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Biotechnologie :

Construction gntique et
prparation enzymatique

ABASSBHAY Sara, CAROILLON DE VILLECOURT Anak,


CHANE YOCK NAM Jrme, HIOL Anne Nadine, HOARAU
Gladys, MENNESON Emilie, VON-PINE-BIJOUX Hilary

Encadr par Pr Fabienne Remize

Anne universitaire : 2016-2017


SOMMAIRE

1. Introduction ...................................................................................................................... 2
2. Les auxiliaires technologiques ......................................................................................... 2
2.1. Dfinition ....................................................................................................................... 2
2.2. Lapha-amylase : intrt et domaine d'application ........................................................ 3
3. Les arrts ....................................................................................................................... 4
4. Les cartes didentits des bactries ................................................................................. 5
5. Obtention de la souche productrice ................................................................................. 7
5.1. Extraction de lADN de Geobacillus stearothermophilus ............................................... 7
5.2. Amplification du gne par PCR (Raction de Polymrisation en Chane) .................... 7
5.3. Insertion des amplicons dans le plasmide .................................................................. 10
5.5. Extraction (miniprep) et digestion ................................................................................ 13
5.6. Electrophorse ............................................................................................................ 14
5.7 .Insertion des plasmides dans B. licheniformis ............................................................ 15
5.8 .Vrification de la prsence du gne dans B. licheniformis .......................................... 15
6. Obtention de la prparation enzymatique ...................................................................... 16
7. Conclusion ..................................................................................................................... 17
8. Rfrences bibliographiques ......................................................................................... 18

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1. Introduction

Lalpha-amylase est une enzyme de la famille des endohydrolases capable de rompre la


liaison alpha-1,4 glycosidique de lamylose et de lamylopectine pour donner des molcules
de maltose, maltotriose et dextrines. En raison de sa spcificit ractionnelle, elle est souvent
utilise en tant quauxiliaire technologique dans lindustrie agro-alimentaire.

Il faut savoir que lalpha-amylase est prsente naturellement dans Geobacillus


stearothermophilus. Par clonage gntique, nous allons insrer le gne de lalpha-amylase
isol de cette bactrie dans Bacillus licheniformis. Celle-ci est est largement utilis pour la
production industrielle grande chelle d'exoenzymes notamment lalpha-amylase.

Plusieurs hypothses peuvent tre voques concernant le souhait de provoquer la production


dalpha-amylase provenant de G. stearothermophilus chez B. licheniformis plutt que chez G.
stearothermophilus lui-mme :
Les enzymes peuvent tre scrtes en plus grandes quantits allant jusqu' 20-25 g/L
Lalpha-amylase serait davantage thermostable plus haute temprature car G.
stearothermophilus est une bactrie thermophile.

Ainsi, nous obtiendrons une nouvelle souche de B. licheniformis sous forme dOrganisme
Gntiquement Modifi (OGM).
Un OGM est dfini comme tant un organisme (animal, vgtal, bactrie) dont le matriel
gntique a t modifi par une technique nouvelle, afin dobtenir une caractristique
nouvelle.

Ainsi, aprs avoir expos lintrt de lalpha-amylase, notamment dans lindustrie agro-
alimentaire, nous expliquerons la dmarche qui a conduit lobtention de la souche
productrice de lenzyme et de la prparation enzymatique. Il est trs important de se
renseigner au niveau des rglements et des autorisations demploi concernant cette enzyme.

2. Les auxiliaires technologiques

2.1. Dfinition

Daprs le dcret n 2011-509, un auxiliaire technologique est une substance non


consomme comme ingrdient alimentaire et volontairement utilise dans la transformation
des matires premires, des denres alimentaires ou de leurs ingrdients, pour rpondre un
objectif technologique dtermin.
Cette rglementation s'applique aux auxiliaires technologiques employs ou destins tre
employs dans la fabrication des denres destines l'alimentation humaine. Il sagit
principalement dantimousses, denzymes, dagents dcolorants, de clarification/adjuvants de
filtration, dacidification, d'alcalinisation ou de neutralisation, etc.
Nous nous intresserons plus particulirement la catgorie enzyme et notamment
lalpha-amylase.
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2.2. Lapha-amylase : intrt et domaine d'application
L-amylase (EC 3.2.1.1) est une glycosidase, enzyme hydrolysant les polysaccharides. Elle
brise les liaisons -1,4-glycosidiques des amyloses et amylopectines pour aboutir de plus
petites molcules comme le glucose, le maltose ou encore les dextrines. Elle est produite par
les animaux, les plantes et les micro-organismes.

En industries, notamment alimentaires, les amylases utilises sont dorigine microbienne


(principalement fongique et bactrienne) car elles sont plus stables que les amylases produites
par les plantes ou les animaux. Par ailleurs, lutilisation de microorganismes pour la
production damylases prsente un avantage conomique du fait dune grande capacit de
production et dune facilit de manipulation. De plus, les amylases microbiennes sont plus
thermostables et peuvent supporter des tempratures allant jusqu 105C tandis que dautres
peuvent tre halophiles et supporter des teneurs leves en sels.
Les procds industriels montant de hautes tempratures ou utilisant des solutions salines
concentres peuvent ainsi utiliser ces enzymes et permettre les ractions enzymatiques
souhaites.

