UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(UNIVERSIDAD DEL PER, DECANA DE AMRICA)

FACULTAD DE MEDICINA SAN FERNANDO

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

BIOLOGA CELULAR Y MOLECULAR

TCNICAS DE OBSERVACIN DE LA CLULA Y

SUS COMPONENTES CELULARES: MICROSCOPA
PTICA, MICROSCOPA ELECTRNICA,
SEPARACIN SUBCELULAR, CULTIVO DE
CLULAS EN EL LABORATORIO
Biolg. Elizabeth Neira Alatrista
06/04/2017 E. NEIRA A. 2017 1
 PTICA
Es el estudio de la luz.
Grecia: luz procede de los cuerpos:
- ciertos cuerpos son fuentes de luz, al llegar a los
ojos produce la vista.
- otros absorven luz: reflejndola o dispersndola.
Fsica: la luz es producida por la propagacin de
ondas electromagnticas cortas.
 MICROSCOPA
Surgi por la inquietud del hombre de ver objetos
pequeos.
Ciencia que estudia objetos muy pequeos.
Ojo enfoca objetos desde el infinito hasta
250mm.
Se utiliza el microscopio.
Tcnicas y mtodos para hacer visibles objetos
que estn fuera del rango de la resolucin del ojo
humano normal.
 MICROSCOPIO
Zacharias Janssen, 1590, primer microscopio
compuesto.
Robert Hooke, perfecciona el microscopio, 1665
estudia cortes de corcho: poros llam clulas,
public su libro Micrographia.
Marcello Malpighi 1666, observ clulas vivas.
-XVII, Antonie van Leeuwenhoek fabric lentes:
bacterias, hongos, protozoos: animlculos.
 Primer microscopio

Anthony van Leeuwenhoek, 1676.

 MICROSCOPIO
XVIII, Chris Neros y Flint Crown objetivo
acromticos.
1877, Ernst Abbe: teora del microscopio, sustituy
el agua por el aceite de cedro: 2000 aumentos.
.1930 lmite terico para los microscopios pticos y
aumentos hasta 1000x.
Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania en 1931. TEM
1942 se desarrolla el microscopio electrnico de
barrido.
 RESOLUCIN
Poder de resolucin: Capacidad de separar o
discernir entre dos objetos muy cercanos entre s.

AN: Apertura numrica de lente

Mayor poder de resolucin Menor poder de resolucin

 Lmite de resolucin
Distancia mnima que debe existir entre dos
puntos para que sean discriminados como
tales.
Es inversa del poder de resolucin.
 LA LUZ

- Luz tiene una doble naturaleza:

Corpuscular y ondulatoria.

Propagacin rectilnea de la luz: consiguiendo

imgenes de objetos a travs de orificios muy
pequeos: cmara oscura
 LENTE
Sistema ptico centrado.
Limitado por 2 o ms superficies, medios refringentes
extremos tienen el mismo ndice de refraccin.
Tiene por lo menos una superficie curva, un eje comn.
Vidrio, cuarzo, sal de gema, KCl, etc.
Tipos: I. Sencilla y compuesta.
II: Delgada y gruesa.
 TIPOS DE LENTES
1) Convergentes: Rayos convergen para formar la imagen.
Distancia focal positiva, lente positiva.

2) Divergentes: Rayos divergen, distancia focal negativa,

imgenes y focos de las lentes son virtuales.
 MICROSCOPIO

Partes:
A) Mecnica:
Soporte o cuerpo
B) ptica:
Objetivo,
Ocular,
Condensador.
 OBJETIVO
Imagen: aumentada, real e
invertida.
Varias lentes sencillas o mltiples.
Sistema centrado y corregido de
aberraciones.
Clasificacin:
Panormico.
Menor aumento.
Mayor aumento.
Inmersin.
 OCULAR

Cilndro hueco, metlico.

