‘Congresa Internacional Biologia, Quimica y Agronomia \GENETIC DIVERSITY ANALYSIS IN VARIETIES OF ROSELLE (+ibizcus sanaariffe L| BY CYPSSO MARKERS |anilicc de Diverides Gendtice de Vacincndes de ioica (Mibzcussobcerff L| Medinnte Marcadores ves) -ejonaro Rubio Mesgarejo , atoisés Cortés-cruc™, Maria wise Macnuce Sincnes!, ues maniee ‘sdnienaz Herrers', volnttin apetingan Palamina Hermosito® “centro secional de Recurso: GendticssNiFar/ Boulevers ee 8 Binciversiana Ne. 400, Tepatitén ee Morelos CP. 67600, sizeo * universigns Autdnams de Nyert, programs ae Fozeracs an Ciencia: Sialbgies agropecueras (CSAP) / ‘Ciuc ae ts Cutturs “Amsdo Nerva"Tepie, Mayert. México, CP. 63455 Tes (343) 281 3500. ‘autor que prezenté ettras. “sautor para corespendencis: cortez moizes(Binitep. g50.ms rea dei Conocimiente: Agriotecnalogit. ABSTRACT Aszele crop (sibizeur zebaariqt Lit orginary trom atrcs, selangs to the wimnscese emily sree ccutivated in 5 stter of Mesien. Curent tusies of razete varieties zrow matte genesc civersity ic the vrezut of natural crosses ang seiection. However, in Mexico, tare I 8 mck of information regsrcing ‘veratal isenttiention, papumtion siverstyanc genatic ructure altncugn there sre some studies ssout rosea, they enly incase tew sompies or citverent Hibizeus species, Cenzivering is, ene main _sbjemtve of te present work i to estimate anc cnaracterite tne zenatic aiversty of varieties of rozeie ccutivates in Mesito using molecular markers gerives tram cytoenreme Paha (CrPsS0). Genamie ONA ‘wer optsined using s mocities CTAS methos tam Wophilzed lest tazue trom 63 citterent secession: ‘rom naysrt, Guerrero, Coims ang PusDIS. The respective mslecuier ansbysis wes pertarmes using two sdifterent primer combinations, CYPLALF/CYP2BER and CYFLBEF/CYPLALR oy PCR. PCR product: were vrarolved by vertical electrophoresis on 6s polyacrylamide gels and stnined with silver nitrate. The basic genetic civervty parameters and princizalcoorsinate ansiyis(FCaA) were performed with Gecdlgs 6.3 software. Phylagenstic reiwGonzhigs were calculates using Neightor-Joining (Nl) with MEGA 22 safbware. Resuts chawed 100 % of polymorphizm, and AZO Ne’s Diversity inex. Tic valve muggest moderate to high genetic diversity, in comparizon with other previous studies (0.303, uring AFLP’: markers}. Te PCA identited four main groups (frst theee coordinate: explain 74.76 % of variston). ‘The Nel grouped two different main custers each one with two subgroups. These chicters alow the identification of the parental lines far the Nayarit suirgroup, by placing them on the spaciite ends of ‘the Gendogram, while the other materia chowed na grouping tend to identity paretar: Nayart materia, placing them at opposite ridez of dendrogram whie the rest of the materia: chowed no \prouping trend. keywords: Hiniseur soneaniga L gytomnrome P&%0; genetic civersty: principe! csorainates, AESUMEN Eleurive ae samaies (Hibirus scaaripa (| ex riginars oe diics, sertenece ain femiia Mawseene. ER snuesre plz, es curiveas en 13 estesor oe is Replies. is siversioss gendtics presente en issCongress Intenacione! Biologia,Quimica y Agronomia ‘varegades actualmente utifzedes ect dads principsiments por crusemientos metursies y 22 ‘sbstante enizte un vacis en is isent#iencién varietal, ectucins cosre aiversisea y ertructurs gendtice ce Ins mismas. Aunque existen algunos estudios a nivel internscional, el nimero de muestras ublizads ha igo limitego 9 se men enforace en ctr: expecie: oe Hibiscus. Por tal motive, er materario eztimar Is diversided genftice de las variedades de Jamaica mediante mercadore: molecwiares. €l objetivo de! prevents tmsajo tur corsctariver is siversigss gendtice oe iss variessaes ce lamsics curves: en México con maraadores derivedes del citocrome #439 (CVFS30]. $e incyysron 63 acceciones origineriac ‘de Noysrit, Guerrera, Colima y PUEDE. £1 DNA gendmice se cotuvo 8 partir de tejie foliar fofiizeco mediante el métoda de CTAB modificado. Fore el andlsis moleculer 2 utilzeron les combinaciones de primers CYPLALFICYFZEER y CYFZEEF/CYPLALR, Se resid Im ampifticacion de los tragmentas par FER y ‘ee vizusizaren en geies ce paiserimmiss (5%). Lez pardmetrar aisicas oe aiversivea genétics y 2 ‘anbliss de coordenades principaies (ACo#] fueron resizados con el software Gendlfx 6.3. Lasrelaciones ‘flogenétices 2e identricaron con Daze 8 18 metodoiagia de. Neignoor Joining (W-] con el software Meze $5.2. Enis resultados ze abzers un 400% de palimorfcms y 0.420 de heterocigesided experada, siendo verte Ghima cmsidem como moderads & ails, en comperacion com otros resultados previos (0.303, ‘empleands matesdores AFLF's). 