Les alpha-amylases sont utilises dans l'industrie de l'amidon, afin de lhydrolyser dans le
procd de liqufaction de lamidon. Celui-ci convertit l'amidon en sirop de fructose et de
glucose. La conversion enzymatique de l'amidon comprend :
La glatinisation, qui est une dissolution de granules d'amidon, formant ainsi une
suspension visqueuse ;
La liqufaction, qui hydrolyse partielle et perte de viscosit ;
Et la saccharification, qui consiste en une production de glucose et de maltose par
hydrolyse supplmentaire.

Auparavant, l'alpha-amylase de Bacillus amyloliquefaciens tait utilise, mais elle a t


remplace par l'alpha-amylase de Bacillus stearothermophilus ou de Bacillus licheniformis.
En effet, les enzymes des espces Bacillus prsentent une thermostabilit remarquable ce qui
est intressant pour les procds biotechnologiques grande chelle. De plus, des systmes
d'expression efficaces sont disponibles pour ces enzymes.

Les alpha-amylases sont galement utilises dans l'industrie de la boulangerie. Ajoutes la


pte de pain, elles permettent de dgrader l'amidon dans la farine en dextrines plus petites,
qui sont ensuite fermentes par la levure. Elles ont aussi pour effet d'amliorer la vitesse de
fermentation et rduire la viscosit de la pte, ce qui a pour rsultat une amlioration du
volume et de la texture du produit. De plus, les qualits organoleptiques sont amliores au
niveau du got, de la couleur de la crote et des qualits de grillage du pain.

En distillerie et brasserie, cest le mme principe : lalpha-amylase hydrolyse les amidons


pour former du sucre, qui sera ferment par les levures pour la production dalcool.

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Lindustrie du th, la prparation d'aides digestives, la biscuiterie ou encore lindustrie de jus
de fruits utilisent aussi des alpha-amylases. En dehors de lindustrie des aliments, ces
enzymes prsentent des intrts dans les industries du textile, du papier ou encore des
dtergents.

3. Les arrts

La mise sur le march des OGM et des produits issus d'OGM est soumise une autorisation
accorde au cas par cas au niveau europen.
Lorsqu'il s'agit d'aliments ou d'ingrdients alimentaires composs d'OGM ou issus d'un
OGM, l'autorisation de mettre sur le march ces produits ou de les utiliser en vue de leur
transformation industrielle pour la consommation humaine est accorde sur la mise en place
d'un dossier technique permettant d'valuer les risques pour la sant publique, en se basant
sur le rglement (CE) n258/97.

Ce rglement impose que des contrles soient effectus par lAutorit europenne de
scurit des aliments (AESA) pour dmontrer linnocuit de ces produits pour la sant
(humaine et animale) et pour lenvironnement.
Dans notre cas, on se rfrera 3 trois rglements fondamentaux dont :
Le rglement (CE) n1829/2003 du Parlement europen et du Conseil du 22
septembre 2003 qui sapplique, entre autres, aux denres alimentaires et aliments pour
animaux labors partir dOGM, ou contenant des ingrdients produits partir
dOGM. (modifi en 2006 et 2008; en rvision 2011).
Rglement (CE) n1830/2003 du Parlement europen et du Conseil, du 22 septembre
2003, concernant la traabilit et ltiquetage des organismes gntiquement modifis
et la traabilit des produits destins lalimentation humaine ou animale produits
partir dorganismes gntiquement modifis et modifiant la directive 2001/18/CE
Directive 2001/18/CE du Parlement europen et du Conseil du 12 mars 2001 relative
la dissmination volontaire d'organismes gntiquement modifis dans
l'environnement et abrogeant la directive 90/220/CEE du Conseil (modifi en 2008)

Les producteurs de ce type de produits doivent appliquer une demande unique auprs de
lautorit comptente du pays concern (membre de lUE). Celui-ci, aprs deux semaines,
accuse rception du dossier et en informe lAESA, qui a 6 mois pour traiter la demande.
Si le dossier est approuv, les denres alimentaires et les aliments pour animaux contenant
des OGM doivent tre clairement tiquets. Cependant, si la proportion de cet ingrdient est
infrieure 0,9%, ils ne doivent pas tre tiquets, condition que la prsence de cet OGM
soit techniquement invitable (ce qui correspond la dose rsiduelle maximale).

En ce qui concerne lalpha-amylase, cest une enzyme autorise en alimentation en France.


En effet, elle fait partie de la liste positive mise jour priodiquement de larrt du 19
octobre 2006. Elle est principalement utilis en amidonnerie, en production de sirop de
glucose, dans lindustrie de l'alcool, en panification ( l'exception du pain de tradition
franaise) et panification spciale, en biscuiterie, en ptisserie et en viennoiserie.
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4. Les cartes didentits des bactries
Tableau 1 : Carte didentit de Bacillus licheniformis.

