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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA

CENTRO DE CINCIAS RURAIS


PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIA DO SOLO

RELATRIO DE PS-DOUTORADO
PS-DOUTORADO JNIOR (PDJ)/CNPQ

PROJETO:

FUNGOS ECTOMICORRZICOS EM POVOAMENTOS


FLORESTAIS EXTICOS E FRAGMENTOS DE MATAS NATIVAS
DO BIOMA PAMPA

Dr. Ricardo Bemfica Steffen

Santa Maria, RS, novembro de 2012


2

SUMRIO

1 DADOS DO PROJETO ................................................................................................ 3

2 DADOS DO ESTGIO................................................................................................... 3

3 RESUMO......................................................................................................................... 5

4 INTRODUO............................................................................................................... 6

5 OBJETIVOS.................................................................................................................... 10

6 ATIVIDADES REALIZADAS...................................................................................... 11

7 ATIVIDADES PREVISTAS x ATIVIDADES DESENVOLVIDAS.......................... 20

8 PUBLICAES.............................................................................................................. 21

9 REFERNCIAS............................................................................................................ 22

10 ANEXOS ....................................................................................................................... 25
3

1 DADOS DO PROJETO

Projeto: Fungos ectomicorrzicos em povoamentos florestais exticos e fragmentos de matas


nativas do bioma Pampa

Submetido ao: Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq), na


modalidade de bolsa de Ps-doutorado Jnior (PDJ)

Processo: 155132/2010-5

Coordenadora do Projeto:
Prof. Dra. Zaida Ins Antoniolli Programa de Ps-Graduao em Cincia do Solo/UFSM

Instituio de Execuo do Projeto:


Universidade Federal de Santa Maria - Centro de Cincias Rurais Departamento de Solos
Av. Roraima, 1000 Bairro Camobi Santa Maria/RS
(55) 3220-8108 CEP 97.105-900

Vigncia inicial:
Outubro de 2010 a setembro de 2011.

Prorrogao concedida:
Outubro de 2010 a setembro de 2011.

2. DADOS DO ESTGIO

Perodo de realizao
De dezembro de 2010 a setembro de 2012.
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Dados do ps-doutorando
Nome
Ricardo Bemfica Steffen
Formao profissional
Engenheiro Agrnomo Solo (Universidade Federal de Santa Maria, 2004), Mestre em Cincia
do Solo (Universidade Federal de Santa Maria, 2007) e Doutor em Cincia do Solo
(Universidade Federal de Santa Maria, 2010).
E-mail: bemfica_steffen@yahoo.com.br

Dados da orientadora
Nome
Zaida Ins Antoniolli
Formao profissional
Biloga (Cincias Biolgicas, Pontifcia Universidade Catlica do Rio Grande do Sul, 1984),
Especialista em Biotecnologia (Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 1988), Mestre
em Fitotecnia (Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 1988), Doutora em Ecology of
Mycorrhizal Molecular Aspects (University of Adelaide, 1999).
Atuao profissional atual
Professora Associada do Departamento de Solos da Universidade Federal de Santa Maria.

Endereo profissional
Laboratrio de Microbiologia e Biologia do Solo e Ambiente, Sala 3310, Departamento de
Solos, Centro de Cincias Rurais, Prdio 42. Avenida Roraima, nmero 1000, Cep: 97.105-
900. Telefone: (55) 3220 8108.
E-mail: zantoniolli@gmail.com
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3 RESUMO

