DETERMINACIN DE INGREDIENTE ACTIVO EN PLAGUICIDAS UTILIZANDO LA TECNICA DE

CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA. (HPLC)

OBJETIVO

Describir el procedimiento para la determinacin cuantitativa de ingredientes activos en plaguicidas, mediante

la tcnica de Cromatografa Liquida de alta eficiencia (HPLC) en la modalidad de fase reversa.

1. DESCRIPCIN

El personal a cargo de la aplicacin del mtodo debe estar familiarizado con conocimientos bsicos de
Qumica Analtica cualitativa y cuantitativa en el campo de la Cromatografa y conocimientos de
instrumental de Cromatografa Liquida de alta eficiencia (HPLC). As mismo debe conocer las medidas
indicadas en las fichas de Seguridad, tanto de los productos, solventes y otras sustancias qumicas
involucradas en el procedimiento y usar los elementos de proteccin (EPP) indicados.

La Cromatografa lquida de alta eficacia o High performance liquid chromatography (HPLC) es una
tcnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basndose en diferentes tipos de
interacciones qumicas entre las sustancias analizadas, la columna cromatogrfica y la fase mvil.

En esta tcnica el compuesto pasa por la columna cromatogrfica a travs de la fase estacionaria
mediante el bombeo de lquido (fase mvil) a alta presin a travs de la columna. La muestra a
analizar es inyectada y sus componentes se separan dependiendo de las interacciones con la fase
estacionaria a medida que pasan por la columna y la fase mvil. El grado de retencin de los
componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composicin de la fase
estacionaria y de la fase mvil. Los disolventes ms utilizados son el agua grado HPLC, el metanol y el
acetonitrilo. En algunas ocasiones se utilizan soluciones buffer que ayudan a la separacin de los
compuestos.

La cromatografa en fase reversa consiste en una fase inmvil apolar y una fase mvil de polaridad
moderada. El tiempo de retencin es mayor para las molculas de naturaleza apolar, mientras que las
molculas de carcter polar eluyen ms rpidamente.

La identificacin y cuantificacin del analito se realiza por la comparacin de los tiempos de retencin
en la columna de los estndares y analitos utilizados y por la relacin de integracin de las reas de
los picos cromatogrficos obtenidos de los mismos.

2. ALCANCE

Este procedimiento es aplicable para la determinacin de ingredientes activos en material tcnico y

formulaciones comerciales de plaguicidas por HPLC.

Los ingredientes activos analizados bajo este mtodo son relacionados en la tabla N 1 de los anexos.

3. DEFINICIONES

Estndar: Sustancia patrn de comparacin con concentracin, composicin y pureza conocida, que
permite la identificacin cualitativa y cuantitativa de un analito desconocido.

Tiempo de retencin: Es el tiempo transcurrido desde la inyeccin de un compuesto hasta la

aparicin del mximo correspondiente al pico cromatogrfico de ese compuesto.
4. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

4.1. Materiales.

Balones volumtricos de 25 mL
Columnas para HPLC C-18 (RP18 ODS2) o su homologa segn el fabricante.
Microjeringa de 10 L graduada para inyeccin automtica en HPLC.
Pipetas aforadas de 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 8 mL
Probetas graduadas de 1 L
Erlenmeyers de 1 L
Membrana para filtracin de agua 0,45 m
Membrana para filtracin de solventes 0,45 m
Viales para inyeccin automtica de 1.5 mL de capacidad dotados de tapa y septo, a la medida
del Rack del auto muestreador.

4.2. Reactivos.

Metanol grado cromatogrfico

Estndar analtico del ingrediente activo de pureza conocida y debidamente certificada.
Agua grado HPLC: Agua desmineralizada y luego filtrada en el sistema de filtracin a travs de
membrana millipore de 0,45 m hidroflico.
Acetonitrilo grado HPLC: filtrado por membrana millipore de 0,45 m para solventes orgnicos.

4.3. Equipos

Balanza analtica.
Bao ultrasnico.
Sistema de filtracin por membrana (0.45 m)
Bomba de vaco
Cromatgrafo Lquido de Alta Eficiencia con Detector UV-VIS provisto de auto muestreador y
software (Equipos: Lachrom-Merck Hitachi y Shimadzu-prominence).