Microorganisme Bacillus licheniformis

Famille Bacillaceae

Genre Bacillus

Type Msophile

Milieu naturel Vgtation, sols, eaux

Facteur de gravit Pathogne

Forme Mobile avec des cils pritriches. Possde une capsule


forme dun polymre dacide glutamique

Taille Entre 0,6 et 0,9 m sur 1 1,5 m

Tolrance au NaCl (en%) 7%

pH extrmes de croissance 5,7 9,5

T optimale de croissance 17C 50C

T extrmes (mini-maxi) 15C 55C

Oxygne Arobie, anarobie facultatif

Spores +, non dformante centrale ou paracentrale

Aw minimum 0,95

VNC (Viable Non Cultivable) +

Toxines dans les aliments Toxine puissante

Gram +

Aliments risques Viandes cuites, lgumes cuits, saucisses, pain, ptisseries,


crme ptissires[1]

Symptmes Diarrhe, vomissements

Dose infectieuse Eleve (108)

Priode dincubation 2 14 heures

Enzymes produites Protases, lcithinase, alpha-amylase thermostable (active


> 75C), lipopnicillinase, phosphatase alcaline, chitinase,
nitrate rductase, lipase, cellulase

Bactriocines formes Bacitracine, proticine

[1] Bacillus lichenformis, Missouri University of Science and Technology, Erin Pringle, 2005
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Tableau 2 : Carte didentit de Bacillus stearothermophilus.

Microorganisme Bacillus stearothermophilus

Famille Bacillaceae

Genre Geobacillus

Type Thermophile

Milieu naturel Le sable, les vents ocaniques et les sources chaudes

Facteur de gravit Non pathogne

Forme Btonnet, mobile, pigments sur certains milieux

Taille Entre 0,6 et 0,9 m sur 1 1,5 m

Tolrance au NaCl (en%) 7%

pH extrmes de croissance 2 11

T optimale de croissance 55C

T extrmes (mini-maxi) 30C 75C

Oxygne Arobie

Catalase +

Oxydase +

Spores +

VNC (Viable Non +


Cultivable)

Toxines -

Gram +

Aliments risques Lait, produits laitiers

Enzymes produites Alpha-amylase thermostable (active > 75C), Beta


galactosidase

[2] Bacillus lichenformis, Missouri University of Science and Technology, Erin Pringle, 2005

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5. Obtention de la souche productrice

Le clonage molculaire permet linsertion dun fragment dADN exogne dans un plasmide,
son transfert dans une bactrie et sa multiplication. Dans ce cas, nous allons voir les
diffrentes tapes menant linsertion du gne codant pour lapha-amylase provenant de G.
stearothermophilus dans B. licheniformis.

5.1. Extraction de lADN de Geobacillus stearothermophilus


La squence codante pour lalpha-amylase chez Geobacillus stearothermophilus a t choisie
dans la base NCBI. Le numro daccession est le suivant : NZ_LQYV01000081.1
La squence codante pour lalpha-amylase est situe entre 391 et 2004 pbs correspondant la
squence complmentaire. Il a ainsi une taille de 1614 pbs.

L'ADN gnomique de G. stearothermophilus souche B4109 a t isol selon le protocole de


Cheng et Jiang (2006). Tout dabord, G. stearothermophilus est cultiv pendant 24h dans le
milieu LB 30C agit 250 tr/min. A lissue de cette tape, 1 mL de suspension cellulaire
est centrifug 8000 g pendant 2 min. Aprs limination du surnageant, les cellules sont
laves deux fois avec 400 L de tampon STE (100 mM de NaCl, 10 mM de Tris / HCl, 1 mM
d'EDTA, pH 8,0). Ces dernires sont nouveau centrifuges 8000 g pendant 2 min et le
culot est remis en suspension dans 200 L de tampon TE (Tris 10 mM / HCl, EDTA 1 mM,
pH 8,0). Puis, on ajoute 100 L de phnol satur en Tris (pH 8,0) au tube et on passe le
mlange au vortex pendant 60s afin de lyser les cellules.
Lchantillon est ensuite centrifug 13 000 g pendant 5 min 4C pour sparer la phase
aqueuse de la phase organique. On transfre la phase aqueuse suprieure dans un tube strile
de 1,5 mL, on y ajoute 40 L de tampon TE et 100 L de chloroforme. Puis, le mlange est
centrifug pendant 5 min 13 000 g 4C. Cette tape de purification pourrait tre rpte
deux trois fois jusqu' ce que linterface blanche ne soit plus prsente, afin denlever
compltement les impurets de la couche aqueuse. Cette dernire est transfre dans un
nouveau tube de 1,5 mL o on y ajoute 40 L de TE et 5 L de RNase ( 10 mg/mL) et on
incube 37C pendant 10 minutes pour digrer l'ARN. Enfin, on ajoute 100 L de
chloroforme dans le tube, on mlange bien et on centrifuge pendant 5 minutes 13 000 g
4C. La phase aqueuse suprieure contenant l'ADN gnomique purifi de G.
stearothermophilus est transfre dans un tube de 1,5 mL pour procder la PCR.