O Bioma Pampa o mais desconhecido dos biomas brasileiros. Sua fisionomia e


biodiversidade foram fortemente alteradas por presses antrpicas e, frente implantao de
grandes reas de monoculturas florestais, o bioma permanece suscetvel. As ectomicorrzas
encontram-se associadas s razes de essncias florestais e desempenham papel fundamental
na absoro de gua e nutrientes por estas plantas. Contudo, dados referentes diversidade
destes organismos no Pampa so extremamente escassos. Face ao exposto, torna-se urgente a
necessidade de pesquisas ligadas ao conhecimento da biodiversidade e prospeco destes
importantes recursos genticos, os quais podem auxiliar na sua conservao e para o
desenvolvimento sustentvel do pas, alm de servirem como indicadores da qualidade
ambiental. Este projeto de ps-doutoramento teve como objetivos: realizar uma reviso sobre
o atual estado do conhecimento de fungos ectomicorrizicos, com especial nfase aos de hbito
hipgeo; avaliar a biodiversidade de fungos ectomicorrzicos ocorrentes em povoamentos de
monoculturas florestais e fragmentos de matas nativas do Bioma Pampa, utilizando-se
mtodos morfolgicos e moleculares; obter isolados que viabilizem a produo de
inoculantes; e avaliar a compatibilidade de ectomicorrizas em espcies silviculturais exticas
e nativas por meio de tcnicas de cultura de tecidos. Expedies foram realizadas em
povoamentos homogneos de espcies exticas e em fragmentos de matas nativas do Bioma
Pampa, onde foram coletados fungos (juntamente com o solo) os quais foram e alguns esto
sendo - identificados morfologicamente. Alm disso, realizou-se a extrao do DNA
genmico destes fungos e a amplificao via reao em cadeia da polimerase da regio do
Espao Interno Transcrito (ITS) do rDNA destes fungos. Estes produtos de PCR foram
purificados e esto em fase de sequenciamento para a posterior comparao com dados do
GenBank e construo de anlises filogenticas. Da mesma forma, procurou-se isolar os
fungos coletados para posterior obteno de inculos. Os dados de pesquisa obtidos at o
presente momento esto em fase final de anlise, visando posteriores publicaes em
peridicos nacionais e internacionais.
6

4 INTRODUO

O Bioma Pampa, compartilhado pelo Brasil, Argentina e Uruguai, distribui-se de


forma predominante na maior parte do Rio Grande do Sul (64%), sendo sua ocorrncia restrita
a este nico Estado. O Pampa tem sido submetido forte ao antrpica, tendo como
consequncia a alterao significativa de sua fisionomia e biodiversidade. Poucas pesquisas
contemplam a avaliao dos organismos existentes neste ambiente, o qual pode ser
considerado como o menos conhecido dos biomas nacionais. Estudos nesse sentido podem
contribuir com novas descobertas cientficas, que auxiliariam em estratgias de conservao e
na utilizao de seres vivos de interesse no desenvolvimento cientfico e tecnolgico.
Em diversos ambientes, observa-se a importncia da presena de micorrizas no
desenvolvimento das plantas e na manuteno da dinmica de ecossistemas. Dos vrios tipos
de micorrizas existentes, as ectomicorrizas destacam-se em locais onde h presena de
espcies lenhosas. Contudo, a presena destes fungos nos fragmentos de mata nativa e em
povoamentos florestais exticos ocorrentes no Bioma Pampa no conhecida at o presente
momento. Dados dessa natureza podem representar informaes fundamentais para a
sustentabilidade, para o conhecimento de organismos presentes e de novas espcies, como
indicadores da qualidade ambiental e, adicionalmente, no isolamento e utilizao
biotecnolgica destes fungos na indstria e na produo vegetal. No entanto, no tocante aos
campos sulinos, as reas de florestas nativas, no frequentemente caractersticas destes
ecossistemas, encontram-se apenas como fragmentos esparsos, os quais necessitam de
medidas urgentes de conservao. Em contrapartida, o uso de monoculturas florestais tem
sido intensivo na regio, como a descoberta de uma nova vocao econmica, porm, com
estudos ainda em discusso sobre os possveis impactos desta atividade sobre a regio.
Frente a esta realidade, destaca-se a necessidade de catalogao e conhecimento da
biodiversidade de fungos ectomicorrzicos do Pampa, o que pode ser realizado por meio de
tcnicas clssicas como estudos morfolgicos baseados em microscopia estereoscpica e
tica - e anlises moleculares, as quais so, atualmente, essenciais frente ao grande
desenvolvimento nesta rea, contribuindo de forma significativa para a sistemtica. Desta
forma, pode-se tambm caracterizar espcies que estejam sobre forte presso ambiental e em
risco de extino. Adicionalmente, possvel a aquisio de informaes de grande relevncia
sobre a associao destes organismos com espcies florestais, exticas ou nativas, que
ocorrem de forma natural ou cultivada no Pampa. Esta caracterizao tambm permitir traar
comparativos entre a diversidade de ectomicorrizas em povoamentos florestais de
7