5. PROCEDIMIENTO

5.1. Preparacin del Eluyente. Acetonitrilo: Agua

Mezclar X mL de Acetonitrilo grado HPLC con Y mL de Agua grado HPLC (previamente filtrados),
desgasificar en el bao ultrasnico por 15 minutos.

5.2. Preparacin del solvente. Acetonitrilo: Agua

Mezclar X mL de Acetonitrilo grado HPLC con Y mL de Agua grado HPLC (previamente filtrados), des
gasificar en el bao ultrasnico por 15 minutos.

Nota: Dependiendo del ingrediente activo se preparan las soluciones de solvente y eluyente, y
preparando la cantidad necesaria para el anlisis. Ejemplo: Si es acetonitrilo: agua (70:30) se
mezclan 700 mL de acetonitrilo y 300 mL de agua (ver Tabla N 1 en anexos).

5.3. Preparacin del estndar externo.

Pesar con aproximacin a la dcima de miligramo (0.0001g), la cantidad necesaria de estndar

analtico del ingrediente activo de pureza conocida en un baln volumtrico de 25 mL para obtener una
 solucin madre estndar en mg/mL (dependiendo del ingrediente activo se toma determinado peso del
estndar).
Llevar a volumen con el solvente y garantizar su completa disolucin con la ayuda del bao
ultrasnico.

Dejar temperar la solucin madre y tomar 4 alcuotas (diferentes mL dependiendo del ingrediente
activo) llevndolas a balones de 25 mL y aforando con el solvente, para tener concentraciones en
mg/mL. (Ver Tabla N 1 anexos).

5.2. Preparacin de la muestra.

Pesar por duplicado y con aproximacin a la dcima de miligramo (0.0001g), la cantidad necesaria de
muestra para obtener una solucin madre de ingrediente activo en balones volumtricos de 25 mL,
llevar a volumen con solvente y garantizar su completa disolucin con la ayuda del bao ultrasnico.
Dejar temperar y tomar una alcuota (dependiendo del ingrediente activo) en un baln de 25 mL y llevar
a volumen con solvente.

Nota: No de todas las muestras y estndares se necesita hacer solucin madre, se pesa
directamente en las concentraciones que se quiere tan el estndar como la muestra. En la Tabla
N 1 ANEXOS se indica el intervalo de concentraciones.

5.3. Condiciones del equipo y corrida cromatogrfica.

Una vez encendido el equipo se establecen las condiciones de la corrida cromatogrfica en el Sistema
de Datos de Cromatografa EZ_Chrom Elite. Software V 3.1 o, el SL Solution Shimadzu- 2004 en su
aplicacin de anlisis de proyectos segn los datos consignados en la tabla N 1 de los anexos

Bajo estas condiciones previas a la inyeccin, debe permitirse que el sistema cromatogrfico se
estabilice (presin y flujo constantes), lo que origina una lnea base constante y estable.

Posteriormente se debe verificar la conformidad del sistema, se debe observar que la respuesta del
blanco (solvente de los estndares y de la muestra) no interfiera con la seal correspondiente al
tiempo de retencin.

Se debe inyectar una muestra a fin de verificar la selectividad del sistema, es decir, que no existe
ninguna otra seal debida o otros ingredientes de la muestra a fin de que no interfieran con la seal
correspondiente al tiempo de retencin del ingrediente activo, el cual se espera a un tiempo de
retencin dependiendo del ingrediente activo (ver tabla N 1 del anexo).

Una vez verificada la selectividad del sistema introducir los datos de concentracin de los estndares,
peso de las muestras y factor de dilucin utilizados en la preparacin de las soluciones, las
condiciones de la bomba, del inyector, del detector, y parmetros de cuantificacin en el Sistema de
Datos de Cromatografa EZ_Chrom Elite. Software V 3.1, o, el SL Solution Shimadzu- 2004 en su
aplicacin de anlisis de proyectos y realizar la corrida cromatogrfica.

Nota: Al finalizar la corrida dejar pasar agua HPLC durante al menos 10 minutos para lavar el
sistema y liberarlo de residuos.

