http://bibliotecavirtual.unad.edu.

co:2069/science/article/pii/S0
717345814000281

ARTICULO 1

Abstracto

Fondo

Asprtico proteasas son una subfamilia de endopeptidasas que son tiles en una
variedad de aplicaciones, especialmente en la industria de procesamiento de
alimentos. Aqu se describe una proteasa novedosa asprtico que se purific a
partir de peptidasa R, una preparacin de proteasa comercial derivada
de Rhizopus oryzae .

resultados

Una proteasa asprtica procedente de peptidasa R se purific hasta

homogeneidad mediante cromatografa de intercambio aninico seguido de pulido
con una columna de cromatografa de interaccin hidrfoba, lo que resulta en un
aumento de 3,4 veces en la actividad especfica (57,5 10 3
U / mg) y la
recuperacin 58,8%. El peso molecular estimado de la enzima purificada fue de 39
kDa. La secuencia N-terminal de la protena purificada mostr 63-75% de
identidad con rhizopuspepsins de diversos Rhizopus especies. La enzima exhibe
actividad mxima a 75 C en tampn de glicina-HCl, pH 3,4 con casena como
sustrato. La proteasa fue estable a 35 C durante 60 min y tena un observada
vida media de aproximadamente 30 min a 45 C. La actividad enzimtica no se
inhibi significativamente por quelacin con cido etilendiaminotetraactico
(EDTA), y la adicin de iones metlicos para la proteasa tratada con EDTA no
cambi significativamente la actividad enzimtica, lo que indica que la protelisis
 no es de metal ion-dependiente. La enzima purificada fue completamente
inactivada por el inhibidor de la proteasa asprtica pepstatina A.

Conclusin

Sobre la base de la actividad enzimtica observada, perfil de inhibicin con

pepstatina A, y la similitud de secuencia con otros rhizopuspepsins, hemos
clasificado esta enzima como una proteasa asprtica.

Palabras clave

cromatografa ;
endopeptidasa ;
Industria de procesamiento de alimentos ;
La homogeneidad ;
Rhizopuspepsin

1. Introduccin

Proteasas, tambin conocidas como peptidasas o proteinasas, son una amplia

categora de enzimas que catalizan la hidrlisis de enlaces peptdicos. Las
proteasas que escinden enlaces peptdicos en los extremos terminales N o C de
las cadenas polipeptdicas se denominan exopeptidasas y los que escinden
enlaces peptdicos dentro de la cadena polipeptdica se clasifican como
endopeptidasas [1] . Las proteasas se pueden clasificar como asprtico, cistena,
cido glutmico, serina, y treonina proteasas, dependiendo de los aminocidos
presentes en el sitio activo, o como metaloproteasas de si se requiere un ion de
metal para la actividad cataltica [2] . Las proteasas se producen de forma natural
en todos los organismos y estn implicadas en muchos procesos fisiolgicos,
incluyendo la produccin de nutrientes para el crecimiento celular y la
proliferacin [3] , la degradacin de protenas [4] , y como componentes de
regulacin de diversas funciones fisiolgicas [ 5 , 6 ]. Microbianas de origen
proteasas son valiosas enzimas comerciales que dan cuenta de aproximadamente
el 60% de las ventas totales a nivel mundial de enzimas industriales [7] ; que se
utilizan en los alimentos, productos farmacuticos, detergentes, y de biotecnologa
industrias [ 1 , 8 , 9 , 10 , 11 ].