monoculturas (Eucalyptus spp., Pinus spp., e Acacia spp.) em relao a diversidade de


ectomicorrizas em fragmentos florestais nativos.
Outro fator de fundamental importncia a possibilidade de conhecimento destes
novos recursos genticos, possibilitando a prospeco de ectomicorrizas para uso em plantios
florestais, por meio da produo de inculos, contribuindo-se assim uma produo mais
sustentvel. Sabendo-se que estes organismos so especficos quanto a sua atuao
mutualstica, isolar e avaliar a sua especificidade e ao no desenvolvimento de mudas nativas
e exticas por meio do cultivo de tecidos pode contribuir para a descoberta de novos isolados
e/ou espcies realmente compatveis, que contribuiro para o desenvolvimento econmico de
base florestal no pas, sabendo-se da importncia desta atividade. Conforme a Sociedade
Brasileira de Silvicultura (SBS, 2007), o setor florestal possui participao em 3,5% do
Produto Interno Bruto do pas, o que equivale a US$ 37,3 bilhes, gerando 4,33 milhes de
empregos em florestas plantadas e 2,58 milhes de empregos em florestas nativas.

4.1 O Bioma Pampa

De acordo com dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica (IBGE, 2004),


o Bioma Pampa, tambm conhecido como campos sulinos, abrange aproximadamente 176
km2, o que equivale a 64% do territrio gacho e a 2,07% do territrio do Pas. Este bioma
caracteriza-se por seu relevo ondulado contendo suaves elevaes (SUERTEGARAY, 1998),
onde predomina a vegetao formada por campos - compostos principalmente por gramneas
e plantas herbceas e, ocasionalmente, a presena de fragmentos florestais, arbustos e
rvores (CARVALHO; BATELLO, 2009). Atualmente, so criadas na regio em torno de 13
milhes de cabeas de gado e cinco milhes de ovelhas, as quais utilizam a pastagem da
regio (95%) como fonte de forragem.
Embora bastante antropizado, os poucos estudos realizados no Pampa mostram a
existncia de uma biodiversidade bastante significativa. BOLDRINI (1997) estimou a
existncia de aproximadamente trs mil espcies de gramneas, dados que, segundo
OVERBECH et al. (2007) devem estar subestimados. Ademais, o Bioma Pampa serve de
habitat para 385 espcies de pssaros e cerca de 90 espcies de mamferos terrestres
(BILENCA; MIARRO, 2004). Apesar de haver preocupao com relao ao tema da
biodiversidade, o foco das atenes tem se voltado predominantemente para os recursos
animais e vegetais, sendo menor ateno dispensada poro menos evidente, porm no
menos importante, que so os microrganismos do solo. Ao nosso conhecimento, so escassos
8

os trabalhos sobre a biodiversidade de fungos micorrzicos no Bioma Pampa. Estes dados


remetem a necessidade de urgentes discusses e pesquisas, buscando auxiliar na sua
conservao e no seu desenvolvimento econmico.
Face ao exposto, o estudo de ectomicorrizas associadas aos ambientes florestais
exticos e nativos do Bioma Pampa, auxiliar significativamente para o melhor conhecimento
da biodiversidade destes organismos, corroborando com as necessidades de conservao
ambiental. Outrossim, conhecimentos importantes tambm podem ser gerados em termos de
avaliao da variabilidade gentica destes fungos e da utilizao destes recursos na
bioprospeco, tendo em vista seu importante papel na utilizao biotecnolgica.