6. RESULTADOS Y ANALISIS

Los resultados por duplicado obtenidos en el anlisis no deben generar ms de un 3% de error relativo,
de lo contrario, se debe efectuar al menos una tercera determinacin.
La cuantificacin se realiza mediante la interpolacin del rea de la seal Cromatogrfica en el tiempo
de retencin correspondiente a la del ingrediente activo en la muestra, en la curva de calibracin
obtenida con los estndares del ingrediente activo. Estos resultados son dados por el Sistema de
Datos de Cromatografa EZ_Chrom Elite. Software V 3.1, o, el SL Solution Shimadzu- 2004 en su
aplicacin de anlisis de proyectos para la generacin del reporte.
7. FORMAS

Consignar los datos correspondientes al proceso en cada uno de los formatos siguientes, esta
operacin se debe realizar en forma simultnea al proceso:

Control de uso de estndares de plaguicidas. FORMATO 3-202. VERSION 01.2009.

Seguimiento a soluciones de estndares. FORMATO 3-482. VERSION 01.2009.
Determinacin de densidad. FORMATO 3-205. VERSION 01.2009.
Hoja de clculos. FORMATO 3-739. VERSION 01.2009.
Determinacin de ingrediente activo por cromatografa liquida (HPLC). FORMATO 3-727.
VERSION 01.2009.

8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Mtodo suministrado por el fabricante del producto.

CIPAC-handbook. Analysis of Technical Formulated Pesticides

AOAC, 17th Edition.

Manual de Instrucciones de Manejo de Equipo Lachrom y del Software y el SL Solution Shimadzu-

2004
 9. ANEXOS

Tabla No.1 Condiciones Para Cromatografa liquida (HPLC)

CONC. STD.
INGREDIENTE FLUJO
COLUMNA ELUYENTE en nm Tr (min) SOLVENTE CURVA OBSERVACIONES
ACTIVO mL/min
mg/mL

Abamectina RP-18 Acetonitrilo: Agua 70:30 245 3.39 Metanol 2 0.08-0.33

Acefato RP-8 Acetonitrilo: Agua 70:30 220 2.57 Eluyente 2 0.2-0.9

Acetamiprid RP-18 Acetonitrilo: Agua 45:55 254 2.1 Acetonitrilo: Agua 30:70 1.5 0.08-0.32

Acetoclor ODS2 Acetonitrilo: Agua 70:30 240 7.5 Eluyente 1 0.1-0.3 Ver en Gases
Acido Alfa Acetonitrilo: Buffer
RP-18 278 2.5 Acetonitrilo: Agua 40:60 1.5 0.04-.16
Naftalen Actico 40:60 pH 2.95
Acetonitrilo: Buffer
Acido giberelico ODS2 200 5.0 Eluyente 0.5 0.08-0.33
40:60 pH 2.95
Aldicarb RP-18 Acetonitrilo: Agua 70:30 200 1.4 Eluyente 1.0 0.04-0.16
Acetonitrilo: Buffer Isopropanol: H2O (2:1)+
Aminopyralid Zorbax SB 240 3.3 0.5 0.08-0.32
40:60 pH 2.95 KOH
En la muestra salen
varios picos por
Amitraz RP-18 Acetonitrilo: Agua 80:20 285 2.5 Acetonitrilo 2 0.08-0.32
posible hidrlisis
rpida

Acetonitrilo: Agua 70:30

Azimsulfuron ODS2 240 2.9 Acetonitrilo: Agua 70:30 1.0 0.04-0.28 Verificar
pH 3

Acetonitrilo: Buffer Acetonitrilo + sulfato de

Benomil RP-18 254 10.73 1 0.08-0.32
46:54 pH 2.5 sodio anhidro+ HCl

Bentazon ODS2 Acetonitrilo: Agua 60:40 240 1.6 Eluyente 1.0 0.04-0.16

Bifentrina RP-18 Acetonitrilo: Agua 90:10 235 2.5 Acetonitrilo 0.2 0.08-0.32
Bispiribac Sodio RP-18 Acetonitrilo: Agua 60:40 240 2.15 Eluyente 1 0.08-0.32

