Cintica enzimtica

La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones qumicas que

son catalizadas por las enzimas. El estudio de la cintica y de la dinmica qumica de una
enzima permite explicar los detalles de su mecanismo cataltico, su papel en el metabolismo,
cmo es controlada su actividad en la clula y cmo puede ser inhibida su actividad
por frmacos o venenos o potenciada por otro tipo de molculas.

Las enzimas, en su mayora, son protenas con la capacidad de manipular otras molculas
sin ser alterados por la reaccin,1esas molculas son denominadas sustratos. Un sustrato es
capaz de unirse al sitio activo de la enzima que lo reconozca y transformarse en un producto
a lo largo de una serie de pasos denominados mecanismo enzimtico. Algunas enzimas
pueden unir varios sustratos diferentes y/o liberar diversos productos, como es el caso de
las proteasas al romper una protena en dos polipptidos. En otros casos, se produce la
unin simultnea de dos sustratos, como en el caso de la ADN polimerasa, que es capaz de
incorporar un nucletido (sustrato 1) a una hebra de ADN (sustrato 2). Aunque todos estos
mecanismos suelen seguir una compleja serie de pasos, tambin suelen presentar una etapa
limitante que determina la velocidad final de toda la reaccin. Esta etapa limitante puede
consistir en una reaccin qumica o en un cambio conformacional de la enzima o del sustrato.

El conocimiento adquirido acerca de la estructura de las enzimas ha sido de gran ayuda en la

visualizacin e interpretacin de los datos cinticos. Por ejemplo, la estructura puede sugerir
cmo permanecen unidos sustrato y producto durante la catlisis, qu cambios
conformacionales ocurren durante la reaccin, o incluso el papel en particular de
determinados residuos aminocidos en el mecanismo cataltico. Algunas enzimas modifican
su conformacin significativamente durante la reaccin, en cuyo caso, puede ser crucial
saber la estructura molecular de la enzima con y sin sustrato unido (se suelen usar anlogos
que se unen pero no permiten llevar a cabo la reaccin y mantienen a la enzima
permanentemente en la conformacin de sustrato unido).

Los mecanismos enzimticos pueden ser divididos en mecanismo de nico sustrato o

mecanismo de mltiples sustratos. Los estudios cinticos llevados a cabo en enzimas que
solo unen un sustrato, como la triosafosfato isomerasa, pretenden medir la afinidad con la
que se une el sustrato y la velocidad con la que lo transforma en producto. Por otro lado, al
estudiar una enzima que une varios sustratos, como la dihidrofolato reductasa, la cintica
enzimtica puede mostrar tambin el orden en el que se unen los sustratos y el orden en el
que los productos son liberados.

Sin embargo, no todas las catlisis biolgicas son llevadas a cabo por enzimas proteicas.
Existen molculas catalticas basadas en el ARN, como las ribozimas y los ribosomas,
esenciales para el splicing alternativo y la traduccin del ARNm, respectivamente. La
principal diferencia entre las ribozimas y las enzimas radica en el limitado nmero de
reacciones que pueden llevar a cabo las primeras, aunque sus mecanismos de reaccin y
sus cinticas pueden ser estudiadas y clasificadas por los mismos mtodos.
Principios Generales

La reaccin qumica catalizada por una enzima utiliza la misma cantidad de sustrato y genera
la misma cantidad de producto que una reaccin no catalizada. Al igual que ocurre en otros
tipos de catlisis, las enzimas no alteran en absoluto el equilibrio de la reaccin entre
sustrato y producto.2 La eficiencia de la reaccin, hasta el momento en que todos los sitios
posibles estn ocupados. En ese momento se habr alcanzado el punto de saturacin de la
enzima y, aunque se aada ms sustrato, no aumentar ms la eficiencia.

Ensayos Enzimaticos

Un ensayo enzimtico es un procedimiento, llevado a cabo en un laboratorio, mediante el