5.2. Amplification du gne par PCR (Raction de Polymrisation en Chane)

La PCR est une mthode rapide de biologie molculaire d'amplification gnique qui permet
de dupliquer en grand nombre une squence d'ADN ou d'ARN connue partir d'acide
nuclique et d'amorces spcifiques.

La spcialit de la PCR dpend de faon critique des amorces. Le choix dun couple
damorces repose sur quelques principes gnraux dont :

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La taille doit tre comprise entre 15 et 30 nuclotides. Infrieure 15 nuclotides, les
amorces sont non spcifiques du fragment amplifier et suprieure 30 nuclotides,
la temprature de fusion sera trop leve.
Il doit y avoir une complmentarit totale avec les rgions flanquantes du fragment
amplifier, pour viter les msappariements.
Il ne doit pas y avoir dauto-complmentarit et de complmentarit entre les
amorces: pas de dimres damorces.
Il ne doit pas y avoir de structures secondaires : pas de boucles ou hairpin.
Il ne doit pas y avoir de rptition en tandem de nuclotides suprieurs 4 : viter le
risque de msappariement.
Le des amorces doit tre suffisamment lev, soit entre 52C et 58C si possible
car plus le est lev moins le risque dhybridation non spcifique est important.
La diffrence de entre les amorces doit tre infrieur 5C

Les amorces ont t choisies grce au site NCBI et nous avons vrifi quelles respectent bien
les conditions cites ci-dessus.

Tableau 3 : Informations relatives aux amorces choisies.

Amorce Squence start stop


Forward 5'---ACG TAA CAG ACA TTG ACA CG---3' 56,14 C 217 pb 236 pb
Reverse 5'---ATC CAA ACC GTC GAA TGT AA---3' 55,09 C 2085 pb 2066 pb

Nous avons ajouts des sites de restrictions aux amorces, de sorte ce que les enzymes de
restrictions puissent couper le plasmide au niveau du site de polyclonage, mais pas
lamplicon. En effet, ces enzymes (endonuclases) sont des molcules dorigine bactrienne
ayant la particularit de couper les molcules dADN bicatnaires des sites spcifiques de la
squence appele site de restriction. Chaque enzyme reconnat et coupe une squence
nuclotidique donne.
Ainsi, nous avons choisi deux enzymes de restrictions de sorte ce que linsert soriente
dune seule faon dans le vecteur.

Tableau 4 : Informations relatives aux enzymes de restriction choisies.

Enzyme Source Site de reconnaissance et site de coupure


XbaI Xanthomonas badrii 5'---T CTAGA---3'
3'---AGATC T---5'
AatII Acetobacter aceti 5'---GACGT C---3'
3'---C TGCAG---5'

Celles-ci aboutissent des coupures dcales, autrement dit, ils gnrent des extrmits
monocatnaires protubrantes ayant des squences complmentaires appeles extrmits ou
bouts collants.

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Afin damliorer la reconnaissance du site de restriction par son enzyme, quelques
nuclotides (2 pb) devront tre ajouts aux extrmits 5. Ainsi nous obtenons les amorces
suivantes dont les Tm ont t recalculs sur le site IDT :

Tableau 5 : Informations relatives aux amorces possdant un site de restriction et 2


nuclotides du ct 5.

Amorce Squence Tm Thyb=Tm-5C

Forward 5---GGGACGTCACGTAACAGACATTGACACG---3 62.4C 57.4C

Reverse 5---TTTCTAGAATCCAAACCGTCGAATGTAA---3 56.4C 51.4C

Il faut savoir que les sites de restriction ont t placs sur les amorces en fonction de la
configuration du plasmide choisi en 5.3. En effet, au sein de lADN exogne, le codon
initiateur (ATG) du gne est en position 2004 pb et est suivi de lamorce reverse. Il est donc
judicieux de placer le site de restriction XbaI (5TCTAGA) prs de lamorce reverse. Par
consquent, le site de restriction AatII (5GACGTC) sera du ct de lamorce forward.

Pour pouvoir effectuer une PCR, nous utilisons un master mix de thermo scientifique qui est
une solution compose de Taq polymerase 0,05 U/L, de dNTP 0,4 mM chacun, de
ractif buffer et de MgCl2 4 mM. Il faut savoir quil faut ajouter au mix lADN amplifier
et les amorces. Ce pr-mlange permet d'conomiser du temps et rduire les contaminations
dues aux nombreuses tapes de pipetage.

Protocole :
- Vortexer le PCR Master Mix (2X) aprs dconglation;
- Dans un tube de PCR ajouter 25 L PCR Master Mix (2X), 0,1 1,0 M damorce
forward et Reverse, 10 pg 1 g dchantillon dADN et 50 L deau ne contenant
pas de nuclase;
- Vortexer les chantillons;
- Placer les chantillons dans le thermocycleur et le programmer avec les paramtres ci-
dessous.

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Tableau 6 : Paramtres de la PCR.

