Disciplina: Microbiologia

CONTAGEM TOTAL DE MICRO-ORGANISMOS VIVEIS EM

AMOSTRAS DE LEITE IN NATURA

INTRODUO

O leite de vaca, em circunstncias normais, definido como um lquido branco,

ligeiramente amarelado, com odor suave e sabor levemente adocicado. Por definio
do dicionrio Houaiss, define-se como leite a secreo das glndulas mamrias de
fmeas dos mamferos.
Segundo o artigo 475 do RIISPOA Regulamento da Inspeo Industrial e
Sanitria de Produtos de Origem Animal entende-se por leite, sem outra
especificao, o produto oriundo da ordenha completa, interrupta, em condies de
higiene, de vacas sadias, bem alimentadas e descansadas.

Propriedades Fsico-Qumicas e Organolpticas

a) Sabor e odor O leite fresco, produzido sob condies ideais por uma vaca
sadia, deve apresentar um sabor adocicado, no sendo amargo nem cido.
Sabores e odores pronunciados em leite fresco devem-se usualmente
alimentao (rao, silagem) e ao ambiente de ordenha.

b) Cor A cor branca resulta-se da disperso da luz refletida pelos glbulos de

gordura e pelas partculas coloidais de casena e de fosfato de clcio. J a cor
amarelada provm do pigmento caroteno, que lipossolvel. Cores anormais
podem indicar a presena de colnias de micro-organismos desenvolvidas.

c) Acidez e pH O pH varia entre 6,6 e 6,8 (com mdia de 6,7 a 20 C ou 6,6 a

25 C). O leite, logo aps a ordenha, apresenta reao cida com a
fenolftalena, mesmo no ter passado por fermentao e ter produzido cido
lctico. A acidez do leite fresco deve-se presena de casena, fosfatos,
albumina, dixido de carbono e citratos.

d) Densidade - A densidade do leite varia entre 1,023 g/mL e 1,040 g/mL a 15 C.

Quanto mais alto o teor de densidade, maior ser a densidade, em razo do
aumento do extrato seco desengordurado que o acompanha no teor de
gordura.
 e) Ponto de congelamento Esse ponto est relacionado diretamente com a
composio do leite, que por sua vez depende de diversos fatores como a raa
do animal, o ambiente, o processamento industrial e as tcnicas crioscpicas.
Por exemplo, em um leite contendo 12,5 por cento de extrato seco (4,75 por
cento de lactose e 0,1 por cento de cloretos), o ponto de congelamento
aproximado ser -0,531 C.

f) Ponto de ebulio As substncias dissolvidas no leite fazem com que o

ponto de ebulio seja levemente maior que o da gua. A mdia estabelecida,
ao nvel do mar, de 100 a 101 C.

g) Viscosidade O leite mais viscoso que a gua, um fato que pode ser
explicado pela presena de protenas e lipdios, podendo sofrer alteraes com
o processamento industrial.

h) Condutividade eltrica A presena de ons, particularmente na forma de

sais, torna o leite uma soluo eletroltica.

Composio
O leite no nada mais que uma combinao de diversos elementos slidos em
gua. Os principais elementos slidos do leite so lipdios (gordura), carboidratos,
protenas, sais minerais e vitaminas. Apesar de aparentar uma mistura homognea,
heterognea. Os componentes do leite permanecem em equilbrio, de modo que a
relao entre eles muito estvel.

CONSTITUINTE TEOR (g/kg) VARIAO* (g/kg)

gua 873 855-887
Lactose 46 38-53
Gordura 39 24-55
Protenas 32,5 23-44
Substncias minerais 6,5 5,3-8,0
cidos orgnicos 1,8 1,3-2,2
Outros 1,4 -
Tabela 1: Composio mdia do leite de vaca.