cual se puede medir la velocidad de una reaccin enzimtica. Como las enzimas no se
consumen en la reaccin que catalizan, los ensayos enzimticos suelen medir los cambios
experimentados bien en la concentracin de sustrato (que va decreciendo), bien en la
concentracin de producto (que va aumentando). Existen diversos mtodos para realizar
estas medidas. La espectrofotometra permite detectar cambios en la absorbancia de luz por
parte del sustrato o del producto (segn la concentracin de estos) y la radiometra implica
incorporacin o liberacin de radiactividad para medir la cantidad de producto obtenido por
tiempo. Los ensayos espectrofotomtricos son los ms utilizados, ya que permiten medir la
velocidad de la reaccin de forma continua. Por el contrario, los ensayos radiomtricos
requieren retirar las muestras para medirlas, por lo que son ensayos discontinuos. Sin
embargo, estos ensayos son extremadamente sensibles y permiten detectar niveles muy
bajos de actividad enzimtica.3 Tambin se puede utilizar la espectrometra de masas para
detectar la incorporacin o liberacin de istopos estables cuando el sustrato es convertido
en producto. Actualmente existen mtodos sencillos que se pueden emplear con alumnos de
bachillerato como el propuesto por Johnson R.J. y colaboradores, 4 quienes emplean
hidrolasas de serina y un sustrato fluorognico. Este mtodo es rpido, sensible y permite
medir la cintica enzimtica, a travs de la generacin de fluorescena como producto.

Los ensayos enzimticos ms sensibles utilizan lseres dirigidos a travs de

un microscopio para observar los cambios producidos en enzimas individuales cuando
catalizan una reaccin. Estas medidas pueden utilizar cambios producidos en
la fluorescencia de cofactores que intervienen en el mecanismo de catlisis o bien
unir molculas fluorescentes en lugares especficos de la enzima, que permitan detectar
movimientos ocurridos durante la catlisis. 5 Estos estudios estn dando una nueva visin de
la cintica y la dinmica de las molculas individuales, en oposicin a los estudios de cintica
enzimtica tradicionales, en los que se observa y se mide el comportamiento de una
poblacin de millones de molculas de enzima.
En la figura de la derecha se puede observar la tpica evolucin de una curva obtenida en un
ensayo enzimtico. Inicialmente, la enzima transforma el sustrato en producto siguiendo un
comportamiento lineal. A medida que avanza la reaccin, se va agotando la cantidad de
sustrato y va disminuyendo la cantidad de producto que se genera por unidad de tiempo
(disminuye la velocidad de la reaccin), lo que se manifiesta en forma de curva asinttica en
la grfica. Dependiendo de las condiciones del ensayo y del tipo de enzima, el perodo inicial
puede durar desde milisegundos hasta horas. Los ensayos enzimticos suelen estar
estandarizados para que el perodo inicial dure en torno a un minuto, para llevar a cabo las
medidas ms fcilmente. Sin embargo, los modernos equipos de mezcla rpida de lquidos
permiten llevar a cabo medidas cinticas de perodos iniciales cuya duracin puede llegar a
ser inferior a un segundo.6 Este tipo de ensayos rpidos son esenciales para medidas de la
cintica del estado estacionario, discutida ms abajo.

La mayora de los estudios de cintica enzimtica se centran en el perodo inicial, es decir,

en la zona lineal de la reaccin enzimtica. Sin embargo, tambin es posible medir toda la
curva de la reaccin y ajustar estos datos a una ecuacin no lineal. Esta forma de medir las
reacciones enzimticas es denominada anlisis de la curva de progreso. 7Esta aproximacin
es muy til como alternativa a las cinticas rpidas, cuando el perodo inicial es demasiado
rpido para ser medido con precisin.

Factores fsico-qumicos que pueden modificar la actividad enzimtica

Temperatura: las enzimas son sensibles a la temperatura pudiendo verse modificada

su actividad por este factor. Los rangos de temperaturas ptimos pueden llegar a variar
sustancialmente de unas enzimas a otras. Normalmente, a medida que aumente la
temperatura, una enzima ver incrementada su actividad hasta el momento en que
comience la desnaturalizacin de la misma, que dar lugar a una reduccin progresiva de
dicha actividad.

pH: el rango de pH ptimo tambin es muy variable entre diferentes enzimas. Si el pH

del medio se aleja del ptimo de la enzima, esta ver modificada su carga elctrica al
aceptar o donar protones, lo que modificar la estructura de los aminocidos y por tanto la
actividad enzimtica.

Concentracin salina: al igual que en los casos anteriormente mencionados, la

concentracin de sales del medio es crucial para una ptima actividad enzimtica. Una
elevada concentracin o una ausencia de sales en el medio pueden impedir la actividad
enzimtica, ya que las enzimas precisan de una adecuada concentracin de iones para
mantener su carga y su estructura.