2 sistemas de lentes convergentes.
Acta como lupa
Imagen: aumentada, virtual y derecha.
Consta: - lente ocular propiamente dicha,
- Diafragma,
- Lente de campo o colectora.
 FORMACIN DE LA IMGEN
Para localizar el punto imagen que de un objeto da una lente, debemos construir por lo menos la
trayectoria de dos de los rayos arriba mencionados. En el punto de cruce se forma el punto imagen:
 CONDENSADOR
Tubo metlico corto.
Sistema de lentes convergentes,
corregido de aberraciones.
Produce un cono amplio de luz.
Rayos convergen en un plano
superior del portaobjetos.

Suministra al objetivo un cono de luz de

tamao y naturaleza apropiada.
Ilumina la preparacin en la parte
enfocada.
Trayectoria de
los rayos
luminosos.
 MICROSCOPIO
DE CAMPO
CLARO

Bacillus subtilis: a) 100x, b) 400x, c) 1000x.

 M. DE LUZ O CAMPO CLARO
Algas: Volvox Cel. Vegetal: Elodea
 M. DE CONTRASTE DE FASES

O diferencial de fases.
Desarrollada por Friederick Zernike, 1942.
Visualiza muestras frescas sin alteraciones fsicas.
Altera la fase de las ondas que interfieren en el ocular.
Visualiza pequeas diferencias de grosor y densidad
del objeto.
Permite ver con detalle objetos transparentes.
 M. DE CONTRASTE DE FASES
Hace visible objetos transparentes que son
invisibles al microscopio de luz.
Se basa en las pequeas diferencias de grosor
entre los diferentes componentes celulares.
 M. DE CONTRASTE DE FASES
Placa de fase.

A B A
 Naegleria fowleri

Naegleria spp.

M
 M. DE CAMPO OSCURO

El condensador forma un cono hueco de luz.

Los rayos de luz cruzan el plano focal y quedan
fuera de la lente frontal del objetivo.
Pero la muestra recibe rayos perifricos, los
desva y penetran en la lente frontal del objetivo.
 M. DE CAMPO OSCURO

MICROSCOPIA DE
CAMPO OSCURO
M. CAMPO OSCURO
MICROSCOPIO
INVERTIDO
 MICROSCOPIO INVERTIDO

a b c

Ovocitos bajo el microscopio invertido de contraste de fases a 400x:

a) Ovocitos a 17 a 20 hrs. de la inseminacin, b) Ovocitos a las 48
hrs. c) Embrin a los tres das.
 M. DE POLARIZACIN
La luz normal es un tipo de
energa que viaja en lnea
recta a travs de ondas y
vibra en todos los planos
alrededor se su eje.
La luz polarizada se
diferencia con la luz
normal porque tiene un
solo plano de vibracin.
 MICROSCOPIA DE POLARIZACIN

Algunas sustancias: birrefringentes, hacen el girar el

plano de vibracin de la luz polarizada.
Birrefringente: Un rayo incidente es descompuesto en dos
rayos desigualmente refractados:
- Rayo ordinario
- Rayo extraordinario.
Monorrefringente: Velocidad de la luz es igual.
 M. DE POLARIZACIN

Polarizador y analizador cruzados: extincin de la luz.

 M. DE POLARIZACIN

Cristales de fosfato
minerales
calcita

a b
a) Depsitos amiloides perivasculares,
Cristaluria procedente de rojo de congo, 400x b) los mismos
depsitos mostrando birrefringencia
pacientes que padecieron VIH-1 perivascular en verde. Rojo de congo. M.
y/o SIDA tratados con indinavir de polarizacin. 400X.
Cruz de Malta
 M. DE FLUORESCENCIA
Fundamento:
Ciertas sustancia al ser irradiadas por una
corta, invisible o fra son capaces de emitir luz
con ms grande, visible.