4.2 Fungos ectomicorrzicos (fECM)

As micorrizas so associaes mutualsticas entre fungos e as razes das plantas


(BRUNDRETT et al., 1996), sendo que estas associaes simbiticas so abundantes,
ocorrendo em 75 a 80% das plantas (SMITH; READ, 1997). Embora as micorrizas
arbusculares e as ectomicorrizas sejam de maior importncia econmica e tambm as mais
conhecidas, Brundrett et al. (1996) relataram sete tipos de associaes micorrzicas
conhecidas: a) micorrizas arbsculo-vesiculares (MAV) tambm chamadas de micorrizas
arbusculares (MA); b) ectomicorrizas (ECM); c) ectendomicorrizas; d) orquidides; e)
ericides; f) monotropides; e g) arbutides.
Os fungos ectomicorrzicos so muito importantes nos ecossistemas, pois sua
associao mutualstica com plantas de diferentes espcies auxilia na absoro de nutrientes,
gua e na proteo da planta hospedeira em relao aos patgenos e estresses abiticos
(SMITH; READ, 1997). Nos ecossistemas florestais, o papel das ectomicorrzas ainda mais
pronunciado, atuando fortemente nos ciclos biogeoqumicos, na dinmica das comunidades
vegetais e na manuteno da estrutura do solo (RILLIG; MUMMEY, 2006; MORRIS et al.,
2009).
Com aproximadamente 5000 espcies envolvidas em associaes simbiticas com
plantas superiores, as ectomicorrizas, alm de proporcionarem benefcios ao desenvolvimento
vegetal, atuam na estabilizao de florestas naturais e cultivadas, servindo como fonte de
alimento e participando da ciclagem de nutrientes em florestas temperadas e tropicais
(TAYLOR, 1991; HOBBIE, 2006).
Os fungos ectomicorrzicos (fECM), embora se associem com um grupo restrito de
plantas (aproximadamente 5% das espcies conhecidas), so encontrados formando simbiose
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com 90% das espcies arbreas de clima temperado, principalmente com as pertencentes s
famlias Pinaceae (95%), Fagaceae (94%), Betulaceae (70%) e Salicaceae (83%)
(OLIVEIRA; GIACHINI, 1999; MOLINA et al., 2005).
H indcios de que estes microrganismos contriburam para a extenso de florestas
para reas ambientalmente degradadas. Segundo Brunner (2001), o estabelecimento de mudas
florestais em solos deficientes em nutrientes ou contaminados pela deposio de certos
poluentes se torna possvel devido simbiose destas plantas com fECM.
Em solos que apresentam limitaes quanto a sua fertilidade, a inoculao de fECM
promove aumento na sobrevivncia das plantas aps o transplante (SILVA et al., 2003;
MELLO et al., 2006).
A maioria, os fungos ectomicorrzicos pertencem classe Basidiomycota, como os
gneros: Amanita, Hebeloma, Hysterangium, Laccaria, Lactarius, Rhizopogon, Russula,
Scleroderma, Suillus, Tricholoma entre outros (VELLINGA et al., 2009). Tm sido
considerada extremamente favorvel a associao destes fungos s espcies florestais
cultivadas como o Pinus spp., Eucalyptus spp. e a Acacia spp. Porm, no h relato no que se
refere s espcies ocorrentes no Bioma Pampa, o qual est inserido em um contexto de
produo silvcola, alm da escassez de conhecimento sobre associaes entre ectomicorrizas
e espcies florestais nativas, onde no so conhecidos, a priori, dados para o bioma em
questo. Conforme citam NARA e HOGETSU (2004), o papel das ectomicorrizas
fundamental na recuperao de reas impactadas ambientalmente, como o caso do Pampa,
que possui a predominncia de solos arenosos, de grande susceptibilidade ao humana.
Ademais, sabendo-se da alta especificidade apresentada por ectomicorrizas, pode-se obter
isolados de interesse para a produo florestal brasileira por meio de testes neste sentido.
Nos campos sulinos, estudos morfolgicos de ectomicorrizas caracterizam resultados
muito importantes no conhecimento da biodiversidade de espcies. Porm, nos dias atuais, o
uso da biologia molecular indispensvel, como pode ser observado nos trabalhos de Gomes
et al. (2002); Tedersoo et al. (2007); Morris et al. (2009), entre outros. Dentre as diversas
ferramentas moleculares disponveis, tem sido consenso o uso daquelas baseadas no
sequenciamento do espao interno transcrito (internal transcribed spacer ITS) do rDNA de
fungos, auxiliando na caracterizao da espcie e na construo de estudos filogenticos.
A regio ITS composta por regies no codificantes localizadas entre regies
altamente conservadas do rDNA responsveis pela codificao da subunidade menor e maior
dos ribossomos (BRIDGE; ARORA, 1998). So de fcil amplificao, possuem natureza
10

multicpia e permitem a diferenciao entre espcies. Alm disso, em estudos de cdigo de


barras (barcode) de fungos, a regio ITS tem sido escolhida como prioritria.

