BIOLOGA MOLECULAR

DOGMA CENTRAL DE LA
BIOLOGIA MOLECULAR

Replicacin

Transcripcin Traduccin

ADN ARN Protena

Transcripcin
inversa
Replicacin

Francis Crick (1958/1970)

 P P P OH

H2C O
T A H2C O

P P

H2C O
Grupo fosfato C G H2C O
Mlecula de
O
-O
P P P ADN carga
O O negativa!
H2C O
A T H2C O

3 P P ... 2 de abril de
1953, Molecular
Structure of
5 H2C O
G Nucleic Acids.
C H2C O
A Structure for
2 : Deoxyribose
OH de P P P Nucleic Acid.
s ox Nature 171: 737.
i
J. D. WATSON and F. H. C. CRICK
3 REPLICACIN DEL ADN
Cadena
lagging
Horquilla de
replicacion

5
3
3


5
5
3

Cadena leading
ENZIMAS:

* Helicasa + prot. SSB, desenrolla ADN doble cadena:

* Primasa (ARNpol; dnaG), fragm. ARN 10 pb :
* ADN replicasa: DNApol III, sntesis (sub. , polC, dnaE).
* DNApol I: actividad exonucleasas 3 5 proof reading + 5 3.
* ADN ligasas:
4 TRANSCRIPCIN

ARN Ribosomal

ADN RNApol ARN Mensajero Protena

ARN Transferencia

INICIACIN rpoA: ensamblado enz.,

reconocimiento del Pr,
activadores
Promotor ARN
rpoB
catlisis
rpoC

rpoD: especificidad
del Promotor
4 TRANSCRIPCIN

REGIN PROMOTORA

Codificante upstream downstream

- 35 - 10 +1: Inicio ARN

5
3
Templado 5
17 bp 7 bp

TTGACA TATAAT
4 TRANSCRIPCIN
TERMINACIN

ARN

A Ter. Intrnsecos B Rho-dependiente

5 50-90 pb;
loop
hairpin G-C C, G
stem +
UUUUUU
Rho
5 -UUU

REGIN TERMINADORA
 6 TRADUCCIN

RIBOSOMA
ARNr 23S (2904 pb) + 5S,
50S
31 protenas diferentes
70S
66% ARNr 30S ARNr 16S
21 protenas diferentes

5
+1

30 nucletidos

AAACAGGAGG (10 nuc) AUGUCGAAGCAA

GUG
UUG Regin
Shine-Dalgarno
codificante
(RBS) Iniciacin
3

GUC GU G UGGAGG AAU

A
U C CC GU
GA A UU
AU U G 5
U UUA AAA
UGA GCG UUUAUG - - - - - C A
UAG
AAA UAC
UAA UUU

Sitio P

Sitio A Transpeptidacin

Canal de
salida
3

UGA
5
UAG CGC UA A
C U AA
UAA
G GG
CA

U
A
A
COOH

CAG

U UU
UA
C

A
Plegamiento AA

NH2
7 MARCO ABIERTO DE LECTURA = ORF

5-UCCAUGCAACAUGGAUGCGAU. RNAm

5-UCC AUG CAA CAU GGA UGC GAU .

5-UC CAU GCA ACA UGG AUG CGA U .

5-U CCA UGC AAC AUG GAU GCG AU .

AUG UGA
5-UCCAUGCAACAUGGAUGCGAUGUCGAAGUAUUGACUAA...
AUG
1 AUG
MLA (ORF)

2 AUG AUG UGA L

3 AUG UAA L
7 ORFS ARNm es policistrnico Genes

ARN
Promotor pol

RBS
ARNm

BACTERIAS Transcripcin Sin Vida Sin

+ proteccin 2 min. procesamiento
Traduccin posterior
+
Degradacin
GENETICA MICROBIANA
8 MUTACIONES

PUNTUALES:

5T A C
A T G5
REPLICACION
NORMAL
MUTACIONES
ADN

AAC
TTG
TAG
ATC
TAT
ATA
TAC
ATG
Alelos
TRANSCRIPCION
codn AAC codn UAG codn UAU codn UAC
ARN Asparagina Stop Tirosina Tirosina