Fonte: Adaptado de Walstra e Jenness, 1984. Disponvel em:

http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc06/quimsoc.pdf

*A variao ocorre em razo de diferenas entre raas, estgio da lactao e de acordo com a
alimentao dos animais.

a) gua Existe no leite em maior quantidade, ou seja, quantitativamente

mais importante. Nele se encontram dissolvidos, suspensos ou
emulsionados os demais componentes.

b) Gordura responsvel pela colorao ligeiramente amarela do leite e

se encontram na forma de pequenos glbulos, suspensos na fase
 aquosa. Os glbulos esto envolvidos por uma camada constituda por
fosfolipdio, a qual impede a unio destes.

c) Carboidrato O principal carboidrato do leite seria lactose. um dos

elementos mais estveis do leite, isto , menos sujeito a variaes.

d) Protena So eles os elementos que do ao leite a cor esbranquiada

opaca. Existem vrios tipos de protenas no leite. Cerca de 80% se
refere a casena, que apresenta alta qualidade nutricional. Apesar de
aparecer em menor porcentagem, pode-se citar a albumina e globulina
tambm. A casena no facilmente alterada pelo calor, se mostrando
bastante estvel no processo de pasteurizao (aquecimento), porm
suas propriedades podem ser modificadas com a mudana do pH, pela
coagulao.

e) Sais minerais - O leite contm teores considerveis de cloro, fsforo,

potssio, sdio, clcio e magnsio e baixos teores de ferro, alumnio,
bromo, zinco e mangans, que formam sais orgnicos e inorgnicos. A
presena marcante do clcio e do fsforo do leite pode ser explicada,
em parte, por estarem associados casena. A seguir esto os principais
minerais presentes no leite e suas respectivas funes biolgicas no
corpo humano.

Cloro: Regulao da presso osmtica, participao no equilbrio cido-

base, manuteno do pH sanguneo, digesto e ativao de enzimas.

Fsforo: Formao de ossos e dentes, absoro da glicose,

metabolismo de protenas, gorduras e carboidratos. Participa de
sistemas enzimticos.

Potssio: Manuteno do lquido intracelular, contrao muscular,

conduo nervosa, frequncia cardaca, produo de energia, e sntese
de protenas e cidos nuclicos.

Sdio: Equilibra os lquidos corporais, juntamente com o potssio e

cloreto, manuteno do equilbrio cido bsico, excitabilidade de
msculos e controla a presso osmtica.

Clcio: Formao de ossos e dentes, coagulao sangunea, ativao

de enzimas, conduo de impulsos nervosos e contrao muscular.

Magnsio: Necessrio para a atividade normal das enzimas e para o

uso de energia. Crescimento de ossos. Fundamental para a funo
normal do clcio.

f) Vitaminas O leite uma importante fonte de vitaminas, algumas se

associam com os glbulos da gordura (A, D, E e K), enquanto outras se
 associam com a parte aquosa. So encontradas no leite as seguintes
vitaminas:

Vitaminas A: Relativamente abundante no leite, est estritamente

associada gordura. importante no crescimento, pois forma ossos e
dentes, melhora a pele e o cabelo, protege os aparelhos respiratrios,
digestivo e urinrio e tambm evita a cegueira noturna.

Vitamina B1 (Tiamina): Existe no leite em propores variveis, cerca

de 750 miligramas por litro, que corresponde a 75% das necessidades
humanas desta vitamina. Ajuda o corpo a produzir novas clulas
saudveis, alm de possuir capacidade de proteger o sistema
imunolgico.

Vitamina B2 (Riboflavina): Est presente no leite numa proporo em

torno de 1 mg por litro, quantidade que cobre boa parte das
necessidades humanas. Esta vitamina B funciona como um antioxidante
para ajudar a combater os radicais livres e pode prevenir o
envelhecimento precoce e o desenvolvimento de doenas cardacas.
Alm dessas funes biolgicas, participa da produo de glbulos
vermelhos do sangue.

Vitamina B4: Desempenha ao co-fermento na fermentao ltica.

Vitamina B6 (Piridoxina): Juntamente com as vitaminas B12 e 9, a B6

ajuda a regular os nveis do aminocido homocistena (associado com a
doena cardaca). Est intimamente ligado aos padres do humor e do
sono, pois ajuda o corpo a produzir serotonina, melatonina e
norepinefrina.

