RECUPERACION DE LA INSULINA

Cosecha celular El primer paso de la ruta de bioseparacin consiste en la

recuperacin de las clulas por centrifugacin. El caldo concentrado se enva a un
tanque de almacenamiento V-106 que es la interface entre las operaciones previas
y las bioseparaciones. Este paso se realiza por medio de 3 centrfugas de disco
operando en paralelo DS-101 (slo se muestra una en el diagrama), bajo el
procedimiento 9 (P-9). El lodo recuperado se diluye con una solucin de EDTA en
buffer TRIS en el tanque de mezclado V-109 para facilitar la separacin de los CI
(Cuerpos de inclusin) de los restos celulares.

Rompimiento celular y recuperacin de CI En este caso, el producto es

intracelular y se requiere el rompimiento de las clulas por medio de
homogeneizadores de alta presin HG-101 para liberar los CI. El homogeneizado
obtenido es centrifugado para recuperar los CI, utilizando las mismas centrfugas
DS-101 bajo el procedimiento 13 (P-13). Los CI se recuperan en la fase pesada y
la mayora de los restos celulares quedan en la fase ligera, debido a la mayor
densidad y tamao de los CI. La fase pesada es mezclada con una solucin del
detergente Tritn X100 y recentrifugada en las centrfugas DS-101. Este lavado
facilita la separacin de los CI de protenas solubles y restos celulares.

Solubilizacin de CI La suspensin que contiene los CI se transfiere a un reactor

recubierto de vidrio V-103, donde se hace reaccionar con urea y 2-mercaptoetanol.
La urea es un agente caotrpico que disuelve las protenas desnaturalizadas de
los CI y el 2-mercaptoetanol es un agente que reduce los enlaces disulfuro. Al final
de la reaccin de solubilizacin, se reemplaza la urea y el 2-mercaptoetanol por
agua para inyeccin (API) y se concentra la solucin en la unidad de diafiltracin
DF-101. Las partculas finas remanentes se eliminan en el filtro DE-101 para evitar
problemas en los equipos de cromatografa.

Reacciones
Rompimiento con CNBr La protena quimrica Trp-LE-Met-proinsulina es
fragmentada utilizando bromuro de ciangeno (CNBr) en una solucin de cido
frmico en el reactor V-103, obtenindose la proinsulina desnaturalizada y la
secuencia Trp-LE-Met. La proinsulina se obtiene intacta ya que no contiene
residuos de metionina ni triptfano que son los sitios donde hidroliza el CNBr. Al
final de esta reaccin, el cido frmico, el CNBr que no reaccion y el gas cianuro
producido se eliminan en un evaporador rotatorio al vaco CSP-101. El gas cianuro
es txico y es necesario eliminarlo en un adsorbedor con una solucin de
hipoclorito.

Sulfitolisis La sulfitolisis de la proinsulina desnaturalizada se efecta en

el reactor V-105, adicionando hidrocloruro de guanidina (GuHCl), bicarbonato
de amonio (NH4HCO3), sulfito de sodio (Na2SO3) y tetrationato de sodio
(Na2S4O6). Esta operacin se utiliza para desdoblar la proinsulina, romper los
enlaces disulfuros y adicionar grupos sulfito (SO32) a los residuos de azufre
de las cistenas. Este paso es necesario debido a que la proinsulina puede no
estar correctamente plegada desde su sntesis o porque el tratamiento con CNBr
rompe enlaces disulfuro existentes. El GuHCl previene el replegamiento de la
molcula y el entreplegamiento entre distintas molculas. Al final de la sulfitolisis la
solucin es diafiltrada con API en la unidad DF-101.

Concentracin

Cromatografa de intercambio inico La proinsulina (S-SO3) obtenida en el

paso anterior, se hace pasar por tres columnas de intercambio catinico de S-
sefarosa (sulfopropil) C-101operando en paralelo. En la elucin de la columna se
utiliza una solucin de urea para prevenir el replegamiento. La operacin permite
concentrar la solucin y eliminar protenas contaminantes.

Replegamiento Esta operacin permite la remocin de los grupos sulfito

(SO32), la formacin de los enlaces disulfuro y el plegamiento correcto de la
proinsulina en su forma nativa. Se realiza en el reactor V-107 e involucra una
reduccin con una solucin diluida mercaptoetanol (MrEtOH) que facilita la
formacin de los enlaces disulfuro y evita entre-plegamiento. Al final del paso
de replegamiento el MrEtOH se sustituye por API y se concentra la solucin en
la unidad de diafiltracin DF-102. La solucin de proinsulina obtenida se hace
pasar por una columna de cromatografa de interaccin hidrofbica C-102 (HIC
de sus siglas en ingls), para eliminar gran parte de las protenas contaminantes.

Conversin enzimtica La remocin de la cadena C de la proinsulina

que conecta las cadenas A y B, se realiza enzimticamente utilizando tripsina
y carboxipeptidasa B en el reactor V-108. La tripsina rompe en el extremo
carboxi entre residuos lisina y arginina. La carboxipeptidasa B remueve grupos
aminocidos terminales. La solucin obtenida se lava con API y se concentra 4
veces en la unidad de diafiltracin DF-102.
Purificacin
Cromatografa de intercambio inico La insulina se purifica mediante
una secuencia cromatogrfica multimodal basada en diferencias de carga,
hidrofobicidad y tamao entre la insulina y sus contaminantes. El primer paso de
purificacin de la solucin que contiene la insulina se realiza en una columna
de intercambio catinico de S-sefarosa C-103. En este paso se elimina gran parte
de la proinsulina no convertida y de las protenas contaminantes. Al final de la
operacin se lava la solucin para eliminar el buffer de elucin con API y se
concentra la solucin dos veces en la unidad de diafiltracin DF-103.

Cromatografa de fase reversa La purificacin contina utilizando la

columna C-104 de cromatografa de alta resolucin de fase reversa (RP-HPLC)
de cido fenil-bornico (PBA). Mediante la operacin se logra eliminar las diversas
proinsulinas y el resto de las protenas contaminantes. La solucin obtenida se
lava con API y se concentra 2 veces en la unidad de diafiltracin DF-103.
Cromatografa de filtracin en gel La purificacin se completa en una
columna de filtracin en gel C-105 en donde la insulina se obtiene prcticamente
pura. Al final de la operacin la solucin se lava con API y se concentra 10 veces
en la unidad de diafiltracin DF-104.

Acabado
Cristalizacin La solucin obtenida se alimenta a un cristalizador enchaquetado
V-111, donde se mezcla con acetato de amonio (CH3-COO-NH4)
y cloruro de cinc (ZnCl2) . La insulina cristaliza como Zn2-Insulina6. Al final
de la cristalizacin, los cristales son recuperados en una centrfuga de canasta
BCF-101.

Secado Finalmente, los cristales se secan en el liofilizador FDR-101. El

rendimiento global del bioproceso es del 32% y la pureza de la insulina obtenida
vara entre 99.5 a 99.9%.