Bromacil RP-18 Acetonitrilo: Agua 36:64 254 Eluyente 2 0.08-0.32

Acetonitrilo: Agua 50:50
Captan RP-8 RP-18 210 5.5 Metanol 1.5 0.07-0.31
+ 0.04% H3PO4
Carbaril RP-8 y RP-18 Acetonitrilo: Agua 70:30 288 3.3 Eluyente 1 0.15-0.23

Acetonitrilo: Buffer 30:70 CH3CN + 2ml HCl en

Carbendazim ODS2 240 5.6 1.5 0.08-0.32
pH 7 solucin madre

Nova Pack
Carbofurano Acetonitrilo: Agua 70:30 270 3.7 Eluyente 1.5 0.04 - 0.16 Ver gases
C18

Carbosulfan RP-18 Acetonitrilo: Agua 90:10 280 2.7 Eluyente 0.15 0.08-0.32

Ciromazina RP-18 Acetonitrilo: Agua 80:20 230 1.5 Acetonitrilo: Agua 70:30 0.08 0.08-0.32
Acetonitrilo: Agua :
Clethodim ODS2 Acido Actico 254 6.5 Acetonitrilo 1 0.5-2.0
68.6:30:1.4
Clomazone RP-18 Acetonitrilo: Agua 88:12 241 1.1 Metanol 0.15 0.5-2.0 Ver Gases

Clorfenapyr RP-18 Acetonitrilo: Agua 90:10 205 1.17 Acetonitrilo: Agua 70:30 0.2 0.08-0.32
Acetonitrilo: Agua 70:30
Clorfluazuron RP-18 235 7.2 Metanol 1.2 0.08-0.25
+ 3ml acido actico

Acetonitrilo: Agua 40:60 CH3CN:NH4OH (0,01N)

Clorimuron Etil RP-9 254 13 1.5 0.5-2.0
pH 3 50:50

Clorpirifos RP-18 Acetonitrilo: Agua 82:18 289 1.67 Eluyente 1 0.08-0.32

Cyhalofop-p-Butyl RP-18 Acetonitrilo: Agua 85:15 235 2.6 Acetonitrilo 0.1 0.08-0.32

Cymoxanil RP-18 Acetonitrilo: Agua 60:40 240 3.6 Eluyente 1 0.08-0.32

 Cypermetrin RP-18 Acetonitrilo: Agua 90:10 230 1.2 Acetonitrilo 2 0.08-0.32 Ver Gases

Daminozide RP-18 Acetonitrilo: Agua 20:80 220 3.15 Agua 0.8 0.16-0.48

Deltametrina RP-18 Acetonitrilo: Agua 80:20 210 3.1 Acetonitrilo 0.15 0.04-0.18 Ver gases

Diafenthiuron RP-18 Acetonitrilo: Agua 90:10 240 3.0 Acetonitrilo 0.1 0.08-0.32
Acetonitrilo: Buffer Isopropanol: H2O (2:1)+
Diclorprop RP-18 278 7.23 1.5 0.5-1.5
40:60 pH 2.95 KOH
Diflubenzuron RP-18 Acetonitrilo: Agua 80:20 254 1.5 Acetonitrilo 0.13 0.08-0.32

Dimetomorf RP-18 Acetonitrilo: Agua 93:07 240 0.8 Acetonitrilo 0.2 0.04-0.16

Diuron ODS2 Acetonitrilo: Agua 90:10 240 1.0 Acetonitrilo: Agua 70:30 0.15 0.08-0.32
Famoxadone RP-18 Acetonitrilo: Agua 75:25 230 2.1 Acetonitrilo 0.12 0.04-0.1
Fenbuconazol RP-18 Acetonitrilo: Agua 50:50 254 7.7 Acetonitrilo 2.5 0.08-0.32

Metanol: Isooctano:
Fentin hidrxido RP-8 225 0.17 Metanol 0.3 0.08-0.32
H2SO4 0.1N 95.8:4:0.2

Fipronil RP-18 Acetonitrilo: Agua 90:10 254 1.75 Acetonitrilo: Agua 60:40 0.1 0.08-0.32