Asprtico proteasas (EC 3.4.23), tambin conocidas como proteasas cidas, son
una subfamilia de endopeptidasas que han sido aislados de diversas fuentes,
incluyendo virus, bacterias, hongos, plantas y animales [12] ; [13] ; [14] . Varios
asprtico proteasas fngicas se han purificado y caracterizado como renina-like y
enzimas pepsina como [7] . Las enzimas renina-como se producen por Endothia
parasitica (endotiapepsina, EC 3.4.23.22), Mucor , y Rhizomucor especies
(mucorpepsin, EC 3.4.23.23) [10] . Las enzimas pepsina similares incluyen
aspergilopepsina (aspergilopepsina I, EC 3.4.23.18) a partir
de Aspergillus especies [15] y rhizopuspepsin (CE 3.4.23.21) a partir
de Rhizopus especies [16] . Estas enzimas tienen pesos moleculares en el
intervalo de 30-45 kDa y contienen uno o dos residuos de cido asprtico
conservados en el sitio activo [ 2 , 17 ]. Asprtico proteasas son ptimamente
activa a pH cido (pH 3-5) y se inhiben especficamente por pepstatina
A [12] ; [15] ; [16] . Debido a su alta actividad y estabilidad en ambientes cidos,
asprtico proteasas son reactivos tiles en la industria de procesamiento de
alimentos. Por ejemplo, asprtico proteasas se utilizan como enzimas coagulantes
de la leche para la fabricacin de queso [10] y como aditivos para mejorar el sabor
de los alimentos y la textura [18] .

Asprtico proteasas forman la clase dominante de Rhizopus proteasas secretadas,

conocido como rhizopuspepsins [ 3 , 19 ]. Especie de la que se han aislado y
caracterizado bioqumicamente rhizopuspepsins incluyen Rhizopus
chinensis [20] , Rhizopus microsporus [21] , Rhizopus Hangchow [22] , Rhizopus
oryzae MTCC 3690[16] , y R. oryzae NBRC 4749 [23] . Una enzima que coagulen
la leche adecuado debe tener actividad caseinoltica especfica alta; Sin embargo,
muchos niveles de actividad comunicados son pobres. Una preparacin de
proteasa neutra derivada de R. oryzae , peptidasa R, se utiliza en el
procesamiento comercial de alimentos para mejorar el sabor y el contenido
nutricional. Aqu se describe la purificacin y caracterizacin de una protena
derivada-R peptidasa con alta actividad caseinoltica y un perfil de inhibicin
consistente con la de una proteasa de cido asprtico.

2. Materiales y mtodos

2.1. productos qumicos

Peptidasa I fue adquirido de Amano Enzyme Inc. (Nagoya, Japn). La casena,

pepstatina A, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), Pefabloc SC, N-etilmaleimida,
cido yodoactico, -mercaptoetanol, ditiotreitol y se adquirieron de Sigma-Aldrich
(St. Louis, MO). Todos los dems productos qumicos y disolventes eran de
calidad analtica y se adquirieron de Merck (Darmstadt, Alemania) y Sigma-Aldrich.

2.2. la purificacin de protenas

Todas las etapas de purificacin se realizaron a 4 C en un purificador 10 sistema

AKTA (GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Suecia). Peptidasa R (500 mg) se
disolvi en 50 ml de tampn de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0, y se filtr a travs
de un filtro Millex-HA 25-mm (Millipore, Bedford, MA) con un tamao de poro de
0,45 m. La solucin de enzima se carg en una columna HiLoad 26/10 de alto
rendimiento Q Sepharose (GE Healthcare Biosciences) equilibrada con tampn
fosfato 50 mM de sodio, pH 7,0. Las fracciones se eluyeron a un caudal de 10 mL /
min utilizando tampn de equilibrado con un gradiente por etapas de NaCl de 0 a
0,17 M de 180 ml, 0,17 a 0,30 M para 480 ml, y 0,30 a 1,0 M de 300 ml. Las
fracciones se detectaron por absorbancia UV a 280 nm para la
coleccin. Actividad de la proteasa asprtico en las fracciones recogidas se midi
como se describe en la Seccin 2.5 . Fracciones de proteasa que contiene
asprtico se agruparon, y se aadi sulfato de amonio al 50% (v / v) concentracin
final para precipitar las protenas contaminantes. Protena insoluble se elimin por
centrifugacin a 12.000 rpm y 4 C durante 10 min. El sobrenadante se aplic a
una columna HiTrap de Fenil Sepharose (GE Healthcare Biosciences) equilibrada
con tampn fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0. Asprtico proteasa se eluy a un
caudal de 1 mL / min utilizando tampn de equilibrado con un gradiente
descendente lineal de sulfato de amonio a partir de 100% (disolucin saturada) a
0%. Las fracciones que presentan actividad de proteasa asprtica se combinaron
y se dializaron contra 50 mM de tampn de glicina-HCl, pH 3,4, para su
almacenamiento. La protena purificada se concentr mediante ultrafiltracin
usando un dispositivo de filtro Amicon centrfugo (10 kDa de corte; Millipore), y se
almacen a 4 C.

