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NDIC

E
IDENTIFICACIN Y CARACTERIZACIN DE PROTEINAS
RESUMEN_______________________________________________________1
INTRODUCCIN_________________________________________________1
OBJETIVOS______________________________________________________1
MATERIALES____________________________________________________1
MUESTRAS O REACTIVOS:_______________________________________2
INSTRUMENTOS__________________________Error! Marcador no definido.
PRUEBAS A REALIZAR:__________________________________________2
METODOLOGIA_________________________________________________2
Reaccin de plomo (aminocidos azufrados)_____________________________________________________2
Reaccin con ninhidrina_____________________________________________________________________2
Reaccin de milln_________________________________________________________________________3
Reaccin xanto-proteica______________________________________________________________________3
Reaccin de Biuret__________________________________________________________________________3

RESULTADOS____________________________________________________4
DISCUSIN______________________________________________________4
CONCLUSIN.___________________________________________________4
EVIDENCIAS____________________________________________________5
BIBLIOGRAFA__________________________________________________6
IDENTIFICACIN Y CARACTERIZACIN DE ENZIMAS___________________7
RESUMEN_______________________________________________________7
INTRODUCCION_________________________________________________7
OBJETIVOS______________________________________________________7
MATERIAL______________________________________________________7
REACTIVOS_____________________________________________________8
METODOLOGA_________________________________________________8
DISCUSIN______________________________________________________9
RESULTADOS____________________________________________________9
CONCLUSIN___________________________________________________9
EVIDENCIAS___________________________________________________10
BIBLIOGRAFA_________________________________________________10
ELECTROFORESIS DE ADN EN GEL DE AGAROSA______________________12
RESUMEN______________________________________________________12
INTRODUCCION________________________________________________12
OBJETIVOS_____________________________________________________13
EQUIPO________________________________________________________13
MATERIAL_____________________________________________________13
REACTIVOS____________________________________________________13
METODOLOGA________________________________________________13
Preparacin del gel de agarosa________________________________________________________________13
Preparacin de muestra_____________________________________________________________________14
Preparacin de las muestras con el buffer._______________________________________________________14
Visualizacin del gel_______________________________________________________________________15