Reacciones con un sustrato

Las enzimas que presentan un mecanismo de nico sustrato incluyen isomerasas, tales
como la triosafosfato isomerasa o la bisfosfoglicerato mutasa, y liasas intramoleculares, tales
como la adenilato ciclasa o la ribozima ARN-liasa.8 Sin embargo, existen ciertas reacciones
enzimticas de nico sustrato que no pertenecen a esta categora de mecanismos, como es
el caso de la reaccin catalizada por la catalasa. La catalasa reacciona inicialmente con una
molcula de perxido de hidrgeno (agua oxigenada) y queda en un estado oxidado tras
liberar el producto (agua), y, posteriormente, es reducida por una segunda molcula de
sustrato. Aunque durante la reaccin solo participa un sustrato, la existencia de un
intermediario enzimtico modificado permite incluir al mecanismo de la catalasa en la
categora de mecanismos de ping-pong, un tipo de mecanismo discutido ms adelante.

Cintica de Michaelis-Menten
Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, la velocidad de catlisis no
muestra un comportamiento lineal en una grfica al aumentar la concentracin de sustrato. Si
la velocidad inicial de la reaccin se mide a una determinada concentracin de sustrato
(representado como [S]), la velocidad de la reaccin (representado como V) aumenta
linealmente con el aumento de la [S], como se puede ver en la figura. Sin embargo, cuando
aumentamos la [S], la enzima se satura de sustrato y alcanza su velocidad mxima (V max),
que no sobrepasar en ningn caso, independientemente de la [S]

Mecanismos de catlisis

La variacin de energa como funcin

de una coordenada de reaccin
muestra la estabilizacin del estado
de transicin cuando dicha reaccin
es llevada a cabo por una enzima.
El modelo de ajuste inducido es el
ms utilizado al realizar estudios de
interaccin enzima-sustrato.33 Este
modelo propone que las
interacciones iniciales entre la
enzima y el sustrato son
relativamente dbiles, pero
suficientes para producir ciertos
cambios conformacionales en la
enzima, que estabilizan e
incrementan la fuerza de la
interaccin. Estos cambios
conformacionales implican a una serie de aminocidos catalticos del centro
activo, en los cuales se producen los enlaces qumicos correspondientes entre la
enzima y el sustrato. Despus de la unin, uno o ms mecanismos de catlisis
disminuyen la energa del estado de transicin de la reaccin, por medio de una
ruta alternativa a la reaccin. Los mecanismos de catlisis se clasifican acorde a
diferentes criterios: catlisis covalente, catlisis por proximidad y alineacin de
orbitales, catlisis cido-base general, catlisis por iones metlicos y catlisis
electrosttica.

Los estudios de cintica enzimtica no permiten obtener el tipo de catlisis

utilizada por una enzima. Sin embargo, algunos datos cinticos pueden
proporcionar una serie de indicios que lleven a realizar otro tipo de estudios
dirigidos a determinar dicho tipo de catlisis. Por ejemplo, en un mecanismo de
ping-pong la cintica del estado pre-estacionario puede estar sugiriendo una
catlisis de tipo covalente. Por otro lado, variaciones en el pH pueden producir
efectos drsticos en la Vmax pero no en la Km, lo que podra indicar que un
residuo del centro activo precisa un estado concreto de ionizacin para que se
pueda llevar a cabo la catlisis enzimtica.

Catlisis enzimtica

Representacin de la variacin y diferencias

de la energa libre de Gibbs entre una reaccin
no catalizada por una enzima (arriba, en rojo)
y otra que s lo es (abajo, en azul).
La catlisis enzimtica es una disciplina de la
enzimologa que estudia los mecanismos de
catlisis por los cuales las protenas o cidos
nucleicos con actividad enzimtica pueden
favorecer la reaccin de ciertos sustratos y su
conversin en productos. Este hecho est
subordinado a las leyes de la catlisis qumica convencional: es decir, la
existencia de una enzima no permite la aparicin de nuevas reacciones, ni va en
contra de la termodinmica del proceso; simplemente, acelera su velocidad
favoreciendo una ruta de menor coste energtico incluyendo en la dinmica de la
reaccin un estado intermediario de alta energa de modo que el nmero de
molculas activas, capaces de crear y destruir nuevos enlaces, aumente.
CINETICA MICROBIANA

En microbiologa la palabra crecimiento se define como un incremento en el numero de

clulas. El crecimiento es un componente esencial de la funcin microbiana ya que en la
naturaleza cualquier clula tiene un periodo de vida finito y la especie se mantiene como
resultado del crecimiento continuo de la poblacin.