5 OBJETIVOS

5.1 Objetivo geral

Caracterizar a biodiversidade de fungos ectomicorrzicos ocorrentes em povoamentos


de monoculturas florestais e fragmentos de matas nativas do Bioma Pampa por meio de
mtodos morfolgicos e moleculares, bem como obter isolados que viabilizem a produo de
inoculante e estudar a compatibilidade de ectomicorrizas em espcies silviculturais exticas e
nativas por meio da cultura de tecidos, contribuindo para o conhecimento da biodiversidade e
utilizao dos fungos micorrzicos do Bioma Pampa.

5.2 Objetivos especficos

coletar fungos ectomicorrzicos associados a monoculturas florestais cultivadas e


matas nativas do Bioma Pampa;
identificar as espcies de fungos ectomicorrzicos coletadas;
comparar a diversidade de ectomicorrizas presentes em solos com florestas nativas e
solos onde h presena de monocultivos florestais;
determinar a compatibilidade entre isolados de fungos ectomicorrzicos e espcies
florestais exticas e nativas, por meio do cultivo in vitro;
capacitar recursos humanos para o desenvolvimento de pesquisas na rea, abrangendo
o estudo de ectomicorrizas, biologia molecular e cultura de tecidos; treinando
estudantes de graduao, ps-graduao e um profissional em ps-doutoramento.
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6 ATIVIDADES REALIZADAS

6.1 Coletas realizadas no Bioma Pampa e entorno

Com base na abrangncia do bioma Pampa, realizaram-se incurses para os


municpios gachos de Alegrete, Barra do Quarai, Boror, Rosrio do Sul, Dilermano de
Aguiar, So Pedro do Sul, So Borja, Boror, Cacequi, So Gabriel, Santiago, So Sep,
Caapava do Sul, Lavras do Sul, So Vicente do Sul, Itaqui, Maambar, Unistalda, Santa
Margarida do Sul, Bag, Pelotas, Santana da Boa Vista, Santana do Livramento, Dom Pedrito,
Candiota, Hulha Negra, Cerrito, Uruguaiana, Jaguari e Nova Esperana do Sul (Figura 1).
Estes dois ltimos municpios esto em rea de transio e, por esta razo, foram includos,
levando-se em considerao a importncia e a grande biodiversidade, caracterstica de regies
ecotonais. Registros das coletas podem ser observados na Figura 2.

1- Santa Maria
2- Alegrete
3- Barra do Quara
4- Boror
5- Rosrio do Sul
6- Dilermando de Aguiar
7- So Pedro do Sul
8- So Borja
9- Cacequi
10- So Gabriel
11- Santiago
12- So Sep
13- Caapava do Sul
14- Lavras do Sul
15- So Vicente do Sul
16- Itaqui
17- Maambar
18- Unistalda
19- Santa Margarida do Sul
20- Bag
21- Pelotas
22- Santana da Boa Vista
23- Candiota
24- Hulha Negra
25- Uruguaiana
26- Cerrito
27- Jaguar
28- Nova Esperana do Sul
29- Santana do Livramento
30- Dom Pedrito
Figura 1. Municpios amostrados no Bioma Pampa do Rio Grande do Sul.
12

Figura 2. Viagens prospectivas realizadas pelo grupo de pesquisas onde foram realizadas
coletas nas reas do Bioma Pampa (A), em diferentes ecossistemas (B), coletando-se diversos
gneros de fungos ectomicorrzicos (C e D).