DISCUSIN_____________________________________________________16
CONCLUSIONES________________________________________________16
BIBLIOGRAFA_________________________________________________17
IDENTIFICACIN Y CARACTERIZACIN DE PROTEINAS
RESUMEN protenas sealizadoras, incluidas las
receptoras de la superficie celular y otras
En esta prctica se realiz la identificacin y
caracterizacin de las protenas presentes en protenas que transmiten seales externas al
interior de la clula; y las protenas motoras,
algunas muestras, para ellos se dispuso de 12
tubos de ensayo cada uno de ellos con una que producen el movimiento.
muestra distinta, las cuales se sometieron a Una finalidad primordial de la bioqumica es
las tcnicas de identificacin de protenas el determinar cmo las secuencias de
ms comunes, as pues la caracterstica aminocidos especifican la conformacin y,
principal de cada uno de los mtodos es la por tanto, la funcin de las protenas. Otras
reaccin ante la presencia de determinados metas son el saber cmo las protenas
aminocidos, dando coloraciones especficas individuales se unen a sustratos especficos y
para cada uno de las procesos. a otras molculas, cmo median en la
INTRODUCCIN catlisis y transducen energa e informacin.
El primer paso en estos estudios es la
Las protenas son un grupo de biomolculas identificacin de protenas en una muestra,
caracterizadas por su gran variedad proceso que se realiza mediante diversas
estructural y enorme diversidad de funciones tcnicas de identificacin que se detallaran
biolgicas. Las protenas de cada ser vivo, ms adelante.
son especficas ya que estn codificadas por
sus genes. Sin embargo a pesar de que OBJETIVOS
algunas desempean la misma funcin, las Identificar la presencia de protenas
protenas presentan ligeras variaciones en una muestra, a partir de diversos
estructurales en cada especie. Por su mtodos, considerando las ventajas y
composicin, qumicamente pueden desventajas de cada una de las
diferenciarse en protenas simples tcnicas.
constituidas nicamente por aminocidos y Comprender cuales son las
protenas complejas que contienen material propiedades que permiten la
adicional como carbohidratos, lpidos o identificacin de ciertas protenas en
cidos nucleicos. una muestra.
Las protenas pueden ser agrupadas en clases Interpretar los resultados obtenidos
funcionales numerosas y diversas: protenas considerando la presencia de
estructurales, que proveen rigidez estructural aminocidos en cada muestra.
a la clula; protenas transportadoras, que MATERIALES
controlan el flujo de materiales a travs de
las membranas celulares; protenas Para la realizacin de la prctica
reguladoras, que actan como sensores e identificacin y caracterizacin de
interruptores para controlar la actividad de protenas, utilizamos algunas muestras
las protenas y la funcin de los genes; extradas de distinta procedencia, as como
reactivos y materiales de laboratorio Sabemos que al ser positivo el resultado es
especiales. decir de haber presencia de este tipo de
aminocidos en nuestra muestra esta se
tornara de color negro o gris. Este tipo de
MUESTRAS O REACTIVOS: reaccin se basa en la separacin mediante
un lcali, del azufre de los aminocidos, el
Gelatina
cual al llevar acabo la reaccin con una
Leche solucin de acetato de plomo, forma el
Caldo sulfuro de plomo.
Albmina
Peptona El procedimiento para buscar lo
Casena anteriormente mencionado fue el siguiente; a
Aspartame cada una de nuestras muestras contenidas en
un tubo de ensayo se les agrego la cantidad
Tirosina
mxima de lquido contenida por el gotero
Cistena
Arginina
Alanina
Agua
INSTRUMENTOS
Tubos de ensayo
Gradilla
Pipetas
Vasos de precipitado
Plancha
en dos ocasiones, posteriormente, la
PRUEBAS A REALIZAR: disolucin se mezcl (dando pequeos
Reaccin de plomo (aminocidos golpecitos al tubo de ensayo) y se calent a
azufrados). bao mara para evitar falsos positivos.
Reaccin con ninhidrina. Reaccin con ninhidrina
Reaccin de milln.
Reaccin xanto-proteica. El objetivo de esta prueba es identificar la
Reaccin de biuret. presencia de protenas o aminocidos libres.
La ninhidrina reacciona con los grupos
METODOLOGIA amino libreando amonio, el cual
posteriormente se condensa con la ninhidrina
Reaccin de plomo (aminocidos
reducida y con otra molcula de ninhidrina
azufrados) formando un compuesto coloreado que vara
El objetivo de esta prueba es buscar la de azul a violeta prpura, segn la cantidad
presencia de aminocidos azufrados (cistena de aminocidos presentes.
y metionina) en nuestras diferentes muestras.
A cada una de las muestras contenidas en los En busca del complejo color rojo; A cada
12 tubos de ensayo se les agreg la cantidad muestra contenida en un tubo de ensayo se le
agreg la cantidad mxima medida por el
gotero (en esta ocasin solo una vez),
posteriormente, la disolucin se mezcl
dando pequeos golpecitos al tubo de ensayo
y despus se calent a bao mara para
observar el cambio hacia color rojo si la
muestra contena alguno de los aminocidos
anteriormente mencionados.
Reaccin xanto-proteica
mxima medida por el gotero en dos
ocasiones, inmediatamente, la disolucin se El objetivo de esta prueba es identificar la
mezcl y calent a bao mara para evitar presencia de protenas con abundantes
falsos positivos. aminocidos como tirosina, fenilalanina y
triptfano mediante un cambio de tonalidad
Reaccin de milln a amarillo. Esto ser posible, ya que los
Al igual que las tcnicas anteriores, esta anillos aromticos presentes en algunos
tiene como objetivo identificar la presencia aminocidos reaccionan con cido ntrico
de protenas mediante el cambio de color del concentrado formando nitro derivados de
precipitado al exponerlo al calor (bao color amarillo, dicho lo anterior sabemos
mara), esto ser posible gracias a que el que esta reaccin nos permitir reconocer la
anillo fenlico tiene un comportamiento presencia de tirosina, fenilalanina y
caracterstico frente a las sales de mercurio a triptfano presentes en cada una de las
pH cido, me refiero a la formacin de muestras.
complejos color rojo con el anillo fenlico
de la tirosina y la fenilalanina y por lo tanto
con las protenas que la contienen.

A cada una de las muestra contenidas en los


tubos de ensayo se le agreg la cantidad
mxima de cido ntrico medida por el
gotero, despus, se aadi una base, en esta
ocasin hidrxido de amonio,
posteriormente la disolucin se mezcl y
calent a bao mara y se dej enfriar para
observar el cambio hacia color amarillo en
caso de que la muestra presentara protenas

Ninhidrina
Muestra

Proteica
con aminocidos aromticos.