2.3. Determinacin del peso molecular y la cuantificacin de protenas

homogeneidad de la protena y el peso molecular se determinaron por

electroforesis en dodecilsulfato de sodio en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) en
5% de apilamiento y 12% de separacin de geles, utilizando amplio alcance
marcadores de protenas (6.5-200 kDa; Laboratorios Bio-Rad, Richmond, CA )
como estndares de tamao. Las protenas en el gel se tieron con azul de
Coomassie Bio-safe (Bio-Rad Laboratories). peso molecular de protena se
determin utilizando el software TotalLab (no lineal, Durham, NC) de acuerdo con
las instrucciones del fabricante. Las concentraciones de protenas se cuantificaron
utilizando un kit de ensayo de protenas Bio-Rad con albmina de suero bovino
como el estndar.

2.4. la secuenciacin de aminocidos N-terminal

La enzima purificada se separ mediante gel SDS-PAGE y se transfirieron por

electrotransferencia a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF)
(Millipore) en 10 mM cido 3- (ciclohexilamino) -1-propanosulfnico tampn de
cido, pH 11, que contiene 10% de metanol. La protena transferida se ti con
Azul de Coomassie R-250 y la banda que contiene protena purificada se escindi
de la membrana para la secuenciacin de aminocidos N-terminal mediante
degradacin de Edman usando un ABI Procise 494 secuenciador de protenas
(Applied Biosystems, Foster City, CA). La comparacin de la secuencia con las
secuencias que codifican proteasas similares en GenBank se realiz mediante la
herramienta de alineacin local bsica de bsqueda (BLAST) en el Centro
Nacional de Informacin Biotecnolgica (NCBI) sitio web
( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi ). El alineamiento mltiple de secuencia y
las identidades (%) se realizaron utilizando Clustal Omega en la pgina web del
Instituto Europeo de Bioinformtica (EMBL-EBI)
( http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ ).

2.5. ensayo de actividad enzimtica

La actividad proteoltica se midi usando casena como sustrato. La mezcla de

reaccin, que contiene 50 l de 2% (w / v) de solucin de casena, 190! L de
tampn de 50 mM de glicina-HCl, pH 3,4, y 10 l de la concentracin apropiada de
enzima purificada, se incub a 35 C durante 30 min. La reaccin se termin
mediante la adicin de un 250! L de 10% (w / v) de cido tricloroactico. La
protena precipitada se elimin por centrifugacin a 12.000 rpm y 4 C durante 10
min. La absorbancia del sobrenadante a 280 nm se midi usando un
espectrofotmetro Hitachi U3000 (Hitachi, de Tokio, Japn). Una unidad (U) de
actividad enzimtica se define como la cantidad de enzima requerida para
aumentar la absorbancia a 280 nm por 0.001 AU por minuto bajo las condiciones
de ensayo mencionadas anteriormente [15] .

