements (OMR+N, DVB+N, T+N), ou que
leffet des traitements est masqu par dautres effets comme Dveloppement considrable des outils de biologie
un effet temporel ou une variabilit spatiale. Les techniques molculaire, depuis plusieurs dcennies, a permis daccder
de PCR-TTGE et de PCR-T-RFLP utilises ici ne permettent aux microorganismes prsents et actifs dans les sols et
de suivre que les espces ou populations microbiennes non plus seulement aux microorganismes cultivables. Les
majoritairement reprsentes dans les chantillons. Ce travail techniques comme la TTGE et la T-RFLP sont des mthodes
montre donc que les amendements utiliss ici ne perturbent pas sensibles, informatives et pertinentes qui permettent de
ces populations dominantes dans ces sols, mais il est possible comparer la structure des communauts microbiennes dans
que des espces peu reprsentes le soient par ailleurs. En diffrents environnements complexes afin dvaluer linfluence
effet, des rsultats similaires obtenus sur des sols agricoles en de stress sur ces communauts. Plus gnralement, elles
Autriche (tude portant sur 12 ans) montrent que la structure ouvrent des perspectives pour le monitoring des communauts
des communauts bactriennes analyse par DGGE ne semble microbiennes en relation avec les proccupations relatives
pas affecte par la nature des composts, incluant des PRO, lagriculture durable, la qualit des sols et aux questions
apports alors que le profil physiologique de ces communauts, environnementales. Associes des techniques de clonage-
analys par la mthode Biolog, ltait de manire significative squenage, elles permettent galement didentifier des
(Ros et al., 2006). Pour expliquer plus clairement le rle des groupes microbiens plus directement associs , ou impliqus
PRO sur le fonctionnement biologique du sol, et pour identifier dans, le fonctionnement biologique du sol (Benitez et al., 2007;
dventuels indicateurs microbiens de limpact de ces PRO, il Lu et al., 2006). Ces groupes microbiens pourraient tre des
apparat ncessaire de cibler les populations non dominantes indicateurs de la qualit des sols.
ou de cibler des communauts fonctionnelles, par exemple Il faut souligner toutefois que toutes ces techniques
celles associes la dcomposition des diffrentes matires prsentent des biais quil faut prciser et prendre en compte
organiques ou la biodgradation de composs particuliers dans linterprtation des rsultats. Par ailleurs, une tape
apports dans les amendements en utilisant par exemple dcisive reste lchantillonnage et la reprsentativit de
les puces ADN (Danon et al., 2008; Franke-Whittle et al., lchantillon analys. Le rendement dextraction dADN par les
2009). On peut galement supposer que des pandages avec diffrentes mthodes utilises doit aussi tre dtermin pour
des amendements qui imposent des contraintes plus fortes obtenir des rsultats comparables et quantitatifs. Si un certain
modifieraient de manire plus importante ces communauts nombre de protocoles dextraction dADN ont dj t publis,
du sol. Avec la mme mthode danalyse de la communaut et si des kits dextraction sont commercialiss, lextraction
fongique, des modifications importantes de la structure de dADN dun sol prcis, en particulier dun sol contamin, reste
cette communaut ont ainsi t observes dans le cas de sols une tape cruciale et ncessite souvent une mise au point
provenant de friches industrielles avec des pollutions massives spcifique.