Xanto-
Milln
Plomo

Biuret
Tubo
Reaccin de Biuret
La meta de esta prueba es identificar la 1 Gelatina - - + - +
2 Leche + - - + +
presencia de protenas mediante un reactivo 3 Caldo + - - - -
4 Albmina + - - + +
de cobre (de all el nombre de esta tcnica) 5 Peptona + - + + -
que se agrega a los grupos amino de dos o 6 Casena - - - + -
7 Aspartame + - - - -
ms enlaces peptdicos, provocando una 8 Tirosina - - + + -
coloracin violeta. El reactivo de Biuret est 9 Cistena - - - - -
10 Arginina - - - - -
formado por una solucin de sulfato de 11 Alanina - + - - -
cobre en medio alcalino, este identifica el 12 Agua - - - - -
enlace peptdico de todas las protenas DISCUSIN
mediante la formacin de un complejo de
Gracias a la prctica se logr identificar la
presencia de protenas en algunas de nuestras
muestras mediante diversos mtodos
utilizados para ello, estas tcnicas suelen ser
especficas para cada tipo de muestra, ya que
como se mencion anteriormente cada una
reacciona ante la presencia de determinados
tipos de aminocidos, lo que le confiere a
cada una un alto poder de especificidad,
coordinacin entre los iones Cu2+ y los pares puesto que aprovecha las caractersticas
de electrones no compartidos del nitrgeno distintivas de cada protena entre ellas su
que se encuentra en los enlaces peptdicos. estructura primaria. Mediante estas pruebas
logramos poner en prctica lo aprendido
A cada una de las muestras presentes en un
durante la exposicin de identificacin y
tubo de ensayo se le aadi la cantidad
cuantificacin de protenas puesto que
mxima medida por el gotero en dos
algunos puntos no quedaron muy claros, sin
ocasiones, en primer lugar el reactivo de
embargo al llevar dichos conocimientos a la
cobre o biuret, y despus hidrxido de sodio,
prctica todas las dudas quedaron
por ltimo la disolucin se mezcl y calent
esclarecidas. Un dato interesante fue lo
a bao mara para evitar falsos positivos.
ocurrido con la muestra de caldo de pollo
RESULTADOS (obtenida industrialmente), la cual a la hora
La siguiente tabla muestra los efectos de ser analizada mostr muy poca cantidad
ocasionados en cada una de las muestras al de protena, por lo tanto se deduce que
reaccionar con los diferentes reactivos muchas veces la publicidad con la que se
caractersticos de cada una de las tcnicas de anuncian y comercializan estos productos es
identificacin descritos anteriormente. engaosa puesto que su composicin
realmente comprende grasas que en su
mayora producen efectos negativos al llevan a cabo diversas funciones lo que las
organismo. hace fundamentales para muchos procesos
vitales. Las protenas de otros animales y de
algunas plantas son un alimento importante,
ya que proporcionan los aminocidos que
son esenciales para el cuerpo en la
produccin de las protenas necesarias.

EVIDENCIAS
Reaccin de Biuret

Reaccin de ninhidrina

Reaccin xanto-proteica

CONCLUSIN.
Las protenas son polmeros de aminocidos
y se producen en las clulas del cuerpo,
Colocando las muestras a bao mara
para evitar falsos positivos.

Lavando el tubo de ensayo, puesto que


ocurri un accidente (el gotero se revent)
Resultados de cada una de las tcnicas.
BIBLIOGRAFA

Nelson, D., Lehninger, A., & Cox, M.


(2008). Lehninger principles of
biochemistry (5th ed., pp. 71-103).
New York: W.H. Freeman.
IDENTIFICACIN Y CARACTERIZACIN DE ENZIMAS
RESUMEN

En la prctica se realiz la identificacin de la formacin de complejos Enzima-Sustrato,