Fluorescencia y fosforescencia: Fotoluminiscencia

Fluorescencia: propiedad de ciertas sustancias de emitir, bajo la
accin de una radiacin de corta longitud de onda, una radiacin
de onda larga.
Luz de fluorescencia se extingue a 10-8 seg. de la emisin del
estmulo excitante.
Fosforescencia: Persiste durante un tiempo mayor.
 FLUORESCENCIA PRIMARIA
Sustancias al ser radiadas con rayos ultravioleta
presentan fluorescencia de colores especficos.
Clorofila,porfirinas,glucsidos,alcaloides, purinas,
primidinas,cid.nucleicos,vitaminas,hormonas, etc.
Clulas hepticas y renales, granulaciones, tejidos
conjuntivos, tejido seo, etc.
Susts. con f. primaria: dan f. secundaria al
aplicarlos como colorantes: fluorcromos.
 FLUORESCENCIA SECUNDARIA
Fluorcromos: sustancias muy fluorescentes,
al aplicarlos en tejidos dan f. secundaria.
Ventaja: se utilizan muy diludos.
Fluorcromos se enlazan con las molculas
texturales de tejidos sin alterar su estructura.
Alta especificidad: identificacin del tejido por
la fluorescencia del fluorcromo asimilado.
Bacillus subtilis fluorocromizado con corifosfina.

Eritrocitos de rana con naranja de acridina, primulina

y pironina.

Cristales de vitamina B
Fase proliferativa del ciclo.

Endometrio secretor premenstrual.

Clulas epiteliales: Ncleo: azul,

microtbulos: verde, actina: rojo.
 M. DE
FLUORESCENCIA
 M. DE LUZ ULTRAVIOLETA
La imagen depende de la absorcin de esa luz por las
molculas de la muestra.
La luz UV tiene un de 200 nm, por lo tanto puede
alcanzar una resolucin de 100 nm.
La muestra no se observa a travs del ocular, porque que la
luz UV daa la retina y el ojo es insensible a este .
Imagen se registra en fotografas.
Utiliza lentes de cuarzo, lentes de vidrio: opacos y
absorben la luz UV.
 MICROSCOPIO CONFOCAL
1957, Marvin Minski, Microscopio de barrido
por etapas, de doble enfoque.
Permita observar con claridad capas sucesivas
de una muestra sin tener que rebanar el
espcimen en cortes finos.
Combina el Microscopio de fluorescencia con
imagen electrnica y puntos de luz
suministrados por lser dirigido al espcimen
en particular para obtener imgenes
tridimensionales.
 M. CONFOCAL
Objeto tridimensional, tiene
varios planos focales.
La luz de todos los planos es
refractada por la lente, pero solo
la que procede del plano central,
que est en foco (haz azul), es
capaz de pasar a travs del
pinhole, dando lugar a una
imagen ntida y perfectamente
definida de las estructuras
situadas en el plano focal sin
interferencia de la luz
procedente del resto del objeto.
 M. CONFOCAL
Se emplean haces de luz lser para iluminar la muestra.
Un ordenador recoge y agrupa las imgenes de cada punto
para formar una imagen tridimensional.

Permite controlar la
profundidad del campo
que se observa
eliminando o reduciendo
la informacin fuera del
plano.
Permite recolectar
secciones pticas
seriadas de especmenes
gruesos.
 La microscopa confocal utiliza como fuente de
luz un lser para controlar la profundidad de
campo y un pinhole (colimador de orificio
delimitante) para eliminar la luz desenfocada,
lo que permite la visualizacin de la imagen en
un plano horizontal simple.