Etude et Gestion des Sols, 16, 3/4, 2009


310 C. Leyval et al.

Dans cette tude, et dans les limites des mthodes BIBLIOGRAPHIE


employes, aucune rponse de la microflore bactrienne,
Benitez, M. S., Tustas, F. B., Rotenberg, D., Kleinhenz, M. D., Cardina, J.,
fongique et mycorhizienne aux amendements organiques na Stinner, D., Miller, S. A., and Gardener, B. B. M. 2007- Multiple statistical
t mise en vidence. Par contre, les structures molculaires approaches of community fingerprint data reveal bacterial populations
des communauts bactriennes et fongiques voluent dans le associated with general disease suppression arising from the applica-
temps au cours des deux annes dtude, et il faut souligner tion of different organic field management strategies. Soil Biology &
la cohrence des conclusions obtenues avec les diffrentes Biochemistry, 39, pp. 2289-2301.
approches et avec les diffrents groupes microbiens. On peut Boivin M. E. Y., Greve G. D., Kools S. A. E., van der Wurff A. W. G., Leeflang
P., Smit E., Breure A. M., Rutgers M., and van Straalen N. M., 2006 -
ainsi considrer lanalyse de la structure des communauts Discriminating between effects of metals and natural variables in
microbiennes comme un rvlateur du comportement du biota terrestrial bacterial communities. Applied Soil Ecology, 3, pp.103-113.
dans le sol mais la causalit des variations est difficile identifier Borneman J., Hartin R.J., 2000 - PCR primers that amplify fungal rRNA genes
dans lagro-cosystme. Cest pourquoi les rsultats relatifs aux from environmental samples. Appl. Environ. Microbiol., 66, pp. 4356-
communauts microbiennes doivent tre associs ceux relatifs 4360.
aux paramtres agronomiques et abiotiques des parcelles. Braid M. D., Daniels L. M., Kitts C. L. , 2003 - Removal of PCR inhibitors from
soil DNA by chemical floculation. Journal of Microbiology Methods, 52,
pp. 389-393.
Braker G., Ayala-Del-Rio H.L., Devol A.H., Fesefeldt A., Tiedje J.M., 2001 -
REMERCIEMENTS Community structure of denitrifiers, Bacteria, and Archaea along redox
gradients in Pacific Northwest marine sediments by terminal restriction
Les auteurs remercient Veolia environnement R&D et
fragment length polymorphism analysis of amplified nitrite reductase
lADEME pour leur soutien ce projet. (nirS) and 16S rRNA genes. Appl. Environ. Microbiol., 67, pp. 1893-1901.
Brandt K. K., Petersen A., Holm P. E., and Nybroe O., 2006 - Decreased
abundance and diversity of culturable Pseudomonas spp. populations
with increasing copper exposure in the sugar beet rhizosphere. Fems
Microbiology Ecology 56, pp. 281-291.
Centofanti T., Hollis J. M., Blenkinsop S., Fowler H. J., Truckell I., Dubus I.
G., and Reichenberyer S., 2008 - Development of agro-environmental
scenarios to support pesticide risk assessment in Europe. Science of the
Total Environment, 407, pp. 574-588.
Corgie S.C., Beguiristain T., Leyval C. 2004 - Spatial distribution of bacterial
communities and phenanthrene degradation in the rhizosphere of Lolium
perenne L. Appl. Environ. Microbiol., 70, pp. 3552-3557.
Danon M., Franke-Whittle I. H., Insam H., Chen Y. and Hadar Y., 2008 -
Molecular analysis of bacterial community succession during prolonged
compost curing. Fems Microbiology Ecology, 65, pp. 133-144.
Dice LR., 1945 - Measures of the amount of ecologic association between
species. Ecology, 26, pp. 297-302.
Dickie I.A., Xu B. and Koide R.T., 2002 - Vertical niche differentiation of
ectomycorrhizal hyphae in soil as shown by T-RFLP analysis. New
Phytol., 156, pp. 527-535.
Edel-Hermann V., Dreumont C., Perez-Piqueres A., Steinberg C., 2004 -
Terminal restriction fragment length polymorphism analysis of ribosomal
RNA genes to assess changes in fungal community structure in soils.
Fems Microbiol. Ecol., 47, pp. 397-404.
Edel-Hermann V., Gautheron N., Alabouvette C., and Steinberg C., 2008 -
Fingerprinting methods to approach multitrophic interactions among
microflora and microfauna communities in soil. Biology and Fertility of
Soils, 44, pp. 975-984.
Felske A., Akkermans A. D. L. and De Vos W. M., 1998 - Quantification of
16S rRNA in complex bacterial communities by multiple competitive
reverse transcription-PCR in temperature gradient gel electrophoresis
fingerprints. Applied and Environmental Microbiology, 64, pp. 4581-4587.
Fortin N., Deaumier D., Lee K., Greer C. W., 2003 - Soil washing improves the
recovery of total community DNA from polluted and high organic content
sediments. J. Microbiol. Methods, 56, pp. 181-191.
Franke-Whittle I. H., Knapp B. A., Fuchs J., Kaufmann R. and Insam H., 2009
- Application of COMPOCHIP microarray to investigate the bacterial
communities of different composts. Microbial Ecology, 57, pp. 510-521.