6.2 Anlises morfolgicas

Para coletar os fECMs, realizaram-se incurses tanto em reas de fragmentos florestais


nativos (de forma geral compostos por capes) como em reas com povoamentos de
monoculturas florestais. Antecedendo a retirada dos basidiomas de seu local de origem, os
espcimes foram fotografados e realizou-se o registro de dados como: data, local de coleta,
coordenadas geogrficas, coletor e caracterstica das estruruturas reprodutivas (colorao,
consistncia, insero no solo, forma e mensuraes). Os fungos foram removidos
cuidadosamente, sendo preservadas uma poro do solo onde estavam inseridos e a vegetao
circundante. O material foi numerado e acondicionado em sacos de papel para o transporte at
o Laboratrio de Biologia do Solo e do Ambiente, do Departamento de Solos da Universidade
Federal de Santa Maria, onde, posteriormente, foi identificado (Tabela 1, Figura 3).
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Figura 3. Fungos ectomicorrzicos Lactarius deliciosus (A), Russula sp. (B), Suillus luteus (C),
Russula sp. (D), Suillus sp. (E), Scleroderma sp. (F) e gneros de fungos no identificados (G e H)
coletados em fragmentos de Pinus elliotti em municpios do Rio Grande do Sul localizados no Bioma
Pampa.

Na maior parte das coletas realizadas em matas nativas no foram encontrados


exemplares de fungos ectomicorrzicos. Assim, optou-se por incluir a coleta de amostras de
solo contendo razes de espcies arbreas dos fragmentos florestais visitados. O objetivo
destas coletas foi observar a presena de associaes micorrzicas nas razes das rvores, a
qual se evidencia pela presena de morfotipos caractersticos.
Amostras do solo de aproximadamente 50 cm3 foram retiradas e armazenadas em
sacos plsticos com acrscimo de gua destilada, objetivando-se manter a umidade por 24 h.
Posteriormente, o material foi peneirado deixando-se apenas as razes presentes. Com o
auxlio de microscpio estereoscpico, procurou-se evidenciar a presena de morfotipos, bem
como de manto fngico nas razes.
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No laboratrio, as razes presentes no solo coletado juntamente com os fungos foram


peneiradas e passaram por uma sequncia de lavagens. Em seguida, receberam um nmero de
identificao e foram mantidas em soluo de etanol a 70%. Posteriormente, procuraram-se
evidncias da ocorrncia de associaes das razes com hifas dos fungos coletados, utilizando-
se, para esta finalidade, microscpios estereoscpico e ptico (Figura 4).
J para os basidiomas coletados, parte do material foi desidratada em estufa,
mantendo-se os mesmos a 50 C at atingirem massa constante (entre dois e sete dias,
dependendo do tamanho do fungo). Posteriormente, foram mantidos em sacos de papel e
caixas de papelo cuidadosamente armazenadas para manter o acervo herborizado. A
descrio dos basidiomas seguiu as metodologias usuais em micologia como, por exemplo, as
chaves de classificao e guias especficos para grupos de fungos.
As anlises macroscpicas foram efetuadas a olho desarmado, bem como com o
auxlio de microscpio estereoscpico e equipamentos de mensurao como rguas e
paqumetros. Tambm foi utilizada a visualizao de estruturas menores, como esporos e
hifas, em microscpio ptico, dispondo-se os cortes entre lmina e lamnula, contendo
soluo de azul de metileno a 1%.
Para o isolamento, seguiu-se a metodologia proposta por Brundrett et al. (1996) onde,
aps desinfestao superficial dos basidiomas em etanol a 70%, estes foram partidos ao meio
retirando-se, com o auxlio de pinas e ala de platina, parte do interior do contexto, a qual foi
inoculada em meio de cultura MNM modificado (MARX, 1969). Todo este procedimento
ocorreu em cmara de fluxo laminar assptico. Aps, este material foi mantido para
crescimento em estufas com temperatura controlada de 25 C e com repicagens peridicas de
acordo com o crescimento micelial (Figura 5).
Durante as diversas incurses realizadas em povoamentos florestais do bioma Pampa
foi possvel coletar 86 espcimes de fungos ectomicorrzicos. Apesar da dificuldade inicial de
encontrar as estruturas reprodutivas desses fungos devido escassez hdrica na regio do
Pampa entre novembro de 2010 e maro de 2012, durante os meses de abril e julho de 2012
vrios basidiomas foram coletados. Nas viagens realizadas nos meses mais secos foi
encontrado pouco ou nenhum material.
Dos 85 fungos coletados, 65 foram identificados ao menos em nvel de gnero baseado
em caractersticas morfolgicas macroscpicas, e dentre estes 15 j foram identificados em
nvel de espcie com mtodos de biologia molecular. No entanto ainda no foi possvel
identificar 20 fungos, nem em nvel de gnero, e estes aguardam para ser identificados por
mtodos moleculares (Tabela1).
15