4 través dei ACSF ies accesiones ce ceperaren en cuatro grusos principaies (tes tres primera: ejes expican e1 74.76 % Ge Is veriscién), mientras que an ei cenarograms Nol ins muestras ce Jamsice fueron separades en dos prusas diferentes y cada uno con dos subgrupes y -rupsivitionas, Este ditime andisis cepard cimramente los progenitore: que sieron origen s los materiale: de Nayar, UsicEneoles en loz extremes opueres del Seneragrems mientras que a rests ae loz mmaterinies na mastraron ningune tendencia en is agrupacion. Palabras Clave: Mibicus sabsarffeL; Citocromo P30; diversided genétice; coordenades principales. wrroouceidn Ls jamaica (Aitsecus cabcorifs LJ, también conscida come fr de jamice, roca ce Jerid y racelle, ex luna pains icstilecdnes of i femilis Matvacene, que ene su centro oe orgen en Africa (2, 21. Actusimente e cultvads en regienes trapicales y subtropicales Ge Asis, Ocean's y América [B]. Esta planta fur intraducida an México en el:igio XVll, cezde entoncer oe he cutivado en 13 astados de! pa, enca Guerrers, Oaxes, Wiencacin Mayert ter principsie: procuctores (Sj. eR cuenta = zu: careceristicns mortoidgieas, is jamsice #2 uns plants snus con tain semiieRozo, ret piotarte, rojas ‘iteros de color verce con borer arerredac, peciolas larga:'y e7guidoc. & una emzece sutdgeme con ‘fares axiiare: y spitarias, prezentango un nimere cromosémico 2n = 4x = 72 (3), La corom er ‘seumasneds de colar rosedo o nile, Erta 2e marchite y dezazsrece, dejonda el eéfz libre. Elfrute Sene ‘una forma capsular que contienen wn promecio de 20 cemilla las cuales tienen un calor negra fs]. Oe ‘stuersa 8 & \srigsea, elrenimiente gel shiz en tonaisees oscie entre 0.5 8 2 toneinces por nersires [5]. 4 pesar de ie impoctancia ce Im jeri, existe restringiem intormacién sobre ls diversidad genética ven arm azpecie. La mayorin oe tor artugios alzponiias ce man realizado con marcecores RAPO'S y AFLP: donde elnimers de musctres tliseda: he sito imitada a ze han enfeceds en ctrss ezzecies de! pénera ‘Hibiscur [B1. Sin embargo, bacador en las Ourervacone: en campo, ce zocgechs que tiene una amgtia ‘divercided gendtica, refigjade en ru fenctipo, producto de ls adaptacién an lo: ciferente: sitios oe lntroduccién, En a actuicad, los marcadores moleculmres son herramientas que permiten cuantiicar la diversities genética, is eleccsin Gel misma Gesencerd del Spo de estudio. En plantas suseriares, el scitocrama F450 (CVF499) juege un papel importante en le cintesis Ge endimaz que intervienen el procera oe mr sissinteni ge meteboitar y cesintouizscién, Oebies & mu souncancis ce ez femiis oe 203‘Congrese Internacona! Biologia, Quimica y Agronomia genes en orgenizmas vivar oe ha explorada i posiblced de emalesrios come mercadores wniverzale: ‘tn actusing genético: [7 For lo que el objetivo del prevents trabajo fue snalzer le civercced gengtca ‘ie ns variedader ce jamaice aulbvedes en Méuce meciante el empleo de mercedores derivado el craso, METODOLOSIA ‘se emplesron 63 eczesiones ae germapinsms ge jemsice, ms cues tueron recomectce: en custra ‘amnaos proqumores ge Mico: ayer, Guerra, Cala y Pueba. Ett acceronar son matesees ‘majorasos y ae usa comisn en exter regiones, obtenicas por m Universiana Auténama ae Neyer y 21 ‘Centro Experiment lgusle de! NIFAP en el ecinga ce Guerrera(Cuscra 4), Fara la erracsign oe ADN, 4 emplesron hj: verducera: oe cade sczesiin ceiputs de 23 ies ge germinaciin. © miedo ‘emplenan tus! pazaco en CTAB con mocifesciane® [). Cusaro 1. Icantitiosriée ae mz aecesiones ge jamaics y procesencis. ‘enana rae Pasa a uni, sae ume Pae na = wae see = nn, hone 2 nna, a = Femrndamie Siew, = tame‘Andlsis con marcadores dervades de CYPS50. Para el andlisic molecular fueron empleadas dos combinaciones de primer: derivado: del eitocrome P50: CYP2B6F/CYPLAIR y CYPLALF/CYP2BER. La Resecién en Cadena de la Polimerasa (PCR) se realizé én un Volumen total de 15 pil, conteniende 50 ng de ADN, 0.66 uM de cada primer, 3 mM de MgCl, y 0.6K de REDTaq? ReadyMix™ PCR (SIGMA-ALDRICH). Lax condiciones de amplficacin fueron: una dasnaturalizacion