Vitamina B12 (Cobalamina): Trabalha juntamente com a vitamina B9

para produzir clulas vermelhas no sangue.

Vitamina C (cido ascrbico): A sua funo biolgica a preservao

dos ossos, dentes, gengivas e vasos sanguneos. Tambm aumenta a
absoro de ferro, ajuda o sistema imunolgico e aumenta a
cicatrizao.

Vitamina D: Encontra-se associada gordura do leite, mas em

quantidade insuficiente para atender as necessidades humanas de 1 mg
diariamente. fundamental no fortalecimento dos ossos e dentes e
ajuda na coagulao do sangue.

Vitamina K: Tem sido encontrada em quantidades variveis, mas

comum estar presente no leite.
Principais grupos de micro-organismos que podem contaminar o leite

Os principais microrganismos que contaminam o leite so as bactrias. Os

vrus, fungos e leveduras tm participao mais tmida. O grau de
contaminao do leite depender de fatores como higienizao do ambiente e
de materiais como baldes, lates, equipamento de ordenha e do tanque de
refrigerao, e a sade da vaca leiteira.
O leite cru pode conter poucos milhares de bactrias quando proveniente
de uma fazenda com boas condies de higiene, mas pode chegar a vrios
milhes se o padro de limpeza, desinfeco e refrigerao so inadequados.

a) Bactrias Mesfilas: Multiplicam-se rapidamente quando o leite no

armazenado sob refrigerao, pois sua faixa de temperatura tima para
reproduo se situa entre 20 e 40C. O cuidado deve ser redobrado nas
estaes mais quentes do ano. Elas fermentam a lactose produzindo
cido lctico e outros cidos orgnicos, o que causa acidez do leite.
Seus exemplos so: Streptococcus e Leuconostoc.

Figura 1 Streptococcus
Fonte:http://midasfieldguide.org/en/search/bacteria_02/firmicutes/bacilli/lactobacillales/streptococcaceae/streptococcus/
streptococcus_02.htm#;sid=84|47
 Figura 2 - Leuconostoc citreum
Fonte: http://www.gettyimages.co.nz/detail/photo/leuconostoc-citreum-high-res-stock-photography/128541912

b) Bactrias Termodricas: Resistem pasteurizao porque suportando

temperaturas mais altas (menos de 100C) ou produzem formas de
resistncia contra condies adversas que so denominadas esporos.
Exemplos de gneros com espcies esporuladas so: Clostridium e
Bacillus. So extremamente resistentes ao calor, necessitando-se, em
geral, de 20 minutos a 12C para a sua inativao total.

Figura 3 Clostridium
Fonte: http://www.biomed.cas.cz/mbu/lab127/projects/clostridium.html

Figura 4 - Bacillus cereus

Fonte: https://doencasesintomas.blogspot.com/2014/01/bacillus-cereus-definicao-causas.html

c) Bactrias Psicotrficas: Pertencem a diversos gneros que podem se

multiplicar em temperaturas baixas, mas a sua temperatura tima de
crescimento pode variar. Muitos dessa classificao pertencem a
mesfilos. Elas causam deteriorao quando se multiplicam no leite cru
antes ou aps a pasteurizao, pela atividade de suas enzimas
 extracelulares resistentes ao calor, e pela multiplicao das que so
tambm resistentes ao calor (termodricas). Exemplos de psicotrficos:
Pseudomonas, Aeromonas, Chromobacterium, Flavobacterium,
Lactobacillus, Arthrobacter.