Las imgenes deben teirse con

colorantes o anticuerpos fluorescentes
o poseer fluorescencia natural. Los
colorantes son excitados a travs de un
haz de lser
 MICROSCOPIO ELECTRNICO
Ernst Ruska y Max Knoll entre 1925 y 1932
disearon el primer M. electrnico.
Primer microscopio con 2 lentes electromagnticas
y una resolucin de 100 nm, ahora llega a 0.05 nm.
Utiliza electrones, en vez de fotones de luz, que se
comportan como los fotones en el vaco.
de los electrones es menor que de la luz
entonces alcanza mayor resolucin y mayores
aumentos.
Utiliza campos elctricos y magnticos.
 M.ELECTRNICO

Fuente: filamento calentado

que emite electrones
(ctodo).
nodo, hacia el cual son
atrados los electrones.
Una diferencia de potencial
entre el ctodo y el nodo
imparte un voltaje de
aceleracin entre 20.000 y
200.000 voltios a los
electrones, que forma el haz.
 M. ELECTRNICO
El haz pasa por una serie de electroimanes que
tienen las mismas funciones que las lentes de vidrio
de un microscopio ptico.
M.E. DE TRANSMISIN
 M. E. BARRIDO

- Utiliza electrones reflejados.

- Superficie de las muestras, imgenes
tridimensionales.
M. E. TRANSMISIN

virus del dengue

 MODELOS
EXPERIMENTALES
Organismo modelo:
Es estudiado para entender
fenmenos biolgicos que puedan
darnos una idea de cmo funcionan
esos procesos en otros organismos.
Son muy usados para analizar las
causas de enfermedades humanas y
posibles tratamientos que su
experimentacin en humanos es
contrario a la biotica.
Relacin evolutiva de todos los
organismos vivientes: ancestro
comn, metabolismo, material
gentico.
 Caenorhabditis elegans 1 mm long

Arabidopsis thaliana

El uso de los modelos experimentales en la

investigacin es determinante para el avance
del conocimiento.
Todos estos organismos modelos producen protenas que realizan las
mismas funciones bsicas que en los seres humanos: le indican al
organismo cundo y cmo crecer, reproducirse, combatir el estrs y
eventualmente morir, es decir, un organismo es modelo si est siendo
usado como un anlogo o que es ilustrativo para algo que por s mismo no
est bajo estudio directo,
 Mycoplasma