Fisin binaria

En la mayoria de los procariontes, el crecimiento de una celula individual continua hasta que
se divide en dos celulas nuevas un proceso que se denomina fisin binaria. En un cultivo en
crecimiento de un bacilo como por ejemplo Escherichia coli, se observa que las celulas se
alargan hasta aproximadamente el doble de la longitud de la celula pequea y luego forma
un tabique que acaba por separar la celula en dos celulas hijas. Este tabique se conoce
como septo y es el resultado del crecimiento hacia dentro de la membrana citoplasmtica y
pared celular desde direcciones opuestas hasta que las dos celulas hijas se separan.

Todos los constituyentes celulares aumentan de modo que cada celula hija recibe un
cromosoma completo y suficientes copias de todas las molculas, monomeros e iones
inorgnicos, como para existir como ceula independiente. El reparto del DNA replicado entre
las dos celulas hijas depende de la union del DNA a la membrana durante la divisin y la
segregacin real de las dos copias es facilitada por la formacin del septo.

Proteinas Fts y el plano de la divisin celular.

Se han identificado varias proteinas importantes en el proceso de la divisin celular de los

procariotas, estas proteinas son esenciales para la divisin celular normal y se han llamado
proteinas Fts.

Las proteinas Fts forman en la celula un aparato de divisin que se llama divosoma, cuya
formacin comienza con la union de molculas de FtsZ formando un anillo alrededor del
cilindro celular hacia el centro de la celula. Esta area define el plano de divisin celular, las
molculas de FtsZ polimerizan hasta formar un anillo continuo que luego atrae a otras
proteinas FtsZ.

La replicacin del DNA ocurre antes de que se forme el anillo de FtsZ. El cese de la sntesis
de DNA parece ser la seal para la formacio del anillo y esta estructura aparece
precisamente en es espacio situado entre los dos nucleoides duplicados. En cualquier caso a
medida que progresa la elongacin celular las dos copias del cromosoma se separan y cada
uno termina en una celula hija. Cuando ocurre la contricin, el anillo de FtsZ comienza a
despolimerizarse y se dispara hacia el interior decesa zona la sntesis de los materiales de la
pared celular que eventualmente llega a sellar la region de union de una celula con otra.

Crecimiento de poblaciones

La velocidad del crecimiento es el cambio en el numero de celulas o en la masa celular

experimentando por unidad de tiempo. Durante el ciclo de divisin celualar todos los
componentes estructurales de la celula se duplican. El intervalo para la formacin de dos
celulas apartir de una supone de una generacin, el tiempo de generacin.

El tiempo de generacin es el tiempo que se requiere para que la poblacin se duplique

razon por la cual a veces el tiempo de generacin se llama tiempo de duplicacin.

Muchas bacterias tienen tiempos de generacin comprendidos entre 1 3 horas, pero unas
cuantas crecen muy rapidamente y se dividen en tan solo 10 minutos mientras que otras
tardan varios dias. El tiempo de generacin de un microorganismo determinado tambien es
funcion del medio de cultivo utilizado y de las condiciones de incubacin empleadas.

Parmetros del crecimiento (Expresin matemtica del crecimiento)

El aumento en numero de celulas que se produce en un cultivo bacteriano creciendo

exponencialmente es una progresin geomtrica de base 2. Cuando dos celulas se dividen
se convierte en cuatro y esto se puede expresar como 2 1--22 . Cuando cuatro celulas pasan a
ocho lo expresamos como 22---23 y as sucesivamente.

Debido a esta progresin geomtrica, existe una relacion directa entre el numero de celulas
presentes inicialmente en el cultivo y el numero presente tras un periodo de crecimiento
exponencial:

N=No2n

Donde N = numero final de celulas, No= numero inicial de celulas y n = al numero de

generaciones que han ocurrido durante el periodo de crecimiento exponencial. El tiempo de
generacin g, de la poblacin celular se calcula como t/n, donde t indica simplemente las
horas o minutos de crecimiento exponencial. Por lo tanto sabiendo el numero inicial y final de
celulas en una poblacin que esta creciendo exponencialmente, es posibla alcular n; y
conociendo n y t, calcular el tiempo de generacin g.
Para expresar n a partir de la ecuacin N=No2 n se necesita hacer las siguientes
transformaciones:

N=No2n

logN = log No + n log 2

log N- log No = n log 2

n= logN log No = logN log No

log 2 0.301

= 3.3 (log N log No)

expresando n funcion de terminos fcilmente medibles como N y No, se pueden calcular los
tiempos de generacin.