Fluazifop-p-butyl RP-18 Acetonitrilo: Agua 65:35 270 2.2 Eluyente 1.5 0.09-0.36 Ver gases

Fluazinam RP-18 Acetonitrilo: Agua 75:25 254 1.0 Acetonitrilo 0.1 0.08-0.32

Fluonicamid ODS2 Acetonitrilo: Agua 80:20 265 2.7 Eluyente 1 0.04-0.20

Flusilazol RP-18 Acetonitrilo: Agua 85:15 220 1.8 Acetonitrilo 0.1 0.08-0.32

Furametpyr ODS2 Acetonitrilo: Agua 50:50 254 6.5 Eluyente 1 0.08-0.32

Acetonitrilo: Agua 70:30

Halosulfuron Metil RP-18 240 3.9 Acetonitrilo 1 0.03-0.13
+ 0.5% Acido Actico
 Acetonitrilo: Agua 50:50 Puede ser la misma
Isopropanol: H2O (2:1)+
Haloxifop Methyl RP-8 + NaOH 0,3N y llevar a 230 2 0.27-0.3 tcnica del acido
KOH
pH 2,95 con H3PO4 2,4D
Hexythiazox RP-18 Acetonitrilo: Agua 89:11 240 3.1 Acetonitrilo 0.1 1.0-2.5

Imazapic RP-18 Acetonitrilo: Agua 80:20 254 0.7 Acetonitrilo 0.15 0.08-0.32
Acetonitrilo: Agua 15:85
Imazapyr RP-8 254 5.7 Eluyente 1.5 0.10-0.36
(0.05M) pH 2.1
Imidacloprid RP-18 Acetonitrilo: Agua 95:5 260 1.3 Acetonitrilo: Agua 60:40 0.07 0.04-0.16
Acetonitrilo: Buffer Isopropanol: H2O (2:1)+
Ioxinil Octanato Zorbax SB 240 9.8 1.0 0.5-1.5 Ver Gases
40:60 pH 2.95 KOH
Iprodione RP-18 Acetonitrilo: Agua 90:10 235 2.2 Acetonitrilo: Agua/ 70:30 0.08 0.08-0.32
Whatman
Acetonitrilo: Buffer 4:96 Usa Factor de
Kasugamicin Partisil SAX 235 4.5 Agua 0.5 0.08-0.32
pH 1.9 conversin
10
Lambda
RP-18 Acetonitrilo: Agua 90:10 230 3.0 Acetonitrilo 0.1 0.08-0.32 Ver Gases
Cyhalotrina
Lufenuron ODS2 Metanol: Agua 78:22 295 11 Metanol 1.5 0.5-2.0

Mandipropamid RP-18 Acetonitrilo: Agua 90:10 230 0.9 Acetonitrilo 0.15 0.08-0.32

Metamidofos ODS2 Acetonitrilo: Agua 6:94 214 4.25 Agua 1.2 1.5-3 Ver Gases

Ultra C-8
Acetonitrilo: Agua 40:60 215 4.1 Eluyente 0.7 0.5-2.0
Metil parathion Resteck
Acetonitrilo: metanol:
RP-8 269 6.91 Metanol 1 0.16-0.9
Metomil Agua 25:25:50
RP-18 Acetonitrilo: Agua 50:50 230 0.1 Eluyente 0.6 0.02.-0.08