Etude et Gestion des Sols, 16, 3/4, 2009


Impact damendements organiques sur les communauts microbiennes des sols 311

Gelsomino A., Keijzer-Wolters A.C., Cacco G., van Elsas J.D., 1999 - Assement microbial community analysis. Appl. Environ. Microbiol., 66, pp. 3616-
of bacterial community structure in soil by polymerase chain reaction and 3620.
denaturing gradient gel electrophoresis. J. Microbiol. Methods, 38, pp. Marsh T.L.,1999 - Terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP):
1-15. an emerging method for characterizing diversity among homologous
Griffiths R.I., Whiteley A.S., ODonnell A.G., Bailey M.J., 2000 - Rapid method populations of amplification products. Current Opinion in Microbiology,
for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis 2, pp. 323-327.
of ribosomal DNA and rRNA based microbial community composition. Martin-Laurent F., Philippot L., Hallet S., Chaussod R., Germon J.C., Soulas G.,
Appl. Environ. Microbiol., 66, pp. 5488-5491. Catroux G. , 2001 - DNA extraction from soils: Old bias for new microbial
Grntzig V., B. Stres, H. L. Ayala del Ro, and J. M. Tiedje, 2002 - Center for diversity analysis methods Appl. Environ. Microbiol. 67, pp. 2354-2359.
Microbial Ecology, Michigan State University, East Lansing, Michigan, Mazzola M. , 2004 - Assessment and management of soil microbial community
48824, http://rdp8.cme.msu.edu/html/t-rflp_jul02.hml structure for disease suppression. Annual Review of Phytopathology, 42,
Helgason T., Daniell T.J., Husband R., Fitter A.H., Young J.P.W. , 1998 - pp. 35-59.
Ploughing up the wood-wide web ? Nature, pp. 394-431. Mengoni A., Grassi E., Bazzicalupo M., 2002 - Cloning method for taxonomic
Heuer H., Hartung K., Wieland G., Kramer I. and Smalla K., 1999 - Polynucleotide interpretation of T-RFLP patterns. Biotechnique,s 33, pp. 990-992.
probes that target a hypervariable region of 16S-RNA genes to identify Miller K.M., Ming T.J., Schulze A.D., Withler R.E., 1999 - Denaturing Gradient
bacterial isolates corresponding to bands of community fingerprints. Gel Electrophoresis (DGGE): a rapid and sensitive technique to screen
Applied and Environment Microbiology, 65, pp. 1045-1049. nucleotide sequence variation in populations. BioTechniques, 27, pp.
Houot S., Cambier Ph., Benoit P., Deschamps M., Jaulin A., Lhoutellier C. et 1016-1030.
Barriuso E., 2009 - Effet dapports de composts sur la disponibilit de Moeseneder M.M., Arrieta J.M., Muyzer G., Winter C., Herndl G.J., 1999 -
micropolluants mtalliques et organiques dans un sol cultiv. Etude et Optimization of terminal-restriction fragment length polymorphism
Gestions des Sols, vol. 16/3-4, 255-274 analysis for complex marine bacterioplankton communities and
Janvier C., Villeneuve F., Alabouvette C., Edel-Hermann V., Mateille T. and comparison with denaturing gradient gel electrophoresis. Appl. Environ.
Steinberg C., 2007 - Soil health through soil disease suppression: which Microbiol., 65, pp. 3518-3525.
strategy from descriptors to indicators? Soil Biology & Biochemistry, 39, Muyzer G. Waal E.C.D. and Uitterlinden A.G., 1993 - Profiling of complex
pp. 1-23. microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis
Kiikkil, O., Perkimki, J., Barnette, M., Derome, J., Pennanen,T., Tulisalo, E., of polymerase chain reaction-amplified gene coding for 16S rRNA. Appl.
Fritze, H., 2001 - In situ bioremediation through mulching of soil polluted Environ. Microbiol., 59, pp. 695-700.
by a copper-nickel smelter. J.Environ. Qual., 30, pp.1134-1143. Muyzer G., 1999 - DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural
Lazzaro, A., Hartmann, M., Blaser, P., Widmer, F., Schulin, R. and Frey B., 2006. ecosystems. Current Opinion in Microbiology, 2, pp. 317-322.
Bacterial community structure and activity in different Cd-treated forest Muyzer G., Smalla K., 1998 - Application of denaturing gradient gel