TRADUCCION
Mutacin Mutacin Mutacin
PROTEINA MISSENSE NONSENSE SILENCIOSA
WILD TYPE
8 MUTACIONES

REARREGLOS: Insercin de ADN exgeno

ORF

INSERTO

Interrupcin ORF: Interrupcin promotor:

- Protena quimera: funcionalidad? - Modificacin nivel de expresin:

- Protena trunca expresin?
- Expresin de protena del inserto
 8 MUTACIONES REARREGLOS: Delecin de ADN

ELEMENTO MOVIL ORF

Escisin

ELEMENTO MOVIL ORF

Eliminacin ORF: Duplicacin ORF

- Perdida de funcionalidad
 9 GENOTIPO Y FENOTIPO

GENOTIPO: informacin gentica FENOTIPO: caractersticas o propiedades

de un organismo observables de un organismo,
resultantes de su genotipo.

Genotipo relevante: diferencias con

el organismo wild-type
lacZ LacZ-: no fermenta galactosa
hisC1 HisC-: no sintetiza histidina
rpsL StrR: resistente a streptomicina

recA RecA-: incapaz de recombinar

MUTACION: cambio heredable en la

MUTANTE: organismo cuyo genoma
secuencia de bases del genoma de
posee una mutacin.
un organismo.
10 REVERSIONES
Mutante por
l eci n delecin
De

Cepa salvaje
o wild type Insercin Delec
Mutante por in
insercin
Revertante
verdadera
n
a le
u ntu io
n p sit

ci smo
t a i
Mutacin Mu el m
puntual
Mutacin
Mutante por supresora Revertante
sustitucin 2 sitio
 11 ADQUISICIN DE ADN EXGENO: TRANSFORMACIN

Uptake Recombinacin
de ADN Homologa
ADN Cepa Cepa
desnudo COMPETENTE TRANSFORMANTE

Alelo R
(exgeno)

Alelo S
(bacteriano)

RecA

Recombinante
(gen en mosaico)
12 ADQUISICIN DE ADN EXGENO: Genoma viral
TRANSDUCCIN
Bacterifagos: Cpside

Cola

Ciclo ltico

Receptor

Lisis bacteriana
Multiplicacin

Ciclo lisognico

Inyeccin

Induccin
Duplicacin
Integracin bacteriana
13 ADQUISICIN DE ADN EXGENO: CONJUGACIN

Genes relacionados con la Plsmidos ADN circular (ds)

movilidad = MOB o Dtr extra-cromosommico
(DNA-transfer replication) autoreplicativo (replicasa)
heredable
B
MO Replicasa
R
ep

Genes relacionados con la

conjugacin/apareamiento =
P F MPF (mating pair formation)
M
ss-ADN
Receptor

Cepa DADORA Cepa ACEPTORA

Cepa DADORA Cepa TRANSCONJUGANTE

13 ADQUISICIN DE ADN EXGENO: CONJUGACIN
Movilizacin de plsmidos MOB oriT + Relaxasa
- oriT = Origen de transferencia
B - Relaxasa = Reconoce oriT en cis
MO
T4CP
T4CP = Protena de acoplamiento
F tipo IV
MP
B
MO
T4SS MPF 12-30 genes
- T4SS = Sistema de secrecin
tipo IV

No movilizable No movilizable
(sin modulo MOB o
MOB funcional)
Movilizable

Conjugativo
oriT relaxasa T4CP T4SS
MOB MPF
13 ADQUISICIN DE ADN EXGENO: CONJUGACIN

- Extracromosmico: autoreplicativo y heredable

- Tamao variable: 2-300 Kb
- Numero de copias variable: 1-200 copias/clula
(bajo-medio-alto) (xej. ColE120 copias)

Plsmidos - Rango de hospedador: amplio o acotado

Caractersticas - Incompatibilidad: ms de 20 grupos de INC
- Distintas funciones: rutas metablicas, factores de
virulencia, genes de resistencia
- Baja frecuencia de perdida de plsmido (<10-7 cl)
- Sistemas veneno/antdoto (plsmidos R1)
- Plsmidos movilizables < plsmidos conjugativos
(genes MPF)
13 ADQUISICIN DE ADN
EXGENO: CONJUGACIN