2.6. caracterizacin de la enzima para el pH y la temperatura optima

El pH ptimo para la proteasa asprtica purificada se determin por la actividad de

la medicin a 35 C durante 30 min en el rango de pH 2,2 a 4,0 usando 50 mM de
glicina-HCl (pH 2.2 a 3.6) y citrato de sodio 50 mM (pH 2,6 a 4,0) como tampones
de ensayo. Se determin la temperatura ptima para la actividad de la proteasa a
travs de ensayos realizados utilizando temperaturas de 15-85 C para la etapa
de incubacin de 30 min en tampn de glicina-HCl 50 mM, pH 3,4. La actividad
observada mxima bajo cualquiera de las condiciones de reaccin documentados
se defini como 100% y las actividades relativas se calcularon como una fraccin
de este valor.
2.7. termoestabilidad

La termoestabilidad de la proteasa asprtica se determin mediante la incubacin

de la enzima purificada durante 65 min en tampn de glicina-HCl 50 mM, pH 3,4, a
35 C y 45 C. A intervalos de tiempo definidos, las soluciones enzimticas se
enfriaron en hielo y la actividad residual se ensay en condiciones de ensayo
estndar de la enzima. La actividad residual relativa se expresa como un
porcentaje de la actividad observada para la enzima sin calefaccin.

2.8. Efecto de reactivos qumicos y los iones metlicos sobre la actividad

enzimtica

Para determinar los efectos de los inhibidores de la proteasa y activadores cistena

proteasa en la actividad enzimtica, la enzima purificada se incub con cada
reactivo en tampn de glicina-HCl 50 mM, pH 3,4, a 35 C durante 30 min,
seguido de la medicin de su actividad bajo el ensayo estndar condiciones
descritas anteriormente. La enzima se ensay en cuanto a la inhibicin por los
inhibidores de serina proteasa PMSF (0,1 mM mM y 1) y Pefabloc SC (1 mM), los
inhibidores de la cistena proteasa N-etilmaleimida (1 mM), y cido yodoactico (1
mM), y la asprtico inhibidor de la proteasa pepstatina A (1 M). Los ensayos
tambin se realizaron en la enzima con -mercaptoetanol (1 mM) y dithriothreitol
(1 mM), que son conocidos para mejorar la actividad de la proteasa cistena.

Para determinar si la proteasa es de metal-dependiente, se realiz un ensayo

sobre la protena purificada despus de la incubacin con el cido tetraactico
etilendiamina quelante (EDTA). Especficamente, la enzima purificada se incub a
35 C durante 30 min en 50 mM de tampn de glicina-HCl, pH 3,4, con EDTA 10
mM. EDTA se elimin mediante ultrafiltracin centrfuga usando un dispositivo
Amicon centrfuga de filtro (10 kDa de corte; Millipore) antes de someter a ensayo
espectrofotomtricamente para la actividad. El efecto de metales divalentes
aadidos sobre la enzima tratada con EDTA se determin incubando la enzima
despus de la eliminacin quelante con una solucin de cloruro de metal acuoso a
una concentracin final de 1 mM durante 30 min. La enzima se ensay en
presencia de CaCl 2 , ZnCl 2 , NiCl 2 , CuCl 2 , MnCl 2 , y CoCl 2 . La actividad relativa
se expresa como un porcentaje de actividad de la enzima no tratada.

