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Effet de la Temprature

11/16/2016
sur lActivit
Enzymatique
protase
Enzymologie TP : 04

Objectifs :
Dtermination de la temprature optimale pour la protase.
Dtermination de lnergie dactivation des protases.

Nom : BOUTEMINE
Prnom : Fatima Zohra
Groupe : A4
Principe :
Les protases sont des hydrolases des protines.
La dtermination de la temprature optimale pour la protase se fait
en suivant lactivit enzymatique par spectrophotomtrie
diffrentes tempratures.

Description du matriel :
Tubes essai ;
Papier filtre de WATTMAN ;
Pipette de 5 ml ;
Micropipette 1000 ;
Bicher ;
Cuve en verre ;
Spectrophotomtre ;
Agitateur vortex ;
Entonnoir.

Ractifs :
Solution de TCA 4% ; Solution de 2 3 0.2% dilue dans du
0.1N ; ractif de Folin-ciocalteu dilu 50% ; tampon
Phosphate /citrate 0.2M, pH 5 ; substrat : solution de casine
2.5% dans du tampon phosphate 50 mM pH 7.5 ; extrait
enzymatique.
Mthodologie de travail :
1. Prparation du mlange ractionnel :
Prparer une 1 srie de 5 tubes essai dont pour chaque
tube on met par ordre : 0.5ml de lextrait enzymatique ; 750 de
tampon phosphate ; 1250 de casine ;
Agiter les tubes et incuber au bain-Marie diffrentes
tempratures ( 1 = 0; 2 = 25; 3 = 40; 4 50 ; 5 =
70; 6 = 100) pendant 30min ;
Aprs incubation rajout dans chaque tube 2500 de TCA ;
Laisser le mlange reposer 5min temprature ambiante ;
Filtrer le mlange.
2. Prparation du blanc ractif :
Prparer 1tube essai dont pour chaque tube on met par ordre :
0.5ml de lextrait enzymatique ; 750 du tampon phosphate ;
Rajouter dans chaque tube 2500 de TCA ; puis 1250 de
casine ;
Agiter et laisser le mlange reposer 10min temprature
ambiante ;
Filtrer le mlange avec du papier filtre et un entonnoir dans un
tube essai.
3. Obtention du filtrat de chacun des tubes prpar.
4. Dosage de lactivit enzymatique :
Prparer 7 tubes de dosage partir des filtrats des 7 tubes
essai dj prpars (mme principe de manipulation pour les 7
nouveaux tubes) :
Prlever avec la micropipette 500 du filtrat ;
mettre le volume prlev dans un tube essai ;
rajouter successivement 1,5ml prlev avec une pipette de 5ml -
de 2 3 + puis 250 du ractif de Folin prlev avec
une micropipette p1000-;
Agiter et incuber le mlange obtenu pendant 30min temprature
ambiante.
5. Remplir les cuves en verre avec les mlanges obtenus.
6. Lire la DO (Densit Optique) 750nm entre le blanc et
le mlange ractionnel pour chaque temprature.
Rsultats obtenus :
20 30 40 50 60 70 90 100
0,162 0,167 0,1575 0,193 0,2045 0,251 0,28875 0,257

20 30 40 50 60 70 90 100

[TYR] mg/ml
0,00710 0,00735 0,00688 0,00864 0,00922 0,01153 0,01340 0,01182

1. Calcul de lactivit protolytique :


Lunit de lactivit enzymatique :

= /

Partant du poids molculaire de la tyrosine :

On a: = 181.2 = 181.2 103 /106
= 181.2 103 (/)
[ ]
De plus : = (//)

En devisant sur :
[ ]
= 181.2103 ( /)= ()

[TYR] (mg/ml) Vi (mg/ml/mn) ()


20
0,00710 0,000237 0,00129894
30
0,00735 0,000245 0,00134468
40
0,00688 0,000229 0,00125869
50
0,00864 0,000288 0,00158068
60
0,00922 0,000307 0,00168679
70
0,01153 0,000384 0,0021094
90
0,01340 0,000447 0,00245152
100
0,01182 0,000394 0,00216246
2. La courbe D.O =f () :

Courbe representante la variation de la DO des protases


en fonction de temprature
0,35

0,3

0,25

0,2

0,15
temprature
critique
0,1

0,05

0
0 20 40 60 80 100 120

La temprature critique est celle correspondante une activit


protolytique maximale, donc daprs cette courbe on trouve que :
= 90
3. Selon la loi dArrhenius on trace la courbe ln(Vmax)=f (1/T) :
Temprature(k)( + 1/T Ln(Vmax)
)
0,00341297 -8,34885788
293
0,00330033 -8,31425235
303
0,00319489 -8,38033401
313
0,00309598 -8,15255008
323
0,003003 -8,08757762
333
0,00291545 -7,86400033
343
0,00275482 -7,71369795
363
0,00268097 -7,83915965
373
courbe exprimant la loi d'Arrhnius
-7,6
0,002 0,0022 0,0024 0,0026 0,0028 0,003 0,0032 0,0034 0,0036
-7,7

-7,8

-7,9
y = -930,94x - 5,253
LN(Vmax)

-8 R = 0,8664

-8,1

-8,2

-8,3

-8,4

-8,5
1/T(^(1))

Daprs cette courbe on tire lnergie dactivation ( ) :


On a :

= () = = 930.94

2

= 930.94 = 930.94 8.31 = 77.36/

CONCLUSION :
On a pu dterminer leffet de la temprature sur les protases qui est
reprsent par la loi dArrhenius.