soils. Fems Microbiology Ecology, 58, pp. 278-292. electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis
Lejon D. P. H., Martins J. M. F., Leveque J., Spadini,L., Pascault, N., Landry, D., (TGGE) in microbial ecology. Antonie van Leeuwenhoek, 73, pp. 127-141.
Milloux, M. J., Nowak, V., Chaussod, R., and Ranjard, L. 2008 - Copper Nagashima K., Hisada T., Sato M., Mochizuki J., 2003 - Application of new
dynamics and impact on microbial communities in soils of variable primer-enzyme combinations to terminal restriction fragment length
organic status. Environmental Science & Technology, 42, pp. 2819-2825. polymorphism profiling of bacterial populations in human feces. Appl.
Leyval C., Binet P., 1998 - Effect of polyaromatic hydrocarbons (PAHs) in soil Environ. Microbiol., 69, pp. 1251-1262.
on arbuscular mycorrhizal colonization of plants. J. Environ. Qual., 27, Norini M.P., 2007 - Ecodynamique des hydrocarbures aromatiques
pp. 402-407. polycycliques (HAP) et des communauts microbiennes dans des sols
Leyval C., Turnau, K., Haselwandter K., 1997 - Interactions between heavy pollution mixte (HAP, mtaux) avant et aprs traitement par biopile et par
metals and mycorrhizal fungi in polluted soils: physiological, ecological dsoprtion thermique: influence de la rhizosphre et de la mycorhization.
and applied aspects. Mycorrhiza, 7, pp. 139-153. Thse de doctorat de Nancy Universit, 243 pages.
Liu W.-T., Marsh T.L., Cheng H., Forney L.J., 1997 - Characterization of Prez-Piqueres A., Edel-Hermann V., Alabouvette C. and Steinberg C. 2006 -
microbial diversity by determining terminal restriction fragment length Response of soil microbial communities to compost amendments. Soil
Biology & Biochemistry, 38, pp. 460-470.
polymorphisms of genes encoding 16S rRNA. Appl. Environ. Microbiol.,
63, pp. 4516-4522. Prosser J. I., 2002 - Molecular and functional diversity in soil micro-organisms.
Plant and Soil, 244, pp. 9-17.
Lord N.S., Kaplan C.W., Shank P., Kitts C.L., Elrod S.L., 2002 - Assessment
of fungal diversity using terminal restriction fragment (T-RF) pattern Ranjard L., Lejon D.P.H., Mougel C., Schehrer L., Merdinoglu D. Chaussod R.,
analysis: comparison of 18S and ITS ribosomal regions. FEMS Microbiol. 2003 - Sampling strategy in molecular microbial ecology: influence of
Ecol., 42, pp. 327-337. soil sample size on DNA fingerprinting analysis of fungal and bacterial
communities. Environ. Microbiol. 5, pp. 1111-1120.
Lu Y. H., Rosencrantz D., Liesack W., and Conrad R., 2006 - Structure and
activity of bacterial community inhabiting rice roots and the rhizosphere. Rasmussen L.D., Ekelund F., Hansen L.H., Sorensen S.J., Johnsen K., 2001 -
Environmental Microbiology, 8, pp. 1351-1360. Group-specific PCR primers to amplify 24S -subunit rRNA genes from
kinetoplastida (protozoa) used in denaturing gradient gel electrophoresis.
Maarit-Niemi R., Heiskanen I., Wallenius K. and Lindstrom K., 2001 - Extraction
Microbiol. Ecol. , 42, pp. 109-115.
and purification of DNA in rhizosphere soil samples for PCR-DGGE
analysis of bacterial consortia. J. Microbiol. Methods, 45, pp. 155-165. Ros M., Klammer S., Knapp B., Aichberger K. and Insam H., 2006 - Long-
term effects of compost amendment of soil on functional and structural
Marschner P., E. Kandeler, B. Marschner. , 2003 - Structure and function of the
diversity and microbial activity. Soil Use and Management, 22, pp. 209-
soil microbial community in a long-term fertilizer experiment. Soil Biol.
218.
Biochem., 35, pp. 453-461.
Saison C., Waller N. J., Kumar A. and Kookana R. S., 2009 - Effects of
Marsh T.L., Saxman P., Cole J. Tiedje, J., 2000 - Terminal restriction fragment
thiobencarb in combinations with molinate and chlorpyrifos on selected
length polymorphism analysis program, a web-based research tool for