3. Resultados y discusin

3.1. Purificacin de proteasa asprtica

Una solucin de enzima cruda de peptidasa R que muestra actividad proteasa

asprtica (17 10 3 U / mg) se separ por cromatografa usando un HiLoad 26/10
columna de alto rendimiento Q Sepharose y se eluy con un gradiente de NaCl
paso a paso. El perfil cromatogrfico se muestra en la Fig. 1a . Hay dos picos
principales de protena; la elucin en 0,17 a 0,20 M NaCl contena la protena
activa. La actividad especfica de las fracciones activas reunidas era 36,7 10 3
U
/ mg, que representa un rendimiento del 90,6% de la actividad enzimtica
inicial. Las fracciones activas se purificaron adicionalmente por cromatografa de
interaccin hidrfoba en una columna HiTrap Fenil Sepharose donde fracciones 9-
15 contena actividad de la enzima diana ( Fig. 1b ) y se agruparon para
comprender la muestra final de la proteasa purificada. Un resumen de las etapas
de purificacin para la proteasa asprtica del derivado de R peptidasa se muestra
en la Tabla 1 . Despus de dos columnas etapas de purificacin cromatografa, la
enzima fue purificada 3,4 veces a partir de un crudo peptidasa R, con un
rendimiento final de 58,8% y una actividad especfica observada de 57,5 10 3
U/
mg. Asprtico proteasas purificadas a partir de Aspergillus oryzae MTCC
5341 [15] y Aspergillus niger BCRC 32720 [18] mostraron alta actividad proteoltica
con una actividad especfica de aproximadamente 43,6 10 3
U / mg y 23,3
10 3 U / mg, respectivamente. La actividad de la proteasa asprtica purificada aqu
fue uno de los ms altos reportados, y puede ser til como una ayuda digestiva.
Higo. 1.

La purificacin cromatogrfica de una proteasa asprtica de R. oryzae preparacin de

enzima en bruto. (a) Cromatografa de intercambio aninico utilizando una columna de
Sepharose de alto rendimiento HiLoad 26/10 Q (b) cromatografa de interaccin hidrfoba
utilizando una columna HiTrap Fenil Sepharose. Condiciones de purificacin se describen
en Materiales y mtodos .

opciones figura

Tabla 1.
 La purificacin de una proteasa asprtica de una R. oryzae preparacin de enzima en
bruto.

etapa de La protena La actividad La actividad purificacin Rendimiento

purificacin total total especfica Fold (%)
(mg) (10 6 U) (10 3 U / mg)

de enzima en 500 8.5 17.0 1 100

bruto

Q Sepharose 210 7.7 36.7 2.2 90.6

fenil 87 5.0 57.5 3.4 58.8

Sepharose

opciones de la tabla

Pureza de la enzima fue confirmada por SDS-PAGE. La protena purificada migr

como una banda nica con un peso molecular aparente de ~ 39 kDa ( Fig. 2 ). El
peso molecular de la enzima purificada es mayor que el reportado para
rhizopuspepsins de R. oryzae MTCC 3690 (34 kDa) [16] , R. oryzae NBRC 4749
(34 kDa) [23] , y R. microsporus (34,5 kDa) [21 ] . Estos resultados sugieren que la
proteasa purificada de peptidasa R es un rhizopuspepsin distinta, no declarada
previamente.
 Higo. 2.

perfil de SDS-PAGE de la proteasa asprtica purificada. Carril M, marcadores de peso

molecular; carril 1, se purific la proteasa asprtica. La flecha indica la banda
correspondiente a la proteasa purificada asprtico (peso molecular aproximado, 39 kDa).

opciones figura

3.2. anlisis de la secuencia de aminocidos N-terminal

La secuencia de aminocidos N-terminal de la proteasa purificada se identific

como Ser-Gly-Ser-Gly-Val-Val-Pro-Met-Thr-Asp-Tyr-Glu-Tyr-Asp-Ile-Glu-Tyr. La
bsqueda de homologas y mltiples resultados de alineacin de secuencias se
muestran en la Fig. 3 . La secuencia de aminocidos N-terminal de la enzima
purificada muestra 75, 71, 69, y 63% de identidad con rhizopuspepsins de R.
oryzae (GenBank adhesin no. ACL68093.1 ), R.
microsporus var. chinensis (acceso de GenBank no. AAA33880.1 ), R.
niveus (GenBank adhesin no. AAA33882.1 ), y R. oryzae NBRC 4749 (GenBank
adhesin no. ACL68087.1 ), respectivamente. Tambin 71% era idntica a
syncephapepsin de Syncephalastrum racemosum (GenBank adhesin
no. AAC69517.1 ) y era slo el 31% idntica a aspergilopepsina I a partir de A.
niger (acceso de GenBank no. XP_001401093.1 ). La homologa de secuencia con
las enzimas de renina-como endotiapepsina y mucorpepsin fue baja (datos no
incluidos en la Fig. 3 ). Para la identificacin de protenas, la secuencia N-terminal
tambin se utiliz para buscar en la base de datos de genoma para R. oryzae RA
99-880
( http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/rhizopus_oryzae/Blast.html ),
pero un significativamente secuencia similar no fue identificado. La secuencia de
aminocidos N-terminal de la enzima purificada mostr una alta homologa con las
de rhizopuspepsins, lo que indica que la enzima purificada posee actividad
proteasa asprtica.