Otro indice de la velocidad de crecimiento es la constante de la velocidad de crecimiento,

abreviadamente k. La constante de la velocidad de crecimiento se expresa como constante
de la velocidad de crecimiento se expresa como

k= In2 = 0.693

gg

y tienen unidades de hora 1. Mientras que g es una medida del tiempo que tarda una
poblacin en duplicar su numero de celulas, k es una medida del numero de generaciones
que ocurren por unidad de tiempo en un cultivo exponencial.

Curva de crecimiento

En un sistema cerrado o cultivo en medio no renovado tambien conocido como cultivo

monofasico se obtiene una curva de crecimiento. Esta curva de crecimiento puede dividirse
en distintas fases llamadas fases de latencia, fase exponencial, fase estacionaria y fase de
muerte.

Fase de latencia

Cuando se inocula una poblacin microbiana en un medio fresco, por lo general el

crecimiento no comienza inmediatamente sino solo tras un periodo de tiempo que constituye
la fase de latencia, la cual puede ser breve o larga dependiendo de la procedencia del cultivo
y de las condiciones de crecimiento. Si un cultivo exponencial se inocula en el mismo medio
y en las mismas condiciones de cultivo, no se observa un retraso y el crecimiento
exponencial se inicia inmediatamente. Si el inoculo se toma de un cultivo viejo y se inocula
en el mismo medio, se observa normalmente un retraso aunque todas las celulas del inoculo
sean viables, es decir sean capaces de reproducirse. Esto se debe con frecuencia a que las
celulas carecen de varios componentes esenciales para dividirse y se requiere tiempo para
su sntesis. Tambien se aprecia un retraso cuando las celulas del inoculo han sido daadas
parcialmente con calor, radiaciones o compuestos toxicos, debido al tiempo requerido para
recuperarse y reparar los daos.

La fase de latencia tambien ocurre cuando se transfiere una poblacin de un medio rico a
otro medio mas pobre. Para que ocurra crecimiento en un medio de cultivo particular las
celulas deben tener un equipo enzimatico completo que permita la sntesis de los metabolitos
esenciales ausentes en el medio. Al pasar a otro medio se necesita tiempo para la sntesis de
las nuevas enzimas.

Fase exponencial

La fase exponencial de crecimiento es una consecuencia del hecho de que cada celula se
divide para formar dos, cada una de las cuales va a formar otras y asi sucesivamente. Las
celulas en crecimiento exponencial estan en el estado fisiolgico mas sano, las celulas
tomadas en el punto medio del crecimiento exponencial son a menudo las mas indicadas
para estudios enzimaticos y estructurales.

La velocidad de crecimiento esta influenciada por las condiciones ambientales y las

caractersticas geneticas del organismo. Por lo general los microorganismos procariontes
crecen mas rapido que los eucariontes y los eucariontes de tamao pequeo lo hacen mas
rapido que los de mayor tamao.

Fase estacionaria

Es un sistema de cultivo cerrado en medio o renovado o monofasico. Lo que realmente

susede es que:

1. un nutriente esencial del medio de cultivo se usa y llega a ser factor limitante del
crecimiento.

2. se acumula en el medio algunos productos de desecho hasta niveles inhibitorios que

hacen que cese el crecimiento exponencial.

Frecuentemente ocurren ambas cosas, al producir esto la poblacin alcanza la fase

estacionaria.

En la fase estacionaria no hay aumento ni descenso neto en el numero de celulas. Aunque

no suele haber crecimiento en la fase estacionaria muhas funciones celulares continuan,
como el metabolismo energtico y algunos procesos biosinteticos.

Fase de muerte
Si la incubacin continua despus de que la poblacin haya alcanzado la fase estacionaria
las celulas pueden continuar vivas y metabolicamente activas, pero tambien pueden morir, si
ocurre esto ultimo se dice que la poblacin esta en fase de muerte.

Medicion y eficacia del crecimiento - Recuento de todas las celulas

El numero de celulas de una poblacin se puede determinar contando una muestra con el
microscopio mediante metodos de recuento directo. El recuento directo se puede hacer de
dos formas, en muestras secas sobre portas o en muestas liquidas. Con muestras liquidas se
emplean camaras de recuento especiales.

En el microscopio se pueden contar el numero de celulas por cada unidad de area de la

parrilla, lo que permite conocer el numero de celulas por el volumen que determina cada
area. La conversin de este valor a numero de celulas por mililitro de la suspensin original
se hace fcilmente multiplicando por un factor de conversin que depende del volumen del
tipo de camara.