SEPARACIN E IDENTIFICACIN DE

COMPUESTOS ORGNICOS
MEDIANTE CROMATOGRAFA
LQUIDA DE ALTA EFICACIA (HPLC)
(SIMULACIONES)

Juan Becerra Ceballos.

UNED. Valencia
RESUMEN
La prctica se ha realizado usando el programa HPLC simulator, el
cual simula una cromatografa lquida de alta eficacia en fase inversa,
es decir, para llevar a cabo una separacin empleando una columna
no polar y fase mvil polar constituida por mezclas hidroorgnicas.

La prctica consiste en una serie de cuestiones referidas a los

parmetros que influyen es este tipo de cromatografa que son:

a) Composicin de la fase mvil

b) Temperatura de la columna
c) Volumen de inyeccin
d) Velocidad de flujo
e) Propiedades de la columna

El software permite la representacin grfica de la separacin

(cromatograma). En el presente informe se incluyen los
cromatogramas cuando son necesarios para la explicacin
correspondiente.

Finalmente, se incluyen las respuestas a las cuestiones planteadas al

final del texto base.

INTRODUCCIN

La motivacin principal de la prctica es el manejo del software HPLC

simulator para realizar las cuestiones planteadas a lo largo del texto
base. De esta forma se pretende cumplir los siguientes objetivos:

- Comprender las bases de la cromatografa de lquidos de alta

eficacia.
- Manipular con cierta soltura un programa de simulacin de un
equipo de HPLC.
- Comprobar el efecto que producen ciertas variables que afectan
a la separacin cromatografa de compuestos mediante una
tcnica de HPLC.

La metodologa es el uso del programa utilizando para ello un

ordenador personal e ir realizando las modificaciones en los
parmetros que el texto base indica, para despus, responder las
cuestiones que el mismo texto plantea.

DESARROLLO DEL TRABAJO EXPERIMENTAL

Como ya se ha indicado con anterioridad en el informe, el material

empleado ha sido el software de simulaciones de HPLC,
descargndolo de la pgina web: http://www.hplcsimulator.org/ y un
ordenador personal.

A continuacin se exponen los apartados del texto base y las

respuestas de las cuestiones all planteadas en el mismo orden en el
que se encuentran en el libro.

Cabe destacar que la ltima versin del problema posee

caractersticas diferentes a las contempladas en el texto. Por ejemplo,
las concentraciones no pueden modificarse y las especies qumicas
son diferentes.

- Estudio de la composicin de la fase mvil, modo de

separacin, resolucin y selectividad.
Los cinco compuestos empleados han sido:
Benzofenona, butilparaben, etilparaben, propilparaben y 3-
nitrofenol.
A) Tanto la resolucin (separacin de picos), como el tiempo
de retencin, como el ensanchamiento de picos (resolucin
de la seal) varan con el modo de elucin, el eluyente y el
porcentaje del eluyente. a) Acetonitrilo, modo isocrtico, al
36 % ofrece una buena resolucin y separacin de picos con
tiempos de retencin entre 1 y 7 minutos. Mientras que b)
metanol, modo isocrtico al 45 % hace lo propio con tiempos
entre 1 y 8.5 minutos. C) Acetonitrilo en modo gradiente
ofrece una buena separacin y resolucin con unos tiempos
de retencin entre 2 y 4 minutos.
Cromatogramas:
c)

a)
b)