Figura 5 - Aeromonas hydrophila

Fonte: http://articles.latimes.com/2012/may/15/nation/la-na-nn-flesh-eating-bacteria-20120515

Figura 6 - Lactobacillus acidophilus

Fonte:https://www.google.com.br/url?
sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwitq8ue9I_TAhWKD5AKHeEJBsoQjh
wIBQ&url=https%3A%2F%2Fwww.pinterest.com%2Fpin
%2F24488391695396317%2F&bvm=bv.152174688,d.Y2I&psig=AFQjCNGvvjwxEvA3BLCjmba69epdbtt-
Cw&ust=1491570735079937

d) Coliformes: Os principais microrganismos do grupo dos coliformes

compreendem os gneros Escherichia, Enterobacter e Klebsiella.
Embora a principal fonte desses microrganismos o trato intestinal dos
animais e so considerados como indicadores de contaminao fecal,
h alguns que existem no ambiente. Nmeros elevados de coliformes no
leite cru indicam falta de higiene na ordenha, limpeza inadequada de
equipamentos de ordenha ou de utenslios que entram em contato com
o leite e gua contaminada.
 Figura 7 - Escherichia coli
Fonte: http://www.gettyimages.com/detail/photo/escherichia-coli-bacteria-by-scanning-high-res-stock-
photography/128635458

Figura 8 - Enterobacter
Fonte: http://genome.jgi.doe.gov/ent_6/ent_6.home.html

e) Patognicos: Os patgenos mais importantes atualmente so

Salmonella sp., Escherichia coli patognica, Listeria monocytogenes,
Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica e Staphylococcus aureus. A
maior parte deles so destrudos pela pasteurizao (aquecimento),
porm, h chances de sobrevivncia.
 Figura 9 Salmonella
Fonte: http://www.food-info.net/es/bact/salm.htm

Figura 10 - Listeria Monocytogenes

Fonte: http://www.gettyimages.pt/fotos/listeria-monocytogenes

Processo de pasteurizao

um processo no qual consiste em submeter um produto alimentcio, nesse

caso o leite, alta temperatura e, logo em seguida, baixa temperatura. Essa
rpida variao de temperatura possibilita eliminar germes e bactrias
existentes nos alimentos. Este processo ocorre num aparelho conhecido pelo
nome de pasteurizador, em homenagem ao cientista francs Louis Pasteur
(1822-1895).
importante que este processo no cause alteraes fsico-qumicas e
organolpticas alm de no alterar o valor nutritivo do produto. Sendo assim, o
leite pasteurizado deve ser garantido do ponto de vista higinico-sanitrio, e
deve apresentar caractersticas semelhantes, ao mximo, ao produto natural.
Com este processo possvel eliminar, aproximadamente, 99% da microbiota
presente no leite, possibilitando assim, a conservao mais prolongada do
produto.
 Os micro-organismos com chances de sobrevivncia seriam os
termodricos. Existe tambm a possibilidade de contaminao de leites ps-
pasteurizados ou mesmo na realizao da pasteurizao inadequada.
Este processo possui outras desvantagens tambm, mas que no superam
as vantagens, como: reduo ou at mesmo eliminao de bactrias lcticas
benficas para o organismo, modificao do sabor do leite, desnaturao da
protena do leite que dificulta produo de alguns queijos.
Existem 3 tipos de pasteurizao:

a) Pasteurizao lenta (LTLT - Low Temperature Long Time) - A

temperatura chega a 63C por um tempo de 30 minutos.

pouco utilizada;
Descontnuo;
Demorada;
Alto consumo de energia;
Reduo mdia de 95% das bactrias;
Altera pouco o leite;
Vantajoso para fabricao de queijos

b) Pasteurizao rpida (HTST - High Temperature and Short Time) - A

temperatura chega a 72C por um tempo de 15 segundos.

Processo rpido e contnuo;

Ideal para grandes volumes de leite;
Eficincia mdia de 99,5% na reduo bacteriana;
Alterao um pouco maior no leite;

c) Pasteurizao muito rpida / Processo longa vida (UHT - Ultra High

Temperature ou temperatura ultra-elevada) - A temperatura varia de
130C a 150C, por um perodo de trs a cinco segundos.