Transposones conjugativos
- ADN lineal, inserto en cromosoma o
plsmido.
- Distintas funciones: rutas metablicas,
factores de virulencia, genes de
resistencia
- x ej: Tn916, Tn5397
 14 RECOMBINACIN

HOMOLOGA
Secuencias homologas de
larga extensin

SITIO ESPECFICA
Secuencias especfica Fago
(fagos, transposon)
Fago

TRANSPOSICIN Tn
Insercin en una secuencia
sin homologa
(secuencias de insercin,
transposones)
Tn
 Molculas de ds-ADN
14 RECOMBINACIN con secuencias
HOMLOGA homlogas

Corte en una hebra de

ADN en cada duplex
homlogo (nicked)

Intercambio de hebras
cortadas con el otro
duplex homlogo

Desplazamiento del
punto de intercambio

2 corte en la misma hebra 2 corte en la otra hebra

Intercambio y
desplazamiento
Ligacin del 2 punto de
de nicks recombinacin.
Ligacin de
nicks

Genoma no Genoma
recombinante pero con recombinante
regin heteroduplex reciproco
15 ELEMENTOS MOVILES Secuencias de Insercin (IS) o
Transposon simple
Repeticiones invertidas

Transposasa
1234567
1234567

ATGCCTAGT
TACGGATCA
IS se insertan en: Secuencia Target
~ 9 bp
- secuencia especfica Se generan
- sitios calientes repeticiones directas
- al azar

ATGCCTAGT ATGCCTAGT
Transposasa
1234567
1234567
TACGGATCA TACGGATCA
 Transposones Compuestos (Tn)
GENES FLANKEADOS
POR DOS SECUENCIAS DE INSERCION(IS)

IS en igual direccin IS GENES IS

IS en direccin invertida IS GENES IS
*Si ambos ISs son iguales pueden
ser los 2 o solo 1 funcional
TET, CMP,
Gen resistencia KAN, AMP

No funcional AATTC
TTAAG

IS10L Transposasa Resolvasa TetR IS10R Tn10

 Transposones Compuestos (Tn)
Transposicin
Replicativa: Duplicacin del Tn, No-replicativa / Conservativa: El Tn
copia en sitio original y nuevo se mueve de un sitio a otro sin dejar
(Transposasa + Resolvasa) copia en sitio original (Transposasa)

Tn Tn

Tn

Tn Tn
 Tn1546
ORF1 ORF2 vanR vanS vanH vanA vanX vanY vanZ

IRL IRR

GTTAA

Tn1546

GTTAA ORF1 ORF2 vanR vanS vanH vanA vanX vanY vanZ GTTAA

IRL IRR
ORF1: Posible Transposasa
ORF2: Posible Resolvasa
IRs: 38bp caracteristicas de Tn3
Sitios res: 12bp repetidas en region intergenica de ORF1 y ORF2
vanA = vanR (Activador Transcripcion), vanS (Reg Negativo de la Transcripcion), vanH
(Deshidrogenasa), vanA (Ligasa), vanX (D,D-dipeptidasa), vanY (D,D-Carboxipeptidasa), vanZ (R Teico)

ORF1, ORF2, vanY, vanZ 29-37% GC

Distintos origenes
vanS, vanR, vanH, vanA, vanX 41-45% GC
16 REGULACIN GENICA: INDUCCIN TRANSCRIPCIN

Factores externos

- Sustratos
- Factores ambientales

Activacin de factores de transcripcin:

- Fosforilacin del FT
- Activacin por unin al sustrato

Factores internos
- Metabolitos enzimticos

Activacin de factores de transcripcin:

- Activacin por unin al sustrato
 16 REGULACIN GENICA
Operador
Gen regulatorio
lacZ lacY lacA
Pr Pr
Pr Operon lac

Regulador + LacZ LacY LacA

(represor)
LacI (-)

Presencia de
triptfano Operador

E D C B A
Pr Operon trp
+
Represor inactivo
E D C B A Biosntesis de
(-) triptfano

No se expresa
operon triptfano
Represor
activo
 Regulacin ciclos ltico y
lisognico del fago
Lambda

OL/PL OR/PR PR

Head Tail Recomb Replic Lys

cl