b)
* Los picos con menos resolucin son el butilparaben y la
benzofenona. * La resolucin se puede mejorar variando el
modo de elucin, el eluyente y el porcentaje de eluyente en el
caso de usar el modo isocrtico.
* El porcentaje de eluyente afecta a la selectividad (picos ms o
menos separados) adems de el modo de elucin y el tipo de
eluyente.
c) Las bombas de presin han de suministrar un flujo constante,
la diferente afinidad de los solventes con los compuestos a
separar hace que para mantener el flujo constante las bombas
tengan que aplicar una presin diferente dependiendo del
solvente utilzado.
- Estudio de la temperatura de la columna, velocidad de flujo y
volumen de inyeccin.
a) * Los tiempos disminuyen con el aumento de la temperatura
y viceversa.
* Al disminuir la temperatura aumenta ligeramente la resolucin
de algunos picos, mientras que otros apenas se ven afectados y
viceversa.
b) * El aumento de la velocidad de flujo disminuye el tiempo de
anlisis y viceversa.
* La resolucin de los picos prcticamente no se ve afectada.
c) * Ni el tiempo de anlisis ni la presin se ven modificadas por
el volumen de inyeccin.
* Si se aumenta el volumen de inyeccin la resolucin de los
picos disminuye
- influencia de la columna cromatogrfica (longitud y dimetro
de la columna, tamao de partcula)
a) * Con la longitud de la columna aumentan los tiempos de
retencin, la resolucin aumenta ligeramente con la longitud y
la presin tambin aumenta (y considerablemente) con la
longitud de la columna.
* Si el dimetro de la columna tiene valores muy elevados o
muy bajos la resolucin de la columna disminuye. Con valores
intermedios la resolucin no se ve afectada. La presin
aumenta con la disminucin del dimetro de la columna y
viceversa. Con un aumento del dimetro el tiempo de retencin
aumenta y viceversa.
b)* El tiempo de retencin no depende del tamao de partcula
* Aumentando el tamao de partcula la presin baja y
viceversa. El aumento de la presin al disminuir el tamao de la
partcula es debido a que la mezcla lquida de todos los
componentes son retenidos con ms intensidad en la columna
(la cual aumentara su superfcie en contacto con la mezcla) y
es ms costoso mantener un flujo contnuo.
* Los valores de k (retencin) no se ven afectados por el
tamao de la partcula y el ancho del pico aumenta con el
tamao de la partcula. En general, para valores bajos del
tamao de partcula, la separacin es ms eficiente que para
tamaos elevados de partcula.
c) * El factor A, aumenta el ancho de los picos (W) al aumentar
l mismo y al aumentar tambin disminuye la seal que se
detecta (nanometros/litro); con el aumento del factor B,
aumenta el valor de las seales de deteccin (nanometros/litro)
y tambin aumenta el rea de los picos; un aumento del factor
C, provoca un aumento del rea de los picos y un aumento
tambin de la respuesta del detector.
 * En general un aumento de cualquiera de los tres factores
revierte en una disminucin de la resolucin. El factor que ms
ejerce una influencia en la resolucin de los picos es el factor C,
ya que este factor se relaciona con la resistencia a la
transferencia de la masa de la fase mvil a la fase estacionaria
(transferencia de masa entre fases). El cual, es el proceso ms
crtico en una HPLC (cromatografa de alta resolucin de
lquidos).

RESULTADOS Y CONCLUSIONES
La prctica ha resultado interesante y se ha podido comprobar
los factores que afectan en una cromatografa HPLC.
- Respuestas a las cuestiones planteadas en el texto (en el
mismo orden que se encuentran en el libro)
Los compuestos utilizados para resolver las cuestiones, en lugar de los
indicados, dadas las limitaciones del software, son la acetofenona y el etil-
paraben. A una concentracin de 30 M cada uno.

a) Tiempos de retencin: acetofenona: 2.7963 min; etilparaben: 2.7990 min.

b) 56 % de metanol. Tiempos de retencin: acetofenona: 5.2417 min;
etilparaben: 7.0066 min.

a) Con acetonitrilo y manteniendo las ltimas condiciones del anterior ejercicio,

tenemos los siguientes tiempos de retencin: acetofenona: 4.6306 min;
etilparaben: 4.3480 min.
b) acetonitrilo: 32%. Tiempos de retencin: acetofenona: 9.4458 min;
etilparaben: 11.0894 min.
 Teniendo en cuenta los tiempos de retencin y lo importante que es que sean lo
mnimos posibles ya que se deben realizar muchos, elegira la primera utilizando
el metanol.
a) El aumento de flujo en ambos casos disminuye la resolucin y tambin
disminuyen los tiempos de retencin. La disminucin del flow rate provoca un
aumento en los tiempos de retencin y una disminucin en la resolucin de los
picos.
b) En el caso con el solvente metanol, no es necesario variar el porcentaje del
mismo anterior: 32 %.

Pero en el caso del acetonitrilo, se ha tenido que variar hasta un 25% del mismo.
 Como los compuestos pedidos en la cuestin no se encuentran en el software, se
ha procedido a realizar la separacin con los compuestos (9) que vienen por
defecto.Cromatograma:

En las siguientes capturas de pantalla se pueden apreciar las condiciones

utilizadas: