MOSQUITOS,

MINERA Y
PETRLEO.
LYSINIBACILLUS SPHAERICUS:
LA VERSATILIDAD DE UN MICROORGANISMO EN
BENEFICIO DEL AMBIENTE Y LA SALUD PBLICA
Jenny Dussn Garzn, Luca C. Lozano Ardila,
Tito D. Pea Montenegro, Vivian A. Bojac
http://bancaynegocios.com/wp-content/uploads/2013/07/000_Hkg8843310.jpg
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Culex_sp._Tanzania.jpg
Fotografa de Alejandro Arango, http://www.flickr.com/photos/alejoarango/4991333208/
Mosquitos, minera y petrleo.
Lysinibacillus sphaericus: la versatilidad
de un microorganismo en beneficio del
ambiente y la salud pblica

MS DE DOS DCADAS DE ESTUDIO

Jenny Dussn
Quizs lo ms maravilloso cuando nos acercamos al conocimiento del mundo microscpico es en-
Garzn
Ph. D., profesora asociada
tender cmo organismos con un tamao promedio de 1 m y un cromosoma casi mil veces ms del Departamento de
pequeo que el del hombre tienen una capacidad metablica incalculable que es funcional segn el Ciencias Biolgicas de la
ambiente donde se encuentre. Universidad de los Andes.
jdussan@uniandes.edu.co
Un ejemplo sorprendente es la bacteria Lysinibacillus sphaericus, un microorganismo que durante Luca C. Lozano
ms de veinte aos ha sido el actor central de los proyectos desarrollados por profesores y varias ge- Ardila
neraciones de estudiantes (microbilogos, bilogos, ingenieros qumicos, ambientales, etc.) vincula- Ph. D., investigadora del
dos al Centro de Investigaciones Microbiolgicas (CIMIC). El entendimiento de por qu este microor- Centro de Investigaciones
ganismo es tan particular y verstil nos ha posibilitado responder algunos interrogantes, como por Microbiolgicas de la
Universidad de los Andes
qu tiene capacidad para matar larvas de mosquitos que son vectores de enfermedades tropicales lulozano@uniandes.edu.co
como el dengue, qu caractersticas sobresalientes le permiten desarrollar una actividad fisiolgica
Tito D. Pea Monte-
negro
M. Sc., investigador del
Centro de Investigaciones
Microbiolgicas de la
Universidad de los Andes
td.pena86@uniandes.edu.co

Vivian A. Bojac
M. Sc., asistente graduada
del Departamento de
Ingeniera Civil y Ambiental de la
Universidad de los Andes
va.bojaca23@uniandes.edu.co

Figura 1. Microscopia electrnica de esporas de Lysinibacillus sphaericus.

Fuente: Klein D, Uspensky I, Braun S. Tightly Bound Binary Toxin in the Cell Wall of Bacillus sphaericus. Applied and Environmental Microbiology 2002;
68(7): 3300-3307, http://aem.asm.org/content/68/7/3300/F5.large.jpg. Se publica con autorizacin del American Society for Microbiology Journals.

42 Hiptesis, Apuntes cientficos uniandinos, nmero especial, 2013


Figura 2. Microscopia electrnica de clula vegetativa de Lysinibacillus sphaericus.
Fuente: Jenny Dussn Garzn, CIMIC. En [8].
especfica cuando se encuentra en suelos o cuerpos de agua
contaminados con compuestos provenientes de la extraccin de
petrleo, qu lo potencia para acumular en su superficie metales
como el plomo, cromo, uranio etc., por qu puede tener un papel
dual matar larvas de mosquitos y remediar ambientes.
En la dcada de los aos noventa, pensando que Colombia es
un pas megadiverso en flora y fauna, y que de la misma for-
ma seguramente lo era en la microbiota presente en ambientes
acuticos y terrestres, decidimos realizar un muestreo en varias
partes del territorio colombiano. La gran diversidad encontrada
nos llev a iniciar un viaje fascinante por el conocimiento, desde
el nivel microscpico hasta el molecular, de uno de los microor-
ganismos ms interesantes y verstiles del mundo microbiano.
Quin es Lysinibacillus sphaericus?
Lysinibacillus sphaericus (Ls), conocido antes como Bacillus
sphaericus, fue aislado en 1904 por Neide y Meyer en ambien-
tes acuticos [1]. Es un microorganismo que tiene la capacidad
de formar una estructura especializada conocida como espora,
que tienen una forma circular, en posicin terminal del esporan-
gio, y vista por el microscopio tiene forma similar a una raqueta
(figura 1 y 2) [2, 8].
En 2007 se propuso transferirlo al nuevo gnero Lysinibacillus,
por presentar lisina y asparagina en el peptidoglicano de la pa-
red celular [3]. Su importancia a nivel mundial, y por lo cual es
ampliamente conocido, qued asentada en los aos ochenta,
cuando la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) aprob el
control biolgico de mosquitos en pases tropicales con una
Figura 3.
Microscopia electrnica de la espora madura de Lysinibacillus sphaericus.
Fuente: Jenny Dussn Garzn, CIMIC. En [8].
formulacin mixta de dos bacterias: Bacillus thuringiensis y
Bacillus sphaericus [4]. En el ao 2006 el grupo de Pollmann
y colaboradores [5] lo aisl en una mina de uranio y encontr
uranio acumulado en una protena adherida a su pared celular,
hoy conocida como capa-S.
DCADA DE LOS AOS NOVENTA
L. sphaericus y su papel en el control de
mosquitos transmisores de enfermedades tropicales
Por qu L. sphaericus mata larvas de mosquitos que transmi-
ten enfermedades tropicales como el dengue?
Una de las caractersticas ms apasionantes que tienen las
bacterias que pertenecen al grupo conocido comnmente como
bacilos es la de formar una espora. Pero qu es una espora,
por qu la forman y qu ventaja le confiere a este tipo de mi-
croorganismos?
La vida del mundo microbiano se basa en utilizar los nutrientes
del medio que habitan estos microorganismos para metaboli-
zarlos, y en utilizar la energa y los compuestos obtenidos para
dividirse, generar ms clulas y continuar su crecimiento. Los
bacilos tienen en su genoma informacin gentica para respon-
der segn el ambiente en que se encuentre. Por ello pueden
detener el crecimiento y la divisin, y comenzar un proceso de
diferenciacin celular en el que forman una estructura espe-
cializada conocida como espora (figura 3) [8]. Particularmente,
L. sphaericus, durante el proceso de esporulacin, tiene una
ventaja especial: parte de su metabolismo puede sintetizar dos
Universidad de los Andes, Facultad de Ciencias 43
toxinas, conocidas como BinA de 42 kDa y BinB de 51 kDa, que
conforman el cristal paraesporal [6] y que tienen la capacidad
de matar larvas de mosquitos de los gneros Anopheles, Aedes
y Culex, vectores de enfermedades como la malaria, el dengue,
la filariasis, etc. (figura 4). Estas enfermedades, endmicas en
pases tropicales, se propagan por medio de los mosquitos, y
el ciclo se ve favorecido por las condiciones climticas, lo cual
genera un problema de salud pblica [7]. No es de extraar,
entonces, que a comienzos de los noventa iniciramos un mues-
treo por Colombia en busca del L. sphaericus, con el objetivo de
encontrar cepas nativas con actividad entomopatgena.
En regiones como la zona del Pacfico, del Atlntico, los Lla-
nos Orientales y el altiplano cundiboyacense realizamos ms de
quinientos aislamientos, a partir de los cuales seleccionamos
veintids cepas con caractersticas tpicas de Ls y activas contra
larvas de tercer instar de Culex quinquefasciatus, entre las que
producan una mortalidad del 100% en 24 horas, comparable a
la de la cepa de referencia 2362 del L. sphaericus de la OMS
(figura 5) [8].
Con estos resultados iniciamos la lnea de investigacin de L.
sphaericus en control biolgico de Culex quinquefasciatus. Los
estudios a nivel fisiolgico, bioqumico y molecular de las veinti-
ds cepas determinaron que tenamos Ls con alta, media y baja
actividad entomopatgena. Se evidenci la actividad y codifica-
cin gentica de la toxina binaria, y en algunas de las cepas
estudiadas encontramos otras protenas toxgenas, como la Mtx-
Figura 4. Adulto de Culex quinquefasciatus.
Fuente: http://phil.cdc.gov/PHIL_Images/02122002/00025/PHIL_1771.tif
44 Hiptesis, Apuntes cientficos uniandinos, nmero especial, 2013
1, Mtx-2 y Mtx-3, activas tambin contra mosquitos cuando la
bacteria se encuentra en estado vegetativo y no en espora [9].
Los resultados de su gran capacidad de ejercer control biolgico
han sido an ms interesantes porque en los proyectos actuales
se ha podido relacionar su actividad toxignica con la de otra
protena, conocida como capa-S [10]. Entonces, es un hecho
que la gran diversidad y la alta actividad entomopatgena del L.
sphaericus podra ser utilizada en formulaciones para el control
integrado de plagas de mosquitos presentes en regiones donde
ao tras ao se reportan brotes de dengue, una enfermedad que
merece toda la prevencin y atencin.
PRIMERA DCADA DEL SIGLO XXI
L. sphaericus y su impacto en la minera:
biorremediacin de metales
Por qu este microorganismo puede acumular en su superficie
metales como el plomo, cromo y uranio?
La remocin de metales constituye uno de los mayores retos de
descontaminacin de ambientes a nivel mundial, y, por supues-
to, a nivel nacional, debido a que entre las fuentes de contami-
nacin se encuentran los procesos de extraccin de recursos
naturales como el carbn, los minerales y el petrleo. Tambin
se ha reportado contaminacin por procesos industriales como
la fabricacin de bateras, pinturas, revestimientos, soldaduras y
curtiembres, adems de productos de uso agropecuario, como
Figura 5. Larva de Culex quinquefasciatus.
Fuente: http://phil.cdc.gov/PHIL_Images/12554/12554.tif
pesticidas, fertilizantes y aditivos de alimentacin animal [10].
Entre 2003 y 2007, en diferentes sitios del mundo dedicados a
la minera, se aislaron bacterias cuya clasificacin corresponda
a L. sphaericus. Result muy interesante determinar que en la
parte externa de su pared tenan metales acumulados en una
cubierta hexagonal que recuerda una cubeta llena de huevos (fi-
gura 6). Los trabajos de Pollmann con la cepa del L. sphaericus
JG-A12 mostraron cmo este hallazgo podra derivar en alter-
nativas para el tratamiento in situ de aguas de minas de uranio
[11]. Los estudios bioqumicos y moleculares demostraron que
la bioadsorcin se deba a la presencia de una protena conocida
como capa-S, que conforma nanoclsters en los que se pueden
acumular diferentes tipos de metales [11]. Otro mecanismo am-
pliamente descrito, relativo a un grupo de microorganismos muy
diferentes de los bacilos, es la presencia de bombas de eflujo
que permiten la entrada de compuestos, antibiticos y otros ele-
mentos como metales a la clula [12].
As pues, necesariamente tenamos que responder tres pre-
guntas: Los aislamientos de L. sphaericus que previamente
habamos estudiado en control de mosquitos tambin tenan la
capacidad de acumular metales como el plomo, cromo, arsnico
y mercurio? La protena capa-S, responsable de la bioadsor-
cin/unin de metales en estos microorganismos se encontraba
presente? Pueden tener bombas de eflujo para la entrada y
remocin de metales por acumulacin interna? Entonces, a co-
mienzos del ao 2000 iniciamos una nueva lnea de investiga-
cin centrada en L. sphaericus y la biorremediacin de metales.
Decidimos trabajar con lodos aceitosos provenientes de los pro-
cesos de extraccin del petrleo, que tienen diferentes metales
asociados; por lo tanto, estos residuos se convierten en pasivos
ambientales de gran impacto en las regiones de los Llanos y la
Orinoquia colombianos. La capacidad de bioadsorcin de arsni-
co, cobalto y cromo fue evidente en varias de las cepas estudia-
das. De igual forma, aislamientos con alta actividad toxignica
contra larvas de Culex quinquefasciatus mostraron tolerancia a
concentraciones mayores de 10.000 ppm de arsenato, de 750
ppm de plomo y de 200 ppm de cromo hexavalente [13]. En
todos los aislamientos estudiados se determin la presencia de
la protena capa-S (> 100KDa), con una alta expresin durante
la fase vegetativa de crecimiento (no en espora) (figura 7) [14].
Adicionalmente se encontr nquel en extractos celulares y plo-
mo atrapado en el periplasma y la membrana celular (resultados
actuales) (figura 8 y 9) [12, 15]. De manera que es probable
que este microorganismo tenga mecanismos dependientes de
bombas de eflujo tambin para acumular metales. Estos resulta-
dos en remocin de metales mostraron el potencial de este mi-
croorganismo y su aplicacin en un futuro cercano en procesos
de biorremediacin en campo impactados por la extraccin de
recursos naturales como petrleo y minera.
Universidad de los Andes, Facultad de Ciencias 45
Figura 6. Vista tridimensional de una capa recristalizada de protenas CapaS de Lysinibacillus sphaericus por microscopa de fuerza atmica.
Fuente: Tomado de Progress in Organic Coatings 47, Sleytr et al. 2003.

1 2 3 4 5 M
250 kDA

148 kDA

98 kDA

64 kDA

50 kDA

36 kDA

Figura 7. Electroforesis de protenas extraidas de cultivos en fase vegetativa de Lysinibacillus sphaericus. La banda de alto peso molecular (mayor a 148 kDa) corresponde a protenas Capa-S.
Fuente: Fotografa de Luca C Lozano Ardila, CIMIC. En [10].

46 Hiptesis, Apuntes cientficos uniandinos, nmero especial, 2013

DCADA DE 2010
L. sphaericus y la era de las micas:
genmica, transcriptmica filogenmica y ms petrleo
En este fascinante viaje por el conocimiento y entendimiento
de la versatilidad metablica del L. sphaericus necesariamen-
te tenamos que detenernos y preguntarnos: Cmo podemos
profundizar ms en el conocimiento de este microorganismo y
entender su relacin con los aislamientos de otras partes del
mundo? Naturalmente, la respuesta nos condujo a la secuencia-
cin del genoma de aislamientos, que mostraron los resultados
ms interesantes, menos similares al comportamiento espera-
do, con mayor versatilidad en cuanto a remocin de metales,
al tipo y nmero de metales absorbidos y/o acumulados y a la
actividad entomotoxignica contra mosquitos. Del gnero Lysi-
nibacillus se encuentran secuenciados hasta el momento cinco
genomas, uno de los cuales corresponde a L. sphaericus, cepa
C3-41, patgena para larvas de mosquitos comercializada prin-
cipalmente en China [16]; Lysinibacillus fusiformis, cepas ZC1,
que presenta la capacidad de reducir cromo hexavalente [17], y
cepa ZB2; Lysinibacillus massiliensis 4400831 y Lysinibacillus
boronitolerans F1182 [18].
As, en el inicio de esta tercera dcada de estudio del L. sphae-
ricus nos hemos concentrado en el anlisis de las secuencias
de los genomas de dos aislamientos nativos. La cepa CBAM5,
aislada a partir de muestras de lodos corte-base-aceite prove-
nientes de la exploracin petrolera en la regin del Casanare
[19]. En la secuencia de su genoma se determin la presencia
de genes que codifican para toxinas con actividad larvicida en
mosquitos, genes relacionados con la protena de capa-S, as
como genes involucrados en la resistencia a arsnico, cromo
y plomo [20].
Figura 8.
Microscopa electrnica de barrido de clulas vegetativas de Lysinibacillus sphaericus cepa
OT4b.31.
Fuente: Fotografa de Tito D Pea Montenegro, CIMIC. En [21].
En el segundo aislamiento, L. sphaericus OT4b.31, proveniente
de larvas de coleptero encontradas en la sabana de Bogot,
identificamos diferentes regiones con operones implicados en
la bioacumulacin de Cd, Zn, Co, Cu, Ni, Cr y As, al igual que
secuencias codificantes y homlogas para la protena de la
capa-S, genes implicados en la degradacin de hidrocarburos
aromticos como el tolueno y el fenol, y ningn gen compartido
codificante para la toxicidad de mosquitos (figura 10) [21].
Qu significado, en trminos de aplicacin ambiental y salud
pblica, aporta la secuenciacin de genomas? Pues bien, el
hecho de tener secuenciados los genomas de varias cepas
del gnero Lysinibacillus nos permitir, desde el conocimiento
bsico, continuar relacionando las actividades biolgicas con
los genes que las codifican, y as podremos dirigir los estudios
de transcriptomas para la expresin de genes especficos de
inters en condiciones ambientales con miras a la remocin de
metales y a la actividad entomopatgena. Por otra parte, con
los genomas secuenciados trataremos de entender y acerca-
nos ms a la clasificacin filogentica de este grupo de mi-
croorganismos que siempre ha sido controvertida y modificada
[22]. La utilizacin de la filogenmica es importante porque se
presenta como una nueva alternativa en la que los genes con
anotacin funcional presentes en los genomas secuenciados
permiten realizar la comparacin y clasificacin de organismos
de forma ms discriminada [12]. Los dos genomas secuencia-
dos mostraron un plus adicional en L. sphaericus: la capacidad
de degradar compuestos aromticos y saturados. De manera
que con algunos de los aislamientos de mayor inters extrados
de los lodos aceitosos grado API medio y liviano provenientes
de la regin del Casanare iniciamos una evaluacin preliminar.
Los resultados obtenidos hasta el momento han mostrado que
la anotacin en los genomas de las cepas CBAM5 y OT4b.31
es funcional y se expresa exitosamente en trminos de de-
120%
100%
80%
Concentracin relativa
60%
40%
20%
0%
CBAM5 3(III)7 Ot4b31
Citoplasma Membrana Periplasma
Figura 9.
Absorcin de plomo en periplasma, membrana celular y citoplasma de clulas vegetativas de
Lysinibacillus sphaericus cepa OT4b.31.
Fuente: Imagen de Vivian Andrea Bojac, CIMIC. En [15].
Universidad de los Andes, Facultad de Ciencias 47
Figura 10. Mapa genmico de Lysinibacillus sphaericus cepa OT4b.31. Desde fuera hacia el centro: scaffolds orientados y ordenados cromosomales (azul y rojo) y extracromosomales (naranja y
negro), genes anotados en cadena positiva, genes anotados en cadena negativa, genes de RNA, contenido de GC y GC skew.
Fuente: Imagen de Tito D Pea Montenegro, CIMIC. En [21].
gradacin de lodos aceitosos provenientes de las prcticas de
explotacin del petrleo.
Importancia de la riqueza presente en Colombia
de L. sphaericus
Luego de ms de dos dcadas de estudio de la bacteria L.
sphaericus podemos afirmar que Colombia posee una riqueza
de valor incalculable de este microorganismo. Ubicados en el
trpico, donde la presencia de mosquitos vectores de enferme-
dades como el dengue es un problema de salud pblica que
merece atencin, L. sphaericus es una excelente opcin para el
manejo de plagas en pocas de invierno, pues est ampliamente
documentado que las cepas nativas pueden ejercer control bio-
lgico al matar larvas de Culex quinquefasciatus por tres meca-
nismos: 1. Produccin de la toxina binaria (BinA, BinB) durante
la esporulacin; 2. Produccin de toxinas Mtx-1, Mtx-2 y Mtx-3
por la clula vegetativa, y 3. Por la protena capa-S, asociada a
la pared celular durante el crecimiento exponencial.
En el campo de la biorremediacin, la aplicacin del L. sphaeri-
cus es fundamental y prioritaria. Colombia cuenta con una gran
48 Hiptesis, Apuntes cientficos uniandinos, nmero especial, 2013
riqueza de recursos naturales en carbn, minera y petrleo. Sin
embargo, las prcticas de explotacin de estos recursos gene-
ran altsimos impactos ambientales por los residuos slidos y/o
lquidos que quedan como pasivos en el suelo o que terminan
contaminando aguas y, en consecuencia, generando un proble-
ma de salud pblica y efectos negativos en la flora, fauna y la mi-
crobiota de la regin afectada. En el sector minero, por ejemplo,
para la extraccin de metales como el oro se generan residuos
con altas concentraciones de otros metales sin valor comercial,
pero sumamente txicos, como el arsnico, el cromo y el plomo,
que son separados a su vez con cianuro o mercurio para obtener
el oro puro, etc. Estos elementos nocivos son comparables con
los lodos aceitosos provenientes de la explotacin del petrleo,
que vienen igualmente acompaados con alta concentracin de
metales muy txicos, como el bario, el cadmio y el plomo. De
manera que la implementacin de la capacidad dual que tie-
ne L. sphaericus en la remocin por adsorcin y/o acumulacin
de diferentes metales por los dos mecanismos documentados
bombas de eflujo o por adsorcin a la protena capa-S,
contribuira inmensamente al desarrollo de tecnologas limpias,
amigables con el ambiente, y se reflejara en el crecimiento del
sector minero debido a la innovacin de tecnologas dirigidas
a la captura de metales de inters econmico en cuerpos de
agua, as como a las prcticas generales de biorremediacin de
pasivos ambientales provenientes de la extraccin del petrleo.
Nota
El conocimiento ao tras ao ha sido enriquecedor gracias a
la tesis doctoral de Luca C. Lozano Ardila (2012), las tesis de
maestra de Diana R. Andrade Linares (1997), Luca C. Lozano
Ardila (1998), Sandra del Pilar Vanegas Moyano (2001), Geidy X.
Ortega Trujillo (2004), Julin E. Zamora Prieto (2006), Silvia C.
Rivera Rodrguez (2007), Lina Velsquez Brun (2009), Vivian A.
Bojac Bautista (2013), Tito D. Pea Montenegro (2013), Javier
E. Vargas Calle (en curso), Lina E. Manchola Muoz (en curso),
Daro A. Rangel Shaw (en curso) y los trabajos de pregrado de
Silvia C. Rivera Rodrguez (2005), Ruth Ortiz Castro (2007), Lina
Velsquez Brun (2008), Vivian A. Bojac Bautista (2010) y Javier
E. Vargas Calle (2012).

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