Temprature Nombre
Etapes Temps Explication
(C) de cycle

Pr- Durant ces tapes les liaisons


95 1-3min 1
dnaturation d'hydrognes sont rompues et les 2
brins de l'ADN se sparent. L'ADN
Dnaturation 95 30 s passe sous forme simple brin dans le
milieu.

Lors de cette tape, les amorces se


fixent sur les codons initiateurs (sur
Thyb =Tm-5
Hybridation 30 s les monobrins dADN), en fonction
soit 55
de la complmentarit (AT/CG) des
nuclotides.

Cette tape permet la Taq


30 polymrase de synthtiser le brin
complmentaire de leur ADN
matrice. Ce brin est fabriqu partir
1min/kb des dNTPs libres prsents dans le
Elongation 72 soit soit milieu ractionnel.
2min Un brin faisant 1 kpb devra subir
une longation dune minute. Ainsi,
notre brin faisant presque 2 kpbs
(1885 pbs), cette tape devra durer
2 minutes.

Elongation
72 5-15min 1
finale

A lissue de la PCR, le nombre total de copies gnres est 2n, o n est le nombre de cycles
d'amplification, ce qui gnre 230 copies d'ADN.
5.3. Insertion des amplicons dans le plasmide
Principe : Le vecteur de clonage est coup par une enzyme de restriction qui reconnat un
site unique plac au site de polyclonage. Ce site tant unique, le vecteur est donc linaris et
possde chaque extrmit une partie de la squence dADN reconnue par lenzyme de
restriction.
LADN exogne est digr par la mme enzyme de restriction que celle utilise pour la
linarisation du vecteur. Les fragments obtenus possdent donc galement leurs extrmits
une partie de la squence dADN reconnue par lenzyme de restriction.

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Lorsque le plasmide ouvert linaris et les fragments dADN donneur sont confronts, il y a
hybridation (formation de liaisons hydrogne) des extrmits cohsives complmentaires,
suivants la loi de complmentarits A/T, G/C.

Une enzyme appele ligase, permettant la formation dune liaison covalente entre ces
fragments dADN hybrids, est alors ajoute pour ligaturer le fragment dADN exogne au
plasmide. Laction de la ligase est de crer des liaisons phosphodiester entre les extrmits
5-P et 3-OH rendues adjacentes par lhybridation des extrmits cohsives du fragment et
du plasmide.

Choix du plasmide : Le plasmide pHT01, dune taille de 7954 pbs, a t choisi pour
linsertion de lamplicon. En effet, il possde une origine de rplication de E. coli qui
permettra par la suite daugmenter le nombre de plasmide lors du dveloppement de E. coli
mais il permet aussi lexpression des protines chez Bacillus une fois intgre dans la
bactrie. Dautre part, il possde des gnes de rsistance lampicilline et au
chloramphnicol qui seront ncessaire pour la suite du clonage, et le gne lacI qui sera
ncessaire pour la production de lenzyme.

Figure 1 : Carte du plasmide pHT01.

Digestion enzymatique : Dans notre cas lADN plasmidique et linsert sont digrs par deux
enzymes de restriction (XbaI et AatII), ainsi linsert pourra sintgrer dans une seule
orientation. Dans le plasmide pHT01, ces sites de restrictions sont spars par 3 pbs, ainsi, le
plasmide linaris aura une taille de 7951 pbs car la digestion aura libr ce triplet de
nuclotides.

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5.4. La transformation de E. coli

Avant que la bactrie subisse une transformation il faut la rendre comptente, c'est dire
s'assurer que son tat physiologique garantit une efficacit maximum de transformation.
Pour cela il faudra obtenir des cellules venant de se diviser plusieurs fois au cours de la phase
exponentielle : ce moment les membranes sont tires au maximum et la paroi cellulaire est
plus permable contrario dune vieille paroi qui est plus rticule.
D'autre part la cellule est dans un tat nergtique lui permettant de rsister au mieux aux
traitements de la transformation.

Ainsi, les tapes suivre pour rendre comptente les souches dEscherichia coli sont les
suivantes:
1. Prlever des souches dE.coli en phase exponentielle.
Pour cela, il faut prlever une culture de E. coli, et la diluer dans du milieu LB. Aprs 3
heures, effectuer une mesure dabsorbance sachant que la densit optique doit tre comprise
entre 0,5 et 0,6.

2. Les refroidir et les mettre en contact dune solution concentre de chlorure de calcium
pour les rendre comptentes.
Cela consiste transfrer 1 mL de la culture dans un eppendorf marqu + ainsi quun 1mL de
la culture dans un second eppendorf marqu -. LADN sera ajout dans leppendorf + et le -
servira de tmoin pour lexprience. Centrifuger pendant environ 30 secondes, liminer
ensuite le surnageant, ajouter 100 microlitres de chlorure de calcium une concentration de
0,05 M au culot et le remettre en suspension dlicatement. Rpter cette tape une seconde
fois. Enfin, les garder au froid jusqu leur emploi.