utilizando para ello a la enzima ureasa y su sustrato urea, a la par se utilizaron algunos
agentes desnaturalizantes y la mezcla de ms de un sustrato para conocer de qu manera
estos factores afectaban el poder cataltico de la enzima .
Se logr caracterizar mediante la formacin de un compuesto colorimtrico, a aquellos
complejos en los que la reaccin enzima-sustrato se produca de una forma ptima,
aprovechando al mximo su poder cataltico.
INTRODUCCION
Las enzimas son el grupo ms variado y especializado de las protenas que catalizan todas
las reacciones bioqumicas, permitiendo que las reacciones que transcurren en los seres
vivos puedan desarrollarse a un ritmo adecuado. Adems de su importancia como
catalizadores biolgicos, tienen muchos usos mdicos y comerciales. Un catalizador es una
sustancia que disminuye la energa de activacin de una reaccin qumica, al disminuir la
energa de activacin, se incrementa la velocidad de la reaccin. La mayora de las
reacciones de los sistemas vivos son reversibles, es decir, que en ellas se establece el
equilibrio qumico. Por lo tanto, las enzimas aceleran la formacin de equilibrio qumico,
pero no afectan las concentraciones finales del equilibrio. La sustancia sobre la cual acta
una enzima se llama sustrato. Los sustratos son especficos para cada enzima: La urea es el
sustrato de la ureasa que acta rompindola en sus componentes.
La capacidad catalizadora de una enzima depende de su conformacin, la desnaturalizacin
causa la prdida de funcionamiento. Gran parte de sus propiedades catalticas radican en el
alto grado de especializacin que presentan respecto a las sustancias reaccionantes o
sustratos. Al igual que las protenas, les hay de muy diferentes tamaos y requerimientos;
algunas necesitan para desarrollar su actividad tan slo sus residuos de aminocidos,
mientras que otras requieren la presencia de un cofactor, este compuesto puede ser,
sencillamente un ion inorgnico, Fe2+, Mg2+, Mn2+ o Zn2+; o una molcula orgnica ms o
menos compleja, que si se encuentra unida covalentemente se denomina grupo prosttico, y
si establece uniones de naturaleza dbil y reversible se denomina coenzima. Muchas
vitaminas, o derivados de las mismas, funcionan como coenzimas. La enzima completa
junto a su cofactor se denomina holoenzima y su parte exclusivamente proteica apoenzima.
OBJETIVOS
Caracterizar e identificar enzimas, as como reconocer los diversos factores;
desnaturalizacin, especificidad, hidrolisis, etc, que pueden interferir en la formacin del
complejo enzima-sustrato durante la reaccin enzimatica y de qu manera lo hacen.

9
MATERIAL
Tubos de ensayo.
Gradillas
Goteros.
Mechero
Pinzas para tubo de ensayo

REACTIVOS
Urea
Ureasa 2%
Tiurea
Ureasa concentrada
Acetona
Perxido
Fenolftalena

METODOLOGA
1. Lavar todo el material con agua y detergente; enjuagar con agua de la llave y finalmente
con agua destilada.
2. Tomar nueve tubos de ensayo, enumerarlos y colocarlos en una gradilla.
3. Aadir a cada uno de los tubos de ensayo, los reactivos indicados en la siguiente tabla,
siguiendo el orden establecido:
Enzima Agente Sustrato
Aspecto Tubo Indicador
(ureasa) desnaturalizante (urea)
Control (-) 1 1 mL 2 gotas
2 1 mL 1 mL 2 gotas
Hidrolisis (+) Semilla
3 1 mL 2 gotas
Molida
1 mL
Especificidad 4 1 mL 2 gotas
Tiurea
1 mL
Competitiva 5 1 mL Urea y 2 gotas
Inhibicin Tiurea
Por sustrato 1 mL
6 1 mL 2 gotas
[[Urea]]
7 1 mL Por calor 1 mL 2 gotas
Desnaturalizacin 8 1 mL Perxido 2 mL 1 mL 2 gotas
9 1 mL Acetona 2 mL 1 mL 2 gotas

4. Una vez aadidos los reactivos en el tubo de ensayo, mezclar dando unos ligeros
golpecitos al tubo (este paso deber realizarse en cada tubo una vez agregado el indicador).

10
5. Observar e interpretar el resultado obtenido.
Nota: En el caso del tubo de ensayo #7, al cual se le agregare calor, primeramente aadir en
l tubo la ureasa, posteriormente calentar, hasta ebullicin intermitente, despus lavar con
agua a temperatura ambiente (cuidar que no entre agua al tubo de ensayo, puesto que esto
podra intervenir en nuestros resultados), por ultimo aadir los otros reactivos y observar el
resultado.
DISCUSIN
La ureasa, cuyo nombre sistemtico es amidohidrolasa de urea, tiene un peso molecular de
483 000 Dalton. La ureasa consta de 6 subunidades estructurales iguales. Es una enzima
muy especfica, que existe en varios tipos de vegetales, por ejemplo, en el frijol de soya. La
ureasa se utiliza mucho como agente cataltico para la medicin cuantitativa de urea. El
hidrxido de amonio que se forma puede titularse y puede relacionarse,
estequiomtricamente, con la cantidad de urea presente en una muestra. Aunque la ureasa
no es muy comn en la naturaleza, esta enzima ha tenido ms importancia en el desarrollo
de la enzimologa moderna que ninguna otra. Las investigaciones sobre la ureasa han
permitido deducir el principio importante en las reacciones enzimticas: la funcin de los
grupos SH (sulfhdrico) en la catlisis. La ureasa posee 3 o 4 grupos activos, es una
representante de un gran nmero de enzimas cuya actividad depende de la existencia de
grupos SH intactos, procedentes de cistenas que forman parte de la cadena poli peptdica
de la enzima.
La ureasa acta en los compuestos a nivel de los puentes C-N excepto en aquellos que
contiene puentes peptdicos. El pH ptimo para la actividad de la ureasa es de 7.
RESULTADOS
En la tabla 1 se muestran los resultados obtenidos en cada uno de los tubos, as como la
explicacin de dicho resultado.
CONCLUSIN
Las enzimas son catalizadores biolgicos de naturaleza proteica (a excepcin de un
pequeo grupo de molculas de RNA cataltico) presentes en todos los procesos
bioqumicos, catalizan reacciones gracias a las interacciones covalentes y no covalentes que
forman con el sustrato.
Los aminocidos se unen al centro activo para establecer los enlaces dbiles con el sustrato
por lo que la especificidad de la enzima radica ah, una enzima y un sustrato no llegan a
adherirse si sus formas no encajan con exactitud. Este hecho asegura que la enzima no
participe en reacciones equivocadas.
Dentro de los Factores que influyen en las reacciones enzimticas se encuentran: cambios
en el pH, cambios en la temperatura y las concentraciones del sustrato y de los productos
finales.