A maioria do material foi encontrada em povoamentos florestais exticos (93%), como


eucalipto, pinus e accia (Tabela 1). Somente 7% do material foi coletado em mata nativa. O
fato de no ter sido encontrados fungos ectomicorrzicos nestes locais no significa que estes
organismos no esto presentes neste local. Eles podem produzir seus corpos de frutificao
em outros perodos do ano, ou ainda, a cada 2, 3,.. 7 anos, por exemplo.
De todo material coletado somente 17 espcimes foram isolados e capazes de se
desenvolver em meio de cultura. Esse resultado j era esperado, pois segundo a literatura
muitos desses gneros no so capazes de serem cultivados em condies artificiais.

Figura 4. Morfotipos coletados em fragmentos de mata nativa em diversos municpios do Bioma


Pampa do Rio Grande do Sul.
Tabela 1. Isolados ectomicorrzicos coletados em municpios do Rio Grande do Sul pertencentes ao Bioma Pampa.

CI1 Municpio Coordenadas geogrficas Material coletado Local da coleta EF3


PM 01 Barra do Quara 30 08 27,3S 57 22 42,3 W Scleroderma sp Mata de eucalipto Ex
PM 02 Barra do Quara 30 0827,3 S 57 22 42,3 W Scleroderma sp Mata de eucalipto Ex
PM 04 So Borja 28 41 31 S 55 54 09,3 W Pisolithus arhizus Mata de eucalipto Ex
PM 05 Boror 28 55 22,2 S 56 06 42,0 W Scleroderma sp Mata de eucalipto Ex
PM 06 Boror 28 55 22,2 S 56 06 42,0 W Scleroderma sp Mata de eucalipto Ex
PM 07 Boror 28 55 22,2 S 56 06 42,0 W Descomyces sp Mata de eucalipto Ex
PM 08 Boror 28 55 22,2 S 56 06 42,0 W Descomyces sp Mata de eucalipto Ex
PM 09 Boror 28 55 22,2 S 56 06 42,0 W Scleroderma sp Mata de eucalipto Ex
PM 10 Boror 28 55 22,2 S 56 06 42,0 W Setchelliogaster ef. tenuipes Mata de eucalipto Ex
PM 11 Boror 28 55 22,2 S 56 06 42,0 W Laccaria fraterna Mata de eucalipto Ex
PM 12 Boror 28 55 22,2 S 56 06 42,0 W Scleroderma sp Mata de eucalipto Ex
PM 13 Boror 28 55 22,2 S 56 06 42,0 W Scleroderma sp Mata de eucalipto Ex
PM 14 Jaguari 29 22 44,7 S 54 44 49,4W Scleroderma citrinun Camboim Nt
PM 15 Caapava do Sul 30 54 37,96 S 53 25 22,7W NI2 Mata de eucalipto Ex
PM 16 Caapava do Sul 30 54 37,96 S 53 25 22,7W NI2 Mata de eucalipto Ex
PM 17 Caapava do Sul 30 54 37,96 S 53 25 22,7W NI2 Mata de eucalipto Ex
PM 18 Dilermando de Aguiar 29 46 23,1 S 54 05 43,1 W Cortinarius sp Mata nativa mista Nt
PM 19 Rosrio do Sul 30 08 34 S 54 50 5,3W Scleroderma sp Mata de eucalipto Ex
PM 20 Santiago 29 10 17,8 S 54 53 58,8 W NI2 Mata de eucalipto Ex
PM 21 Nova Esperana do Sul 29 15 47,1 S 54 49 50 W Gyrodon rompelli Mata nativa mista Nt
PM 22 Nova Esperana do Sul 29 15 47,1 S 54 49 50 W Telephoraceae Mata nativa mista Nt
PM 23 Jaguari 29 28 13 S 54 42 13,6W Scleroderma citrinun Camboim Nt
PM 24 Jaguari 29 28 13 S 54 42 13,6W Geastrum sp Camboim Nt
PM 25 Santiago 29 08 45,7 S 54 53 10,9W Lactarius deliciosus Mata de eucalipto Ex
PM 26 Caapava do Sul 30 30 12,8 S 53 25,5 95W Russula sp. Mata de pinus Ex
PM 27 Caapava do Sul 30 15 51,6 S 53 31 19,5W Suillus luteus Mata de pinus Ex
PM 28 So Sep 30 12 43 S 53 30 52,1W Suillus cf luteus Mata de pinus Ex
PM 29 So Sep 30 12 43 S 53 30 52,1W Russula sp. Mata de pinus Ex
17

Tabela 1. Continuao...