E, coli
CULTIVO CELULAR

Una de las primeras lneas

celulares humanas, obtenida
de Henrietta Lacks, quien
falleci de cncer de tero a
partir del cual se obtuvieron
estas clulas. El cultivo de
clulas HeLa que se muestra
en la imagen fue teido con
Hoescht que se une al ADN
coloreando de azul.
 CULTIVOS CELULARES
Sidney Ringer, 1836-1910, britnico, farmaclogo clnico,
invent la solucin de Ringer, mantena los latidos y el
ritmo del corazn de un animal estando fuera del cuerpo.
1885 Wilhelm Roux Zologo y embrilogo alemn, extrae
porcin de la mdula de el embrin del pollo, la mantuvo
en cultivo en una solucin salina: origen a los cultivos
tisulares.
Ross Granville Harrison, bilogo y anatomista
estadounidense, primero en trabajar con xito con cultivos
de tejidos artificiales.
En 1940 y 1950, cultivos para investigacin, vacunas, la
primera vacuna: la de la polio, creada por John Franklin
Enders , Thomas Huckle Weller y Frederick Chapman
Robbins los cuales ganaron un premio nobel por ese
hallazgo.
 CULTIVOS CELULARES
Crecimiento in vitro de clulas obtenidas de
organismos pluricelulares.
Tienen la categora de agentes biolgicos.
Pueden ser obtenidos a partir de explantes de
biopsias, fragmento de tejido escindido desde
un rgano o tejido, por perfusin de un
rgano especfico, por disgregacin de tejidos
o a partir de fluidos orgnicos como la sangre.
 CULTIVOS CELULARES
Clulas se obtienen en grandes cantidades.
Pueden observarse actividades celulares.
Responden al tratamiento con frmacos,
hormonas, factores de crecimiento y otras
sustancias activas.
Pueden diferenciarse.
 CULTIVO CELULAR
Es un modelo de estudio in vitro constituido
por clulas que pueden crecer mantenerse en
suspensin o en monocapa en condiciones
controladas.
Necesita, factores de crecimiento, hormonas,
nutrientes y cofactores, antibiticos.
CULTIVO CELULARES
 CULTIVO CELULAR
Tipos tipos:
Cultivo primario.
Cultivo secundario.
Lnea celular.
 CULTIVOS CELULARES
CULTIVO PRIMARIO
Se obtiene de un organismo
pluricelular.
100% cariotipo original.
Llega hasta 7 aprox. subcultivos.
Clulas crecen en monocapa,
tienen anclaje y son
diferenciadas.
LNEA CELULAR
Provienen de un cultivo
primario que ha sido sometido
a procesos que le conferirn
capacidad ilimitada de
multiplicacin o tienen origen
tumoral.
Estn formadas por clulas que
se diferencian gentica y
morfolgicamente de las clulas
de las cuales se originaron.
Proliferan de forma ilimitada.
 LNEAS CELULARES
Quedan establecidas cuando se demuestra su
potencialidad de replicarse indefinidamente.
Poseen propiedades conferidas por diferencias en la
dotacin cromosmica, aneuploida, mutacin o
transformacin gentica que deben persistir entre
sucesivos pasajes o subcultivos.
O cepas celulares con alguna caracterstica puntual pueden
ser seleccionadas especficamente mediante clonacin.
Prdida de anclaje, crecimiento flotante.
Prdida de crecimiento en monocapa.
Disminucin de requerimientos nutricionales.
 CULTIVOS CELULARES
Estudio virolgicos
Produccin de vacunas
Ingeniera de protenas
Estudios de interaccin/sealizacin celular
Produccin para transplantes
Reproduccin in vitro de plantas de inters
comercial
Ensayo de nuevos medicamentos
Estudio de toxinas
 Lneas celulares humanas
HeLa. Cncer cervical.
Hep-G2 Cncer de hgado.
DU145 ncer de prstata.
Lncap Cncer de prstata
MCF-7 Cncer de mama.
PC3 Cncer de prstata.
MDA-MB-438 Cncer de mama.
T4D Cncer de mama
THP-1 Leucemia mieloide aguda.
 FRACCIONAMIENTO CELULAR
Es la rotura de las clulas mediante un proceso
osmtico, ultrasonidos, lisis enzimtica o de manera
mecnica.
Al estudiar la funcin de una organela es necesario
separarla de la clula por centrifugacin diferencial:
Las partculas viajan hacia el fondo del tubo centrifugado a
diferentes velocidades.
 CENTRIFUGACIN DIFERENCIAL

Rotura mecnica de las clulas: homogenizacin. (buffer isotnico)

Centrifugacin cada vez con mayor fuerza..
Los organelos aislados conservan un nivel notable de actividad normal,
pudiendo ser utilizados en sistemas libres de clulas para estudio de
actividades celulares como mecanismo de transporte en membrana.
 FRACCIONAMIENTO CELULAR

Purificacin de fracciones subcelulares por centrifugacin de equilibrio con gradiente de

densidad. En este caso, el medio se compone de un gradiente de densidad continuo de
sacarosa y los distintos organelos se sedimentan hasta que llegan a un sitio en el tubo igual a
su propia densidad, donde forman bandas.
 CENTRIFUGACIN
Despus de obtenido el lisado o homogenado
celular se procede al fraccionamiento celular.
La tcnica ms empleada es la centrifugacin.
Centrfuga: instrumento que somete a
muestras a intensas fuerzas. El elelemnto
determinante es el rotor:
Rotor vasculante.
Rotor de ngulo fijo.
 CENTRIFUGACIN DIFERENCIAL
Se basa en la existencia de diferentes
partculas en la suspensin que difieren en su
densidad de la del medio.
Velocidad de sedimentacin, es la velocidad
necesaria para sedimentar las partculas para
realizar una centrifugacin en un medio en el
que exista una gradiente de densidad, siendo
e menor en la parte superior y mayor en la
inferior.