11
Es de suma importancia conocer el pH y la temperatura ptimos de una enzima, ya que a
estas condiciones alcanzara su mayor poder cataltico, a la par la concentracin del sustrato
es muy importante ya que a valores elevados de esta tambin se incrementa la velocidad de
una reaccin catalizada por enzimas.
Las enzimas son encargadas de disminuir la energa de activacin (G) de una reaccin,
causando la aceleracin de la tasa de reaccin. No olvidar que las enzimas no alteran el
balance energtico, ni modifican el equilibrio de la reaccin solamente intervienen para que
una reaccin qumica se produzca con una mayor rapidez.
EVIDENCIAS
Sometiendo la enzima ureasa a
calor, para propiciar su
desnaturalizacin.

Aadiendo los reactivos


(enzima, sustrato e indicador) al
tubo de ensayo, posteriormente
dar unos pequeos golpecitos al
tubo de ensayo para mezclar.

Coloracin de los productos obtenidos a partir de


las reacciones enzimticas (tubos de ensayo
ordenados de izquierda a derecha comenzando
por el nmero 1.

12
BIBLIOGRAFA

Nelson, D., Lehninger, A., & Cox, M. (2008). Lehninger principles of


biochemistry (5th ed., pp. 183-227). New York: W.H. Freeman.

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Tabla 1: Resultados

Agente Resultado
Enzima Sustrato
Aspecto Tubo desnatu Indicador obtenido Explicacin del resultado
(ureasa) (urea)
ralizante ( coloracin)
No hubo ningn Como se indica al principio, este es el control negativo, la reaccin no se llev a
Control (-) 1 1 mL 2 gotas tipo de cabo puesto que el tubo no contena enzima, solo sustrato e indicador, por lo tanto
coloracin no se produce la formacin del complejo enzimtico.
Se produce la formacin del complejo enzima-sustrato puesto que ambos se
Coloracin rosa encuentran presentes en nuestro tubo de ensayo, as pues la coloracin es fuerte
2 1 mL 1 mL 2 gotas
brillante ya que la reaccin se llev a cabo por completo debido a la presencia de enzima y
Hidrolisis (+) sustrato en cantidades proporcionales.
Se produce la reaccin y por lo tanto la formacin del complejo enzima-sustrato,
Semilla Coloracin rosa
3 1 mL 2 gotas sin embargo la coloracin es menor respecto al anterior ya que la enzima no se
Molida claro
encuentra purificada por completo, sino en su forma de semilla (natural).
Sin duda alguna una de las principales caracterstica de cualquier enzima es su
Ningn tipo de alta especificidad, en este caso depositamos en nuestro tubo de ensayo la enzima
1 mL
Especificidad 4 1 mL 2 gotas coloracin ( no ureasa y el complejo tiurea, aunque esta ltima es muy parecida qumicamente a
Tiurea
hubo reaccin) la urea, no es igual, y por lo tanto el sitio especifico de la ureasa no est adaptado
para que entre y se lleve a cabo la reaccin enzimtica.
1 mL La reaccin no se produce completamente ya que la cantidad de sustrato es
5 1 mL Urea y 2 gotas Rosa Fucsia menor a la de enzima, el resto del sustrato es tiurea que como se mencion
Tiurea anteriormente no reacciona con la ureasa.
La concentracin es uno de los factores que afectan la velocidad de las reacciones
Competitiva
enzimticas, por lo tanto en este caso la formacin del complejo enzima sustrato
Inhibicin
se produjo de una forma ms rpida. La actividad enzimtica aumenta, hasta
Por sustrato 1 mL Coloracin;
6 1 mL 2 gotas alcanzar la velocidad mxima, punto donde la enzima se satura, debido a que la
[[Urea]] Rosa intenso
enzima tiene todos sus sitios activos ocupados. De esta forma; si se incrementa la
concentracin de enzima, se forma mayor cantidad de productos por unidad de
tiempo.
Desnaturalizaci Toda enzima tiene una temperatura ptima, a la cual su velocidad de reaccin es
n mxima. A temperaturas debajo de esta temperatura, la frecuencia de choques
entre la enzima y el sustrato es baja y, por tanto, la velocidad de reaccin tambin
lo es. Conforme se incrementa la temperatura, aumenta la frecuencia de choques
7 1 mL Por calor 1 mL 2 gotas Ninguna y se favorece la velocidad de reaccin (la formacin del producto). Pero si la
temperatura es muy elevada, pueden romper la estructura de Vander Waals y los
puentes de hidrogeno que estabilizan la estructura terciaria y cuaternaria de las
enzimas, como consecuencia, se produce su desnaturalizacin y la perdida de la
actividad enzimtica. Tal como en este caso.
Perxido Ninguna La estructura tridimensional de una enzima determina su sitio cataltico y, por lo
8 1 mL 1 mL 2 gotas tanto, su actividad. La ureasa acta en los compuestos a nivel de los puentes C-N
2 mL
excepto en aquellos que contiene puentes peptdicos. El pH ptimo para la
9 1 mL Acetona 1 mL 2 gotas
actividad de la ureasa es de 7. En estos casos se someti el tubo de ensayo a un
2 mL
14
Observaciones Cada vez que se agregue un reactivo, mezclar, dando unos golpecitos ligeros al tubo