Remarque: En prsence dune solution concentr en ions Ca la structure des membranes


cellulaire va tre altre. Il y aura cration de plusieurs micro perforations par lesquelles
lADN pourra pntrer, les cellules vont tre capables dingrer des petites molcules dADN
comme un plasmide.

Aprs avoir rendu comptentes nos souches E.coli, il est possible de procder leur
transformation. Pour ce faire il faut:

1. Etablir un choc thermique.


Les souches comptentes sont soumises une temprature de 42C pendant 1 minute ce qui
va permettre lADN plasmidique de pntrer dans les cellules. Ces tubes marqus +
additionns du milieu LB sont ensuite mis dans la glace pendant 15 min afin que le
plasmide soit bien ingr par la cellule. Cette tape est suivie dune incubation 37C
pendant 30 minutes pour que les membranes des cellules puissent se rgnrer sa
temprature optimale. Elle permet galement la synthse de la protine qui confre la
rsistance lantibiotique.

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2. Slectionner les bactries transformes.
Pour pouvoir slectionner les bactries dites transformes il faut les mettre en culture sur des
milieux adquats pour leur dveloppement.

Tableau 7 : Corrlation entre les tubes marqus et leurs milieux

Tubes Milieux
Tube marqu + Milieu LB + Amp
Tube marqu + Milieu LB
Tube marqu - Milieu LB + Amp
Tube marqu - Milieu LB

Remarque: La mise en culture dans des milieux avec et sans ampicilline permet de mesurer
l'efficacit de la transformation en comparant le nombre de colonies dans les deux botes.

Les botes sont ensuite mises incuber 37C pendant une nuit pour ainsi permettre leur
lecture et dnombrement. Dans les botes contenant de l'ampicilline, seules les bactries ayant
intgr le plasmide portant le gne de rsistance l'ampicilline sont capables de pousser. Ce
sont donc ces colonies qui seront slectionnes, celles-ci ayant bien intgr le plasmide.
5.5. Extraction (miniprep) et digestion
Afin de slectionner les E. coli qui possdent le plasmide recombin, nous allons extraire les
plasmides de 10 colonies ayant pouss sur le milieu avec ampicilline provenant des botes
contenant le milieu LB et lampicilline et procder une miniprep.
Une miniprparation ou miniprep est une technique permettant dextraire une petite quantit
dADN sous forme de plasmide provenant de bactrie ayant subi une transformation, le plus
souvent E. coli comme nous allons le prsenter ci-aprs.

Il existe trois grandes tapes de la miniprep :


1. Destruction des parois des bactries : lyse cellulaire par un dtergent en milieu dans le
but de librer lADN gnomique et plasmidique.
2. Extraction de lADN plasmidique contenu dans E. coli : centrifugation permettant de
rcuprer lADN plasmidique dans le surnageant aprs prcipitation.
3. Purification de cet ADN plasmidique : lavage et lution avec des tampons pour
dissoudre les sels et restituer ses proprits physico-chimiques.

Afin de procder lextraction et la digestion de lADN plasmidique d'E. coli, nous


pouvons utiliser un kit commercial type Qiagen miniprep kit DNA extraction en ajoutant les
tampons (Buffer 1, Buffer 2, Buffer PE) en quantits adquates.

Ci-aprs un tableau rcapitulatif des solutions utiliser avec leurs quantits et leurs
compositions selon les diffrentes tapes de la mini prp.

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Tableau 8 : Description des tapes de la mini prp en fonction des diffrents tampons.

Etape Tampon Composition Quantit

50 mM glucose
Remise en suspension des
Buffer P1 10 mM EDTA 250L
cellules bactriennes
25 mM Tris ( pH 8)

0,2 M NaOH
Lyse cellulaire Buffer P2 250L
1% SDS

3 M KOAc ( pH 6)
Neutralisation de lADN
Buffer N3 Pour 100 mL de solution : 60 mL 350L
plasmidique
5 M de potassium dactate

Lavage et lution de lADN


Buffer PE Wash QIAprep (ethanol) 0,75 mL
plasmidique

Remettre en suspension le
Buffer EB 10 mM Tris-HCl ( pH 8) 50L
culot dADN plasmidique

Rf : Plasmid DNA isolation (QiAgen Miniprep kit). Protocols. 18/07/06.


Plasmid DNA Extraction from E. coli using alkaline lysis method.02/05/11.

5.6. Electrophorse
Pour chaque colonie prleve, nous avons ralis une digestion enzymatique des plasmides
par XbaI et AatII. Nous allons effectuer une lectrophorse sur gel dagarose pour dterminer
la taille des fragments des gnes et ainsi confirmer ou infirmer la prsence du gne chez les
colonies prleves.