Etude et Gestion des Sols, 16, 3/4, 2009


312 C. Leyval et al.

soil microbial processes. Journal of Environmental Science and Health


Part B-Pesticides Food Contaminants and Agricultural Wastes, 44, pp.
226-234.
Sheppard S.K., McCarthy A.J., Loughnane J.P., Gray N.D., Head I.M., Lloyd
D., 2005 - The impact of sludge amendment on methanogen community
structure in an upland soil. Appl. Soil Ecol., 28, pp. 2 147-162
Smith SE, Read D J., 1997 - Mycorrhizal Symbiosis. San Diego, Academic Press
Sonjak S, Beguiristain T., Leyval C. and Regvar M., 2009 - Temporal temperature
gradient gel electrophoresis (TTGE) analysis of arbuscular mycorrhizal
fungi associated with selected plants from saline and metal polluted
environments. Plant and Soil, 314, pp. 25-34.
Stark C., Condron L. M., Stewart A., Di H. J. and OCallaghan M., 2007 -
Influence of organic and mineral amendments on microbial soil properties
and processes. Applied Soil Ecology, 35, pp. 79-93.
Steinberg C., Edel-Hermann V., Guillemaut C., Prez-Piqueres A., Singh P.
and Alabouvette C., 2004 - Impact of organic amendments on soil
suppressiveness to diseases. In Multitrophic interactions in soil and
integrated control, edited by R. A. Sikora, S. Gowen, R. Hauschild and S.
Kiewnick: IOBC wprs Bulletin / Bulletin OILB srop, pp. 259-266.
Suzuki C., Kunito T., Aono T., Liu C.T., Oyaizu H., 2005 - Microbial indices of soil
fertility. J. Appl. Microbiol., 98, pp. 1062-1074.
Vandenkoornhuyse P, Leyval C. 1998 - SSU rDNA sequencing and PCR-
fingerprinting reveal genetic variation within Glomus mosseae. Mycologia,
90, pp. 791-797.
Vieuble-Gonod L., Benoit P., Cohen N. and Houot S., 2007 - Spatial heterogeneity
of soil microorganisms and isoproturon degrading activity in a tilled soil
in relation to urban waste composts application. Environmental fate and
ecological effects of pesticides, pp. 37-44.
Viti C., Quaranta D., de Philippis R., Corti G., Agnelli A., Cuniglio R. and
Giovannetti L., 2008 - Characterizing cultivable soil microbial communities
from copper fungicide-amended olive orchard and vineyard soils. World
Journal of Microbiology & Biotechnology, 24, pp. 309-318.
Wilke B. M., Riepert F., Koch C., and Kuhne T., 2008 - Ecotoxicological
characterization of hazardous wastes. Ecotoxicology and Environmental
Safety, 70, pp. 283-293.
Zabaloy M. C., Garland J. L. and Gomez M. A., 2008 - An integrated approach,
to evaluate the impacts of the herbicides glyphosate, 2,4-D and
metsulfuron-methyl on soil microbial communities in the Pampas region,
Argentina. Applied Soil Ecology, 40, pp. 1-12.

Etude et Gestion des Sols, 16, 3/4, 2009