15
ELECTROFORESIS DE ADN EN GEL DE AGAROSA
RESUMEN

En la prctica se realiz electroforesis con gel de agarosa para determinar la cantidad y calidad de
ADN presente en una muestra, por lo tanto se ejecut el protocolo oportuno para la realizacin de
este, utilizando la extraccin de ADN. Primeramente se procedi a la preparacin del gel agarosa
a un 2% en el cual posteriormente se correran las muestras de ADN extrado con anterioridad
para aclarar la presencia de ADN y su estado, consecutivamente se procede a la aplicacin de
nuestra muestra en la cmara electrofortica (en esta ocasin elaborada caseramente) para poder
observar la corrida del ADN en el gel agarosa, y finalmente se hace observacin
electroforticamente de este, donde es transportado al cuarto oscuro para someterlo a la
observacin en los rayos UV y as determinar la calidad y cantidad de ADN y por lo tanto; si el
procedimiento fue hecho correctamente.
Se encontraron algunas inconsistencias, las cuales pudieron ser ocasionadas por una mala
preparacin del gel agarosa, mala utilizacin del tampn o incluso a una mala extraccin del
ADN realizado anteriormente.
INTRODUCCION soluciones buffers, este migrara hacia el
nodo (electrodo positivo) su velocidad de
La electroforesis de los cidos nucleicos es migracin estar limitada por las fuerzas de
el mtodo ms empleado para separar, friccin procedentes del soporte o gel. Cada
identificar y purificar molculas o molcula otorga una carga negativa y debido
fragmentos de ADN y ARN en funcin de su a la presencia de SDS se establece una
tamao. Podemos adems extraer del gel los relacin carga-masa similar en todas las
fragmentos de ADN que sean de inters, para molculas independientemente de su
posteriormente utilizarlos en diferentes tamao; por lo tanto la migracin o
aplicaciones. movilidad del ADN en un gel va depender
La electroforesis de cidos nucleicos por lo del tamao o conformacin as como
general se lleva a cabo en geles de agarosa, tambin del poro del gel.
este mtodo es considerado sumamente Una vez realizada la electroforesis los
sencillo y enormemente eficiente para fragmentos de ADN logran observarse al
separar fragmentos de ADN. utilizar compuestos fluorescentes; el
Una de las caractersticas ms importantes bromuro de etidio es el colorante ms
que permite que esta separacin se lleve a empleado para la visualizacin de ADN en
cabo es el hecho de que los cidos nucleicos los geles, para ello se intercala en las bases
estn cargados negativamente debido a los de los cidos nucleicos, emitiendo as una
grupos fosfatos. As pues una vez que el fluorescencia cuando es iluminado con los
ADN es expuesto al campo elctrico y en rayos ultravioleta los cuales hacen posible la