Metoxifenozide
RP-18 Acetonitrilo: Agua 80:20 240 2.1 Acetonitrilo 0.1 0.08-0.32
Metrafenona
 RP-18 Acetonitrilo: Agua 90:10 280 1.6 Acetonitrilo 0.15 0.08-0.32
Metribuzin
RP-18 Acetonitrilo: Agua 42:58 254 2.6 Eluyente 1 0.08-0.32
Metsulfuron metil
Acetonitrilo:(Hidrxido de
RP-18 Acetonitrilo: Agua 40:60 254 0.24 2.3 0.5-2.0
Milbemectin amonio 0,01N) 50:50
RP-18 Acetonitrilo: Agua 85:15 250 8.0 y 10.3 Acetonitrilo 0.07 0.08-0.32
Monocrotofos
ODS2 Acetonitrilo: Agua 30:70 230 3.69 Eluyente 1 0.08-0.32 Verificar
Nicosulfuron Acetonitrilo: Agua 30:70
RP-18 230 10.8 Acetonitrilo 1 0.2-0.8
Orthosulfamuron pH 2
Acetonitrilo: Buffer Acetonitrilo: Buffer
ODS2#2 265 3.8 1.5 0.08-0.32
Oxicarboxin (KH2PO4 0.004M)/ 70:30 (NaHCO3 0.033M) 70:30
ODS2 Acetonitrilo: Agua 40:60 254 5.2 Acetonitrilo 1 0.04-0.16
Oxamil
RP-18 Acetonitrilo: Agua 70:30 240 2.45 Metanol 1 0.08-0.20
Permetrina
RP-18 Acetonitrilo: Agua 80:20 281 4.92 Metanol 1 0.22-0.46
Picloram
Acetonitrilo: Buffer Isopropanol: H2O (2:1)+
Zorbaz SB 254 4.3 0.5 0.08-0.33
40:60 pH 2.95 KOH
Piriproxifen
ODS2 Acetonitrilo: Agua 70:30 254 9.52 Eluyente 1 0.08-0.32
Acetonitrilo: Agua 60:40
Procloraz RP-8 290 4.93 Metanol 2 0.5-2.0
CH3COONa 0,1M
NH4OH:H2O:CH3OH
Propamocarb RP-18 205 1.06 CH3OH:H2O/ 80:20 0.2 0.5-2.0
0,8:19,2:80
Propanil RP-18 Acetonitrilo: Agua 90:10 285 0.9 Metanol 2 0.5-2.0 Ver gases

Propiconazol RP-18 Acetonitrilo: Agua 75:25 230 2.8 Acetonitrilo 0.1 0.08-0.32 Ver gases

Pyrazosulfuron etil RP-18 Acetonitrilo: Agua 80:20 254 0.4 Acetonitrilo 0.235 0.08-0.32

Pyrimethanil RP-8 Acetonitrilo: Agua 80:20 268 1.88 Eluyente 1.5 0.02-0.08
Pyrimidifen RP-18 Acetonitrilo: Agua 90:10 244 1.6 Acetonitrilo 0.2 0.08-0.32

Acetonitrilo: Agua 40:60

Acetonitrilo: Agua 40:60
+ H2SO4 0,5M (Se
+ H2SO4 0,5M (Para 1
Quinclorac RP-18 241 3.3 agrega 1,25ml de acido 1.5 0.04-0.16
Litro se agregan 5ml de
solo a la solucin madre
acido)
en un baln de 25ml)
Acetonitrilo: Metanol:
Spinosad Ods2 250 5.3 Metanol: Agua 50:50 1.5 0.18-0.31
NH4- COOH/ 45:45:10
Tetraconazol RP-18 Acetonitrilo: Agua 90:10 220 0.8 Acetonitrilo 0.2 0.08-0.32

Tetradifon RP-18 Acetonitrilo: Agua 75:25 255 5.5 Acetonitrilo 1 0.04-0.16

Thifluzamide RP-8 Acetonitrilo: Agua 65:35 265 4.2 Eluyente 1.5 0.04-0.16

Thiodicarb RP-18 Acetonitrilo: Agua 70:30 240 1.38 Acetonitrilo: Agua 50:50 1 0.8-0.32
Acetonitrilo: NH4OH
Tiabendazol RP-18 290 6.85 Metanol 1 0.03-0.14 Ver gases
60:40
Tiametoxan RP-18 Acetonitrilo: Agua 90:10 230 1.9 Acetonitrilo: Agua 60:40 0.7 0.08-0.32
Acetonitrilo: Buffer Isopropanol: H2O (2:1)+
Triclopyr RP-18 278 7.23 1.5 0.5-1.5 Verificar
40:60 pH 2.95 KOH
Triflumuron RP-18 Acetonitrilo: Agua 93:7 240 0.8 Acetonitrilo 0.2 0.08-0.32

Acetonitrilo: Buffer
Triflumizol RP-18 289 8.0 Acetonitrilo 1.5 0.5-2.0
KH2PO4. pH:4 58:42