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Las enzimas, en su mayora, son protenas con la capacidad de manipular otras molculas
sin ser alterados por la reaccin,1esas molculas son denominadas sustratos. Un sustrato es
capaz de unirse al sitio activo de la enzima que lo reconozca y transformarse en un producto
a lo largo de una serie de pasos denominados mecanismo enzimtico. Algunas enzimas
pueden unir varios sustratos diferentes y/o liberar diversos productos, como es el caso de
las proteasas al romper una protena en dos polipptidos. En otros casos, se produce la
unin simultnea de dos sustratos, como en el caso de la ADN polimerasa, que es capaz de
incorporar un nucletido (sustrato 1) a una hebra de ADN (sustrato 2). Aunque todos estos
mecanismos suelen seguir una compleja serie de pasos, tambin suelen presentar una etapa
limitante que determina la velocidad final de toda la reaccin. Esta etapa limitante puede
consistir en una reaccin qumica o en un cambio conformacional de la enzima o del sustrato.
Sin embargo, no todas las catlisis biolgicas son llevadas a cabo por enzimas proteicas.
Existen molculas catalticas basadas en el ARN, como las ribozimas y los ribosomas,
esenciales para el splicing alternativo y la traduccin del ARNm, respectivamente. La
principal diferencia entre las ribozimas y las enzimas radica en el limitado nmero de
reacciones que pueden llevar a cabo las primeras, aunque sus mecanismos de reaccin y
sus cinticas pueden ser estudiadas y clasificadas por los mismos mtodos.
Principios Generales
La reaccin qumica catalizada por una enzima utiliza la misma cantidad de sustrato y genera
la misma cantidad de producto que una reaccin no catalizada. Al igual que ocurre en otros
tipos de catlisis, las enzimas no alteran en absoluto el equilibrio de la reaccin entre
sustrato y producto.2 La eficiencia de la reaccin, hasta el momento en que todos los sitios
posibles estn ocupados. En ese momento se habr alcanzado el punto de saturacin de la
enzima y, aunque se aada ms sustrato, no aumentar ms la eficiencia.
Ensayos Enzimaticos
Las enzimas que presentan un mecanismo de nico sustrato incluyen isomerasas, tales
como la triosafosfato isomerasa o la bisfosfoglicerato mutasa, y liasas intramoleculares, tales
como la adenilato ciclasa o la ribozima ARN-liasa.8 Sin embargo, existen ciertas reacciones
enzimticas de nico sustrato que no pertenecen a esta categora de mecanismos, como es
el caso de la reaccin catalizada por la catalasa. La catalasa reacciona inicialmente con una
molcula de perxido de hidrgeno (agua oxigenada) y queda en un estado oxidado tras
liberar el producto (agua), y, posteriormente, es reducida por una segunda molcula de
sustrato. Aunque durante la reaccin solo participa un sustrato, la existencia de un
intermediario enzimtico modificado permite incluir al mecanismo de la catalasa en la
categora de mecanismos de ping-pong, un tipo de mecanismo discutido ms adelante.
Cintica de Michaelis-Menten
Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, la velocidad de catlisis no
muestra un comportamiento lineal en una grfica al aumentar la concentracin de sustrato. Si
la velocidad inicial de la reaccin se mide a una determinada concentracin de sustrato
(representado como [S]), la velocidad de la reaccin (representado como V) aumenta
linealmente con el aumento de la [S], como se puede ver en la figura. Sin embargo, cuando
aumentamos la [S], la enzima se satura de sustrato y alcanza su velocidad mxima (V max),
que no sobrepasar en ningn caso, independientemente de la [S]
Mecanismos de catlisis
Catlisis enzimtica
Fisin binaria
En la mayoria de los procariontes, el crecimiento de una celula individual continua hasta que
se divide en dos celulas nuevas un proceso que se denomina fisin binaria. En un cultivo en
crecimiento de un bacilo como por ejemplo Escherichia coli, se observa que las celulas se
alargan hasta aproximadamente el doble de la longitud de la celula pequea y luego forma
un tabique que acaba por separar la celula en dos celulas hijas. Este tabique se conoce
como septo y es el resultado del crecimiento hacia dentro de la membrana citoplasmtica y
pared celular desde direcciones opuestas hasta que las dos celulas hijas se separan.