16
visualizacin de cantidades mnimas de Puntas para micropipeta.
ADN, la utilizacin de este compuesto debe
Tubos tipo eppendorf.
ser manejada con mucho cuidado y con el
cumplimiento riguroso de los protocolos de Guantes impermeables para el
bioseguridad de los laboratorios de manejo del bromuro de etidio.
biotecnologa, puesto que se considera un REACTIVOS
agente altamente cancergeno.
OBJETIVOS Agarosa
cido actico.
Poner en prctica los principios adquiridos
tericamente acerca de la electroforesis, as EDTA etilendiaminotetraactico.
como comprender que la separacin de ADN
cido brico.
es una de las tcnicas ms importantes
actualmente, la cual nos permite identificar Bromuro de etidio.
pequeos fragmentos de cido
Amortiguador de boratos.
desoxirribonucleico.
Comprender cmo la conformacin de la METODOLOGA
molcula de ADN determinar su movilidad Las etapas para llevar a cabo una corrida
a travs de una matriz de gel. electrofortica se representan en el siguiente
Comprende el mecanismo por el cual el diagrama:
bromuro de etidio permite la visualizacin
de las bandas de ADN.
EQUIPO

*Cmara horizontal de electroforesis con los


accesorios correspondientes (molde para
hacer el gel, peine, cables para conectar a la
fuente de alimentacin).
*Fuente de alimentacin o de poder.
*Transiluminador (fuente de luz
ultravioleta).
*Equipo fotogrfico que permita tomar fotos
del gel.
MATERIAL

Micropipetas.

17
Preparacin del gel de agarosa

Se prepara el gel de agarosa a un 2%. En


este se corrern las muestras de ADN
extradas con anterioridad.
Preparacin de muestra

En este caso la muestra ya se encontraba Una vez colocada nuestra muestra en la


preparada, la extraccin de ADN pertenece a
otra prctica.
Preparacin de las muestras con el buffer.

Una vez que el gel ha solidificado retirar, el


sellado de los bordes y colocar el molde con
el gel en la cmara de electroforesis.

cmara electrofortica, procederemos a


conectar los cables a la fuente de
alimentacin y aplicar un voltaje de 20-150
V (1-5 V/cm de acuerdo a la distancia entre
los electrodos), los cuales sern los
encargados de producir el campo elctrico, y
por lo tanto la separacin de nuestras
molculas.

Aadir buffer de electroforesis hasta que


cubra el gel unos 3-5 mm.
Retirar cuidadosamente el peine para que
queden libres los pocillos para las muestras.
Retire la tapa. Despacio y cuidadosamente.
Cargar la muestra de ADN (s) en los pocillos
del gel.

18
Visualizacin del gel

Una vez transcurridos los 30 minutos


(terminada la electroforesis), apague la
fuente de alimentacin y retire la tapa de la
caja de gel, en el siguiente paso este debe
teirse para llevar a cabo la visualizacin de
los resultados. Para ello se saca el gel de su
molde y se sumerge en una solucin de BrEt
(0.5 g/ml) durante al menos 15 min.

Nota: Debe tenerse en cuenta que el ADN


migra hacia el nodo, por lo que debe
disponerse correctamente la orientacin del
gel y de los cables.
Correr el gel hasta que el colorante azul de
bromo fenol est a una distancia del borde de
aproximadamente un 25% de la longitud
total del gel. En ese momento debe detenerse
la electroforesis. Esto se lograra en
aproximadamente 30 minutos, a un voltaje
constante.

19
Lavar el gel con agua destilada para as Colocar el gel sobre un transiluminador y
retirar todas las fuerzas de tincin no fijadas encender la lmpara de luz ultravioleta (
en el gel. Puesto que el lavado con agua no 300 nm), el ADN se visualizar como bandas
elimina por completo el color fijado en el de color anaranjado.
interior
del gel, por
esta razn
es

necesario incubar el gel en una disolucin


decolarante. La cual se encargara de eliminar
el colorante que no se ha unido de forma
especfica al ADN separado por la
electroforesis.

Fotografiar el gel con el sistema fotogrfico


disponible: Una vez que se ha realizado esta
accin puede llevarse a cabo el analisis de
los resultados.