inictal de S min 3 95°C, 25 ciclos de 45 = 3 94°C, 45 52 54°C, 90 5 2 72°C y una extensién final de 10 min a 72 °C. Los productos de POR fueron separados en geles de poliacriiamida al 6 46 se tiferon con nitrato de plata [5]. Se elaboré una matic Ge datos binarios @ partir de Ia presencia y ausencia de bandas en los geles de poliacrilamia. Los parémetros bisicos de diversidad genética caleulados fueron el numero de alelos(W.), numero de alelos Sfactivos (NJ, heterocigosidtad experada (H.) ¥ porcentaje de polimorfismo (#P), lor cuales se obtuvieron por medio del programa GenAIEX 6:5 [10]. Las relaciones flogencticas entre las diferentes acestioner de jamaica fueron extablecida: empleande la metsdologia de Neighbor-laing (N-J} con programa Maga 5.2 [11] ademic se realizs al Andlisic de Coordenadss Principales (PCoA| utilzando el programa GenAlEX 65. RESULTADOS Se detactaron un total de 22 loci, donde Is combinacién CYPLALF/CYP2BER revel elmimero mayor de bandas polimérficas con un total de 12, mientras que la segunda combinacién, CYP2B6F/CYPLAIR, detects 10. Ambas combinaciones revelaron un 100% de polimerfismo. La H, fue de-0.420, el ntimero de alelos diferentes encontrados fue de 2 y el nimero de alelos efectivos fue 1.7. El PCOA mostré que las “tres primeras coordenadas lograron explicer el 74.76 % dea variacién. La proyeccién de las accesiones en las dos primeras coordenadas principales permitié distinguir cuatro grupos (Figura 1). El dendograma bassdo an al método N-J musstra que lar G2 sccesione: de jamaics fueron ceparsda: en dos grupos Giferentez y cada uno con dot subgrupor y subdivisiones (Figura 2), ademde, no se ident#ficaron genotipos duplicados. Figura 1 La PCOA en dos dimensiones muestra la relacién entre las 63 accesiones de jamaica con base en loz dator ds obtenides con dor combinscione: de marcadores derivados del CYP4SO.Nayarit (verde), Guerrero (rojo), Colima (negro) y Puebla (amarillo).DISCUSION La H, en el presente trabajo (0.420) se considera como moderada a alta, en comparacién con otros studios previos (0.305), en el:cual empiearon marcadores AFLP’ [12]. Ademds el CYP450 se ha utilicado en estudios de otras especies como (Oryza sativa L) [13] y (Curcuma amada Roxb) [14], en los cuales hhan permitido tener niveles altos de diversidad genética. Esto demuestra que los marcadores derivades de! C¥P450 son utiles en [a estimacién de pardmetros de diversidad genética. EI andlisis de corespondencia en dos dimensiones aplicado a las 63 accesiones de jamaica mediante las dos combinsciones (Figurs 1), demostré que algunas accesiones tienen entre si una mayor reiscién genética ‘ya que definié custro grupos principales aquellos que sus genotipos estén genéticamente relacionados. [8]. Las relaciones genéticas entre las accesiones de jamaica se establecieron a partir de un dendograma Gonde se deteminé que no existen genotipos dupicados vy ubioé a los progenitores que dieron origen 3 ios materiales de Nayarit, en ios extremos de! dendograma (Figura 2).5in embargo, para el resto de bos materiales, no se identificd ninguna tendencia en la agrupacién. Al contrastar las PCOA con el dendograma N-J se observa claramente coma los materiales no se agrupan de acuerdo a su jugar de Se, Figura 2. Dendrograma basado en IN-J [15] muestra que las 63 accesiones de jamaica fueron separadas en dos grupos diferentes y cada uno con dos subgrupos y subdivisiones. Nayarit (Azul), Guerrero (rojo), Colima (verde) y Puebla (rosa). CONCLUSIONES La utilizacién de los marcadores del ctocromo P450 en accesiones de H. sabdoriffa Ly su andlisis separd claramente los progenftores que dieron origen a los materiales de Nayarit, ubicandolos en los extremos opuestos del dendrograma mientras que el resto de los materiales no mostraron ninguna tendencia en laagrupacién.(5p) Bictogia, Quimica fy y Agrenomia En el presente ectudin, empleando 62 accesiones de Jamaica, se identificaron altos niveles de diversidad comparado con otros resultados. Estos resultados indican que al CYPA5O es una opcion para el andiicis. e [a diversicad genética ya que se puede encontrar mayor nlmero de polimarfismos debido @ fa abundancia de esta familia de genes en los organismos vives. ‘Ademés, no se encontraron accesiones duplicadas. REFERENCIAS [1] Mai, R, Rodriguez, H, Satya, P. 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