Higo. 3.

Alineacin de secuencias mltiples de secuencias de aminocidos N-terminales de las

asprtico proteasas fngicas purificadas y otros. (1) proteasa asprtica purificada a partir
de peptidasa R; (2) rhizopuspepsin de R. microsporus var. chinensis (GenBank adhesin
no. AAA33880.1 ); (3) rhizopuspepsin de R. niveus (GenBank adhesin
no. AAA33882.1 ); (4) rhizopuspepsin de R. oryzae NBRC 4749 (GenBank adhesin
no. ACL68087.1 ); (5) rhizopuspepsin de R. oryzae (GenBank adhesin
no. ACL68093.1 ); (6) syncephapepsin de S. racemosum (GenBank adhesin
no. AAC69517.1 ); (7) aspergilopepsina de A. niger (acceso de GenBank
no. XP_001401093.1 ). Los residuos idnticos estn encuadrados.

opciones figura

3.3. Efectos del pH y la temperatura sobre la actividad enzimtica y la estabilidad

La actividad proteasa de la enzima purificada fue examinado a travs del intervalo
de pH 2.2-4 usando casena como sustrato a una temperatura de ensayo de 35
C. El perfil de pH de la proteasa asprtica purificada se muestra en la Fig. 4a . La
enzima era el ms activo entre valores de pH desde 3,0 hasta 3,6 con la actividad
mxima a pH 3,4. La actividad de proteasa disminuy significativamente por
debajo de pH 3,0 y fue de aproximadamente 45% de la actividad mxima cuando
se ensay a pH 2,2 en tampn de glicina-HCl. La actividad enzimtica se redujo
ligeramente a pH 4,0 en tampn citrato de sodio y no se detect a pH 7,0 (datos
no mostrados). PH ptimos similares para las actividades de la proteasa se ha
informado de R. oryzae NBRC 4749, pH 3,0 [23] ; R. Hangchow , pH 3,0 [22] ; R.
chinensis , pH 3,1 [20] ; A. niger I1, pH 3,0 [24] ; y A. oryzae MTCC 5341, pH
3,2 [15] . El pH ptimo en el mismo rango tambin se han reportado para
mucorpepsins de varios Mucor especies [10] . En contraste, el R. oryzae enzima
MTCC 3690 exhibe una actividad ptima a pH 5.5 [16] y las enzimas de A.
niger BCRC 32.720 [18] y R. microsporus exhibir actividad ptima a pH
2.5 [21] . La mayora de las asprtico proteasas fngicas muestran una actividad
mxima a pH 3-4, porque el par de residuos de cido asprtico en el sitio activo
debe reaccionar en forma ionizada y no ionizada para la actividad cataltica [7] . El
pH ptimo podra indicar un mecanismo de reaccin similar entre la enzima
purificada y asprtico proteasas.
Higo. 4.