Pour effectuer l'lectrophorse, la premire tape consiste prparer un gel d'agarose 1%


(poids /volume). On pse l'agarose dans une fiole Erlenmeyer de 250 mL et on y ajoute 50
mL de 0,5xTris-Buffer EDTA (TBE). Ensuite, la solution est chauffe dans un micro-onde
pendant 1min 30s la puissance 5 et ensuite pendant 30 s la puissance 7. Le mlange fondu
est refroidi l'eau froide et est plac dans une cassette.
Lorsque le gel est prt, on prpare les chantillons constitus de 2 L de digestat avec 3 L
de tampon de charge qui est du bleu de bromophnol. Afin de connatre la taille de chaque
fragment, on utilise 5 L de marqueurs de taille molculaire. Enfin, on dpose le ladder et les
chantillons dans chaque puits du gel.
On effectue la migration 125 volts pendant environ 30 40 minutes. Comme l'ADN est
charg ngativement, il migre de llectrode ngative (cathode) l'lectrode positive (anode).
A la fin, le gel est color pendant 20 min dans du bromure d'thidium, qui est un agent
d'intercalation et permet de teindre l'ADN lorsqu'il est expos la lumire ultraviolette.

Nous connaissons la taille du gne identifier et la taille du plasmide. En effet, la digestion


enzymatique du plasmide recombin a abouti 2 fragments de gnes : lamplicon insr
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(1885 pbs) et le reste du plasmide (7951 pbs). Les colonies qui ne prsente que le plasmide
qui sest referm sur lui-mme aboutira un seul fragment. Une fois que la prsence du gne
a t confirm dans une ou plusieurs colonies, on peut alors insrer lADN extrait de ces
colonies et les incorporer dans B.licheniformis.

5.7 .Insertion des plasmides dans B. licheniformis

Selon Selon C. B. Thorne and H. B. Stull, J. Bacteriol. 91:10121020, 1966, certaines


souches de B. licheniformis sont naturellement comptentes. Cest par exemple le cas de la
souche 9945A. B. licheniformis tant une bactrie Gram positif, les souches non
comptentes ncessitent une lectroporation pour les rendre comptente et procder la
transformation.

tapes de prparation des cellules de B. licheniformis lectrocomptentes.

1. Diluer 20 fois une culture de B. licheniformis dans un milieu LB contenant 0,5 M de


sorbitol et faire pousser 37 C jusqu' la valeur de la DO 600 nm soit de 0,85 0,95.
2. Refroidir les cellules dans la glace pendant 10 min et les rcolter par centrifugation 4 C,
5000 g pendant 5 min.
3. Laver les cellules quatre fois avec une solution dlectroporation compose de 0,5 M
sorbitol, 0,5 M mannitol et 10 % glycerol.
4. Suspendre les cellules dans 1/40 du volume de solution d'lectroporation avec une
concentration cellulaire de 1,3.1010 UFC /mL.

tapes pour llectroporation des cellules.

1. Ajouter 1 L (200 ng / L) de plasmide 60 L de cellules lectrocomptentes.


2. Homogniser en mlangeant avec une pipette plusieurs fois.
3. Transfrer le mlange dans une cuvette prchauffe et Incuber pendant 1 1,5 min.
4. Insrez la cuvette dans l'appareil paramtr en mode procaryote, avec une tension de 2,1 V,
une impulsion pendant 5 ms.
5. Ajouter immdiatement 1 mL de milieu LB contenant 0,5 M de sorbitol and 0,38 M de
mannitol et incuber pendant 3 h 37 C.

5.8 .Vrification de la prsence du gne dans B. licheniformis

Les souches seront cultives sur des milieux de culture ddis la croissance de Bacillus1
auquel on aura additionn du chloramphnicol. Ce dernier est un antibiotique qui permettra
de slectionner uniquement les bactries qui ont bien intgr le plasmide. Ce plasmide
contient en effet un gne de rsistance au chloramphnicol.

1
http://www.himedialabs.com/TD/M1383.pdf
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Les seules colonies qui se dvelopperont sur la glose auront donc forcment intgr le
plasmide et ce sont ces colonies que lon slectionne pour produire lenzyme.

6. Obtention de la prparation enzymatique

La prsence du plasmide contenant le gne dintrt a bien t vrifie. il est donc possible de
cultiver B. licheniformis modifi pour permettre la scrtion de lenzyme souhaite : lalpha-
amylase. Le mode de culture pour lobtention de la prparation enzymatique prsent ci-
aprs a t propos par Bashir et al alpha-amylase from Banana waste. (2014).
Nous avons choisi cette mthode car la production dalpha-amylase se fait par fermenteur
batch. En effet, ce type de conduite de fermentation permet de mieux matriser les paramtres
physicochimiques, notamment, laration. Ainsi, nous pourrons faire pousser la bactrie
faire de la respiration et produire de la biomasse en couplage avec lalpha-amylase.
Il faut savoir que comme la production de biomasse est couple avec celle de lenzyme, il est
possible daugmenter la quantit de biomasse en ayant recours limmobilisation des
cellules. De plus, les caractristiques principales de B.licheniformis (Temprature de
croissance, gram, oxygne etc.) sont en adquation avec les diffrents paramtres prsents
dans la publication.