Alta eficincia (> 99,99%);

Leite necessita homogeneizao;
Vida til 4 meses;
Elimina todas as formas vegetativas das bactrias;
Armazenagem em temperatura ambiente;
Algumas formas esporuladas podem, eventualmente, sobreviver

Tcnicas de contagem
 Selecionar placas entre 25 e 250 colnias. Para calcular o nmero de UFC
(Unidade de Formao de Colnias) por grama ou mL da amostra, multiplicar o
nmero de colnias pelo fator da diluio inoculada. No caso de bolores e
leveduras, recomenda-se contar placas com 10 a 150 colnias, em lugar de 25
a 250 colnias.
UFC / g ou mL = no de colnias x 10 / diluio

Caso haja mais de uma placa inoculada por diluio (duplicata), considerar
a mdia das duas para os clculos dos resultados.
Algumas situaes adversas:

1. Todas as placas com mais de 250 colnias:

No sendo possvel contar todas as colnias da placa, mas se o nmero / cm^2

estiver abaixo de 10, contar as colnias em 12 quadrados consecutivos (6 na
horizontal e 6 na vertical), calcular a mdia e multiplicar pela rea total da placa
(65 cm^2 para placas de dimetro externo 100 mm). Usar esse nmero para o
clculo da UFC.

2. Nenhuma placa atingiu 25 colnias:

Calcular o nmero de UFC e apresentar o resultado como contagem estimada

(est.)

3. Nenhuma placa com crescimento:

Apresentar o resultado como menor do que 1/diluio (est.).

4. Placas em que o crescimento proporcionalmente maior nas

maiores diluies:

Reportar como acidente de laboratrio, caso no seja possvel repetir a

anlise.

5. Placas com espalhamento:

 a. Espalhamento resultante da desintegrao de agrupamentos de clulas
durante a mistura de inculo. Neste caso h formao de colnias
individuais. Se nenhuma das zonas de espalhamentos individuais for
superior a 25% da rea da placa e, ainda, se no ultrapassar 50% da
placa, contar como uma nica UFC. No conte as colnias
individualmente dentro dessas zonas.

b. No caso do espalhamento resultante da inadequada mistura do inculo

com o meio, onde a massa de crescimento contnua e no h
crescimentos individuais, selecionar uma regio da placa, livre de
espalhamentos e contar as colnias de diversos quadrados de 1 cm.
Calcular a mdia de colnias / cm^2, multiplicar por 65 e calcular o
nmero de UFC. Apresentar o resultado como estimado (est.).

Obs.: No caso de bolores e leveduras, recomenda-se contar placas com 15 a

150 colnias.

Interpretao dos resultados

Buscar padres microbiolgicos indicados pela legislao e comparar com
os resultados obtidos.

Referncias:

https://www.portaleducacao.com.br/conteudo/artigos/veterinaria/conceitos-
gerais-do-leite/17441 Acesso: 05/04/17
http://cienciadoleite.com.br/noticia/134/composicao-do-leite Acesso: 05/04/17
http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc06/quimsoc.pdf Acesso: 05/04/17
http://www.agencia.cnptia.embrapa.br/Agencia8/AG01/arvore/AG01_128_2172
0039243.html Acesso: 06/04/17
http://mundoeducacao.bol.uol.com.br/quimica/propriedades-cloro.htm Acesso:
06/04/17
http://www.sonutricao.com.br/conteudo/micronutrientes/p4.php Acesso:
06/04/17
http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Corpo/alimentos3.php Acesso:
06/04/17
https://essentialnutrition.com.br/conteudos/vitaminab/ Acesso: 06/04/17
http://www.esalq.usp.br/departamentos/lan/pdf/TecnologiaLeite.pdf Acesso:
06/04/17
http://www.suapesquisa.com/pesquisa/pasteurizacao.htm Acesso: 06/04/17
http://www.infoescola.com/microbiologia/pasteurizacao/ Acesso: 06/04/17
http://www.esalq.usp.br/departamentos/lan/pdf/Pasteurizacao.pdf Acesso:
06/04/17
Apostila de Apoio ao Componente: Microbiologia Bsica para o Curso Tcnico
2011