Determinacin del pH ptimo y la temperatura para la proteasa asprtica purificada. (a) Se

determin el efecto del pH sobre la actividad de la proteasa purificada a 35 C durante una
incubacin de 30 min, como se describe en Materiales y mtodos , ya sea con 50 mM de

glicina-HCl, pH 2.2 hasta 3.6 ( ) O citrato de sodio 50 mM, pH 2,6 a 4,0 ( )

buffer. (B) temperatura ptima se determin en tampn de glicina-HCl 50 mM, pH 3.4 a

varias temperaturas durante 30 min. Los puntos de datos que se muestran son los medios
para tres experimentos independientes, y la ms alta actividad observada se defini como
100%. Las barras de error indican las desviaciones estndar.

opciones figura
Durante el estudio de optimizacin de pH, se observ que la actividad de la
enzima era ms alta a travs de valores de pH 2.6 hasta 3.6 en glicina-HCl frente
a tampn de citrato de sodio. Este fenmeno se observ tambin en
rhizopuspepsin de R. oryzae NBRC 4749, en la que la actividad enzimtica es
superior a pH 3,0 en tampn de glicina-HCl que en tampn de fosfato citrato
de [23] . La glicina es un agente de carga comn en formulaciones de protenas
farmacuticas y se utiliza para estabilizar la protena durante la solucin de
congelacin-descongelacin [25] . La glicina tambin se ha utilizado para mejorar
la estabilidad de las proteasas alcalinas a alta temperatura y en
detergentes [26] . Sugerimos que la glicina es protonado a pH bajo en el tampn
de glicina-HCl; esto podra prevenir la agregacin de protenas en el sistema de
tampn, lo que lleva a una mayor actividad proteoltica. Los efectos de la glicina en
la agregacin y la estabilidad de la proteasa asprtica purificada se examinarn en
el futuro.

Como se muestra en la Fig. 4b , la actividad hidroltica de la proteasa purificada se

increment al aumentar la temperatura, alcanzando un mximo a 75 C, que es
superior a los reportados previamente para rhizopuspepsins de R. oryzae NBRC
4749 (50 C)[23] y R. oryzae MTCC 3690 (60 C) [16] . El perfil de
termoestabilidad de la proteasa purificada se muestra en la Fig. 5 . A 35 C, la
enzima retuvo la actividad completa despus de 1 h de incubacin. A 45 C, la
actividad enzimtica disminuy al aumentar el tiempo de incubacin; la vida media
observada para la proteasa fue de aproximadamente 30 min a 45
C. Rhizopuspepsin de R. oryzae MTCC 3690 tiene una vida media de
aproximadamente 20 min a 60 C y retiene la actividad completa despus de
incubacin a 40 C durante 1 h [16] . Por otra parte, la vida media de
aproximadamente 3,5 h y 10 min a 40 C y 60 C, respectivamente, se inform
para rhizopuspepsin 6 de R. oryzae NBRC 4749 [23] . Estos resultados sugieren
que las proteasas de asprtico de Rhizopus especies parecen ser estable a
temperaturas inferiores a 40 C y propenso a la inactivacin por encima de esta
temperatura.
 Higo. 5.

Determinacin de la termoestabilidad de la proteasa asprtica purificada. La

termoestabilidad fue determinada a travs de ensayos de enzima purificada en tampn de
glicina-HCl 50 mM (pH 3,4) se incub a 35 C ( ) O 45 C ( ) Y la actividad enzimtica se
someti a ensayo en condiciones estndar. La actividad residual se expresa como el
porcentaje en comparacin con la actividad de la enzima un-incubada. Los puntos de datos
que se muestran son las medias de tres experimentos independientes y las barras de error
indican las desviaciones estndar.

opciones figura

3.4. Efectos de los inhibidores y los iones metlicos

Para caracterizar la proteasa purificada, se examinaron los efectos de varios

inhibidores sobre la actividad de la enzima. La proteasa purificada fue fuertemente
inhibida por pepstatina A, un inhibidor de hexapptido que se une especficamente
e irreversiblemente aspartato en el sitio de la proteasa activa asprtico, con la
inactivacin completa se produce en una concentracin de inhibidor de 1 M ( Tabla
2 ). En contraste, los inhibidores de serina proteasa (PMSF y Pefabloc SC) e
inhibidores de la proteasa de cistena ( N etilmaleimida y cido yodoactico) no
inhibieron la actividad de la enzima incluso a 1 mM (datos no mostrados). Los
activadores cistena proteasa ditiotreitol (1 mM) y -mercaptoetanol (1 mM) no
aument la actividad de la proteasa (datos no mostrados). Fuerte inhibicin por el
inhibidor de proteasa asprtica, pepstatina A, sugiere que la protena purificada
puede ser clasificada como una proteasa asprtica.