1. Prparation de linoculum
Il est tout dabord ncessaire dobtenir une suspension dinoculum homogne de la souche B.
licheniformis modifie. Un erlenmeyer contenant 30 ml de bouillon nutritif doit tre strilis
121C et 103 kPa pendant 15 min. Une souche pure de B. licheniformis modifi y sera
ensuite cultive 30C +/- 1C pendant 48 h. Pour rendre la suspension homogne, il faut
ensuite placer lerlenmeyer dans un incubateur permettant une agitation 120 tr/min et une
temprature contrle de 37C pendant 12h.

2. Fermentation en batch
La production dalpha-amylase est ralise par fermentation. Plusieurs milieux de
fermentation ont t proposs, mais nous avons choisi le milieu ayant le meilleur rendement
selon Bashir et al. (2014). Celui-ci contiendra :
Dchets de banane 3g/L, source de carbone (facultatif tant donn que lIPTG
permet linduction du promoteur mais permet la croissance des bactries)
Extraits de levure 2 g/L, source de carbone et dazote
K2HPO4 1g/L, source de phosphore
MgSO4.7H2O 0,5g/L, complment de substrat
CaCl2 2 g/L, complment de substrat
IPTG 1 mM, induction du promoteur groE du plasmide pHT01

500 mL dinoculum sera ajout 5L de milieu de fermentation dans un bioracteur de 7,5 L.


Pour optimiser la fermentation, il est ncessaire davoir une vitesse daration constante de
0,55 L.L-1.min-1 et une concentration en oxygne dissous 20% de saturation grce une

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vitesse dagitation de 1000 1200 tr/min une temprature de 30C. Un agent antimousse
pourra tre ajout manuellement grce un capteur. Le pH sera maintenu 7.

3. Extraction de lalpha-amylase
Lalpha-amylase est extraite du milieu ferment par centrifugation 10 000 g pendant 15
minutes temprature ambiante. Le surnageant doit ensuite tre purifi pour obtenir lextrait
purifi dalpha-amylase.

4. Purification de lalpha-amylase
Plusieurs tapes sont suivre pour la purification de lalpha-amylase. On procde tout
dabord une prcipitation avec le sulfate dammonium solide de lalpha-amylase brute pour
obtenir une saturation de 80% 0C. Cette tape se fait sous agitation 100 tr/min. Les
prcipits forms sont ensuite lyophiliss et dissous dans du tampon phosphate pH 7. Ils
sont ensuite dialyss contre du tampon phosphate de sodium 0,05 mM. Lchantillon est
charg sur une colonne changeuse danions constituant la chromatographie liquide
protine rapide (FPLC). Lquilibrage pralable de la colonne est ralise par du tampon
phosphate de sodium 50mM un dbit de 1mL/min. Lalpha-amylase sera lue avec un
gradient de NaCl dans le tampon. Cest cette chromatographie qui permettra, par change
dions, dobtenir une alpha-amylase pure.

7. Conclusion

Lalpha-amylase est une enzyme d'intrt majeur dans diffrentes industries notamment dans
lindustrie agro-alimentaire. Grce aux outils de la biotechnologie nous avons pu mettre en
place une dmarche permettant lobtention de B.licheniformis modifie, autrement dit un
OGM, produisant de lalpha-amylase.
Il faut savoir quen France, lutilisation dOGM en agro-alimentaire ( destination de
lalimentation humaine ou animale) est rglemente.
Le mode de culture et les paramtres associs tels que la vitesse daration, le pourcentage de
saturation en oxygne, lagitation, la temprature et le pH doivent tre dfinis pour que
lOGM produise de lalpha-amylase de faon optimale.
En dfinitive, lobtention de la prparation enzymatique ncessitera des mthodes
dextraction et de purification de lalpha amylase qui devront tre matrises pour obtenir les
meilleurs taux de rendement et de purification.

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8. Rfrences bibliographiques

Bibliographie
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industry A review. Brazilian Journal of Microbiology. 2010;41(4):850-861.
doi:10.1590/S1517-83822010000400004.
- Cheng H-R, Jiang N. Extremely rapid extraction of DNA from bacteria and yeasts.
Biotechnol Lett 2006;28:559.
- RACHINGER, Michael, VOLLAND, Sonja, MEINHARDT, Friedhelm, DANIEL,
Rolf et LIESEGANG, Heiko, 2013. First Insights into the Completely Annotated
Genome Sequence of Bacillus licheniformis Strain 9945A. Genome Announcements
[en ligne]. 1 aot 2013. Vol. 1, n 4. [Consult le 14 fvrier 2017]. DOI
10.1128/genomeA.00525-13. Disponible ladresse :
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3731831/
- THORNE, C. B. et STULL, H. B., 1966. Factors affecting transformation of Bacillus
licheniformis. Journal of Bacteriology. mars 1966. Vol. 91, n 3, pp. 10121020.
- Bashir et al. (2014). -amylase from Banana Waste, BioResources 9(4), 6791-6804.

Sitographie
http://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/bacillus_subtilis_expression.html
http://nc2.neb.com/NEBcutter2/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov
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http://eur-lex.europa.eu/legal-content/FR/TXT/HTML/?uri=URISERV:l21119&from=FR
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http://www.brenda-enzymes.org/
http://www.himedialabs.com/TD/M1383.pdf

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