Todos los constituyentes celulares aumentan de modo que cada celula hija recibe un
cromosoma completo y suficientes copias de todas las molculas, monomeros e iones
inorgnicos, como para existir como ceula independiente. El reparto del DNA replicado entre
las dos celulas hijas depende de la union del DNA a la membrana durante la divisin y la
segregacin real de las dos copias es facilitada por la formacin del septo.
Las proteinas Fts forman en la celula un aparato de divisin que se llama divosoma, cuya
formacin comienza con la union de molculas de FtsZ formando un anillo alrededor del
cilindro celular hacia el centro de la celula. Esta area define el plano de divisin celular, las
molculas de FtsZ polimerizan hasta formar un anillo continuo que luego atrae a otras
proteinas FtsZ.
La replicacin del DNA ocurre antes de que se forme el anillo de FtsZ. El cese de la sntesis
de DNA parece ser la seal para la formacio del anillo y esta estructura aparece
precisamente en es espacio situado entre los dos nucleoides duplicados. En cualquier caso a
medida que progresa la elongacin celular las dos copias del cromosoma se separan y cada
uno termina en una celula hija. Cuando ocurre la contricin, el anillo de FtsZ comienza a
despolimerizarse y se dispara hacia el interior decesa zona la sntesis de los materiales de la
pared celular que eventualmente llega a sellar la region de union de una celula con otra.
Crecimiento de poblaciones
Muchas bacterias tienen tiempos de generacin comprendidos entre 1 3 horas, pero unas
cuantas crecen muy rapidamente y se dividen en tan solo 10 minutos mientras que otras
tardan varios dias. El tiempo de generacin de un microorganismo determinado tambien es
funcion del medio de cultivo utilizado y de las condiciones de incubacin empleadas.
Debido a esta progresin geomtrica, existe una relacion directa entre el numero de celulas
presentes inicialmente en el cultivo y el numero presente tras un periodo de crecimiento
exponencial:
N=No2n
N=No2n
log 2 0.301
expresando n funcion de terminos fcilmente medibles como N y No, se pueden calcular los
tiempos de generacin.
k= In2 = 0.693
gg
y tienen unidades de hora 1. Mientras que g es una medida del tiempo que tarda una
poblacin en duplicar su numero de celulas, k es una medida del numero de generaciones
que ocurren por unidad de tiempo en un cultivo exponencial.
Curva de crecimiento
Fase de latencia
La fase de latencia tambien ocurre cuando se transfiere una poblacin de un medio rico a
otro medio mas pobre. Para que ocurra crecimiento en un medio de cultivo particular las
celulas deben tener un equipo enzimatico completo que permita la sntesis de los metabolitos
esenciales ausentes en el medio. Al pasar a otro medio se necesita tiempo para la sntesis de
las nuevas enzimas.
Fase exponencial
La fase exponencial de crecimiento es una consecuencia del hecho de que cada celula se
divide para formar dos, cada una de las cuales va a formar otras y asi sucesivamente. Las
celulas en crecimiento exponencial estan en el estado fisiolgico mas sano, las celulas
tomadas en el punto medio del crecimiento exponencial son a menudo las mas indicadas
para estudios enzimaticos y estructurales.
Fase estacionaria
1. un nutriente esencial del medio de cultivo se usa y llega a ser factor limitante del
crecimiento.
Fase de muerte
Si la incubacin continua despus de que la poblacin haya alcanzado la fase estacionaria
las celulas pueden continuar vivas y metabolicamente activas, pero tambien pueden morir, si
ocurre esto ultimo se dice que la poblacin esta en fase de muerte.
El numero de celulas de una poblacin se puede determinar contando una muestra con el
microscopio mediante metodos de recuento directo. El recuento directo se puede hacer de
dos formas, en muestras secas sobre portas o en muestas liquidas. Con muestras liquidas se
emplean camaras de recuento especiales.