Tabla 2.

Efectos de los inhibidores de la proteasa y diversos iones metlicos sobre la actividad de la

enzima purificada.

Compuesto Concentracin Actividad relativa (%) una

Ninguna 0 100,0 3,6

pepstatina 1M 0

EDTA 10 mM 101,4 3,8

CaCl 2 1 mM 98,6 3,5

ZnCl 2 1 mM 87,8 3,2

NiCl 2 1 mM 84,2 2,9

CuCl 2 1 mM 87,2 2,6

MnCl 2 1 mM 84,7 2,3

CoCl 2 1 Mm 88,3 2,7

un

La actividad enzimtica se ensay en ausencia de iones metlicos y los inhibidores se

defini como 100% de actividad.

opciones de la tabla

Los efectos de EDTA y los iones de metal en la enzima tratada con EDTA se
examinaron a pH 3,4 y 35 C usando casena como sustrato ( Tabla 2 ). El agente
quelante EDTA (10 mM) no tuvo efecto sobre la actividad enzimtica, lo que
sugiere que no es una metaloproteasa. La adicin de 1 mM Ca 2 + no tuvo ningn
efecto sobre la actividad proteoltica, mientras que la adicin de 1 mM de Zn 2+
,
Ni 2 + , Cu 2 + , Mn 2 + y Co 2 +reduce ligeramente la actividad enzimtica. Estos
resultados indican que la actividad de la enzima purificada no es metalo-
dependientes. Los iones metlicos tienen efectos variables sobre la actividad de
las proteasas de asprtico de diferentes hongos. Rhizopuspepsin de R.
chinensis se inhibe significativamente por Fe 3 + , mientras que ningn efecto
inhibidor se observa con Cu 2 + , Hg 2 + , Fe 2 + , y Pb 2 + [20] . Fe 2 +fuertemente activa y
Fe 3 + , Cr 3 + , Sb 3 + , Pb 2 + , Sn 2 + , Sr 2 + y Ag + inhibe fuertemente la enzima de A.
niger BCRC 32720 [18] . Cu 2 + inhibe fuertemente la enzima de A.
niger I1 [24] . Ca 2 + es un potente activador que se combina con para--casena a
formar cogulos firme durante leche coagulacin [10] . La actividad proteoltica de
la proteasa asprtica purificada no fue inhibida por Ca 2+
, apoyando su utilidad
potencial en el procesamiento de alimentos.

4. Observaciones finales

Una proteasa asprtica se purific a homogeneidad a partir de una preparacin de

peptidasa R comercial por cromatografa lquida usando una columna de
intercambio aninico fuerte seguido de una etapa de cromatografa de interaccin
hidrfoba, lo que resulta en un aumento de 3,4 veces en la actividad especfica y
con un rendimiento de 58,8%. El peso molecular de la enzima purificada se
determin que era aproximadamente 39 kDa por SDS-PAGE. La enzima purificada
parece ser una proteasa asprtica, en base a la inhibicin observada en presencia
de pepstatina A. La enzima era ptimamente activa a pH 3,4 y estable a 35 C,
apropiado para aplicaciones biotecnolgicas y de procesamiento de
alimentos. anlisis estructurales genticos y protenas estn en progreso para
elucidar las propiedades bioqumicas de y potenciales aplicaciones industriales
para esta enzima.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen ningn conflicto de interets.

Expresiones de gratitud
Este trabajo fue apoyado por nmeros de subvencin. 98-2313-B-241-006-
MY3 y 101-2313-B-241-001-MY3 del Consejo Nacional de Ciencia de Taiwn .