20
DISCUSIN diferentes tipos de electroforesis en gel los
cuales tienen una funcin de terminada. La
La electroforesis en gel de agarosa es un electroforesis en gel de muestras grandes de
mtodo normalizado que se utiliza para ADN y ARN se efecta en geles de agarosa,
separar, identificar y purificar fragmentos de la electroforesis de protenas se lleva a cabo
ADN. Se trata de una tcnica sencilla y en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-
rpida que permite diferenciar fragmentos de PAGE), isoelectroenfoque, geles nativos o
ADN que no pueden separarse electroforesis bidimensional, electroforesis
adecuadamente con otros procedimientos capilar, electroforesis de ADN, zimografa o
(M. Somma). En nuestro caso se hizo para zimogramas. Uno de los mtodos ms
para identificar la calidad y cantidad de usados en los ltimos aos y de gran
ADN presente en las muestras tomadas. El importancia en medicina; es la electroforesis
desplazamiento de los cidos nucleicos se capilar la cual presenta la versatilidad de
debe a la carga elctrica tomada por estos poder separar aminocidos, cidos
segn el pH presente en la solucin del gel. orgnicos, iones inorgnicos, carbohidratos,
Los geles (poliacrilamida o la agarosa) se esteroides, tioles, contaminantes
colocan en la cubeta de electroforesis, alimenticios, material gentico y algunos
sumergidos en un tampn de pH alrededor frmacos importantes en el estudio de
de 8. De esta forma, las molculas de ADN diferentes ramas en el rea de la salud;
sometidas a electroforesis se desplazarn al usualmente el anlisis de los diferentes
polo positivo ya que a pH superiores a 5 analitos puede realizarse en unos minutos, se
poseen carga negativa (Carmen Alicia requiere de pequeas cantidades de muestra
Padilla Pea). (GARCA-CANAS V, 2007). En si la
La utilizacin de colorantes fluorescentes electroforesis es una tcnica sensible y
actan mediante insercin entre las pares de altamente verstil que se encuentra
bases que conforman el cido nucleco. El involucrada en investigacin genmica y
bromuro de etidio es ampliamente utilizado farmacutica, pero que adems se expande
para la visualizacin de ADN y es este un constantemente en el diagnstico molecular
reactivo altamente toxico, sin embrago en la y clnico con resultados asombrosos sin
actualidad existen colorantes fluorescentes contar con las aplicaciones forenses que de
alternativos, como SYBR Safe, SYBR Gold, alguna forma la hicieron saltar a la fama en
SYBR Green I, Vistra Green y Syto60, sus inicios (Jonathan J Magaa1, 2008).
desarrollados especficamente para reducir CONCLUSIONES
los riesgos (Duque, 2009).
La preparacin inadecuada en el gel de
La electroforesis es uno de los mtodos de
agarosa, puede ocasionar que la resolucin
cuantificacin ms utilizados para la
de las bandas que se forman tienda a ser
separacin de molculas segn la movilidad
difusas.
de estas en un campo elctrico, existen

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La composicin y la fuerza elctrica del migracin es inversamente proporcional a su
tampn pueden afectar la movilidad de tamao. En fragmentos simples
ADN, ya que en ausencia de iones se de ADN y ARN (una sola cadena), dichas
desplaza lentamente o no se mueve, y con molculas tienden a plegarse de forma
demasiados iones se sobrecalienta o se compleja y a migrar de forma ms
funde. complicada, segn la estructura terciaria
formada tras el plegamiento. Sin embargo,
Las tcnicas de electroforesis de ADN son
compuestos que puedan romper los enlaces
hoy en da bsicas e insustituibles para
de puente de hidrgeno, como el hidrxido
cualquier trabajo en biologa molecular con
de sodio o la formamida, son empleados para
cidos nucleicos, por lo que seguirn
'desplegar' las molculas plegadas y permitir
utilizndose previsiblemente durante mucho
que la velocidad de migracin dependa
tiempo. A lo largo de los aos se han ido
nicamente y exclusivamente del tamao y
desarrollando avances en este tipo de
no de la estructura formada tras el
tcnicas, como la PFGE, as como
plegamiento.
aplicaciones nuevas, como el EMSA. El
continuo desarrollo de las tcnicas de BIBLIOGRAFA
biologa molecular hace prever que se Bandow J Baker JD, Berth M,
encontrarn nuevas aplicaciones para los Painter C, et al Improved image
diferentes mtodos de electroforesis de analysis workflow for 2-D gels
cidos nucleicos en gel. enables large-scale 2-D gel-based
La electroforesis de ADN es til para proteomics studies - COPD
comparar patrones de bandas de diferentes biomarker discovery study
[Informe]. - [s.l.] : Proteomics , 2008.
muestras biolgicas, para la identificacin de
Berth M Moser FM, Kolbe M, et al.
cidos nucleicos de agentes infecciosos o
The state of the art in the analysis of
para la obtencin de un fragmento
two-dimensional gel eletcrophoresis
determinado de ADN que, una vez images. Appl Microbiol Biotechno
localizado en el gel, puede ser extrado para [Informe]. - 2007.
anlisis posteriores. Duque Duina Posso Protocolos de
En los fragmentos de ADN dobles (con laboratorio UEG . - 2009.
estructura de doble hlice) la velocidad de

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