CI1 Municpio Coordenadas Material coletado Local da coleta EF3


PM 30 So Sep 30 05 41,7 S 53 37 30,1W Scleroderma sp. Mata de eucalipto Ex
PM 31 So Gabriel 30 25 57,8 S 54 22 05,3W Suillus sp Mata de pinus Ex
PM 32 So Gabriel 30 25 57,8 S 54 22 05,3W Lactarius deliciosus Mata de pinus Ex
PM 33 So Gabriel 30 25 57,8 S 54 22 05,3W NI2 Mata de pinus Ex
PM 34 So Gabriel 30 25 57,8 S 54 22 05,3W ordem Boletales (NI2) Mata de pinus Ex
PM 35 So Gabriel 30 25 57,8 S 54 22 05,3W NI2 Mata de pinus Ex
PM 36 Dilermando de Aguiar 30 12 10,2 S 54 43 31,8W Vascelum hyalinum Mata de accia negra Ex
PM37 Rio Grande 32 32 0,5 S 52 31 43,4W Rhizopogum sp. Pinus taeda Ex
PM38 Rio Grande 32 36 23,5 S 52 29 29,8W NI2 Mata de eucalipto Ex
PM39 Caapava do Sul 30 45 50,9 S 53 32 42,9W Pisolithus sp. Mata de eucalipto Ex
PM40 Caapava do Sul 30 45 50,9 S 53 32 42,9W Pisolithus sp. Mata de eucalipto Ex
PM41 Caapava do Sul 30 45 50,9 S 53 32 42,9W Ramaria sp. Mata de eucalipto Ex
PM42 Caapava do Sul 30 45 50,9 S 53 32 42,9W NI2 Mata de eucalipto Ex
PM43 Caapava do Sul 30 45 50,9 S 53 32 42,9W Pisolithus sp. Mata de eucalipto Ex
PM44 Caapava do Sul 30 45 50,9 S 53 32 42,9W NI2 Mata de eucalipto Ex
PM45 Bag 31 12 34,1 S 53 51 46,9W Scleroderma sp. Mata de eucalipto Ex
PM46 Bag 31 15 42,4 S 54 08 29,9W Scleroderma sp. Mata de eucalipto Ex
PM47 Bag 31 15 54,7 S 54 08 15,9W NI2 Mata de eucalipto Ex
PM48 Hulha Negra 31 25 22,7 S 53 53 04,0W Ramaria sp. Mata de eucalipto Ex
PM49 Hulha Negra 31 25 22,7 S 53 53 04,0W Ramaria sp. Mata de eucalipto Ex
PM50 Hulha Negra 31 25 22,7 S 53 53 04,0W NI2 Mata de eucalipto Ex
PM51 Hulha Negra 31 25 22,7 S 53 53 04,0W NI2 Mata de eucalipto Ex
PM52 Bag 31 16 48,7 S 53 54 39,4W Pisolithus sp. Mata de accia negra Ex
PM53 Bag 31 16 48,7 S 53 54 39,4W NI2 Mata de accia negra Ex
PM55 Rosrio do Sul 30 19 52,7 S 55 00 14,5W NI2 Mata de eucalipto Ex
PM56 Rosrio do Sul 30 19 52,7 S 55 00 14,5W NI2 Mata de eucalipto Ex
PM57 Rosrio do Sul 30 19 52,7 S 55 00 14,5W Pisolithus sp. Mata de eucalipto Ex
PM59 Rosrio do Sul 30 23 17,2 S 55 02 22,5W NI2 Mata de eucalipto Ex
18

Tabela 1. Continuao..

CI1 Municpio Coordenadas Material coletado Local da coleta EF3


PM60 Santana do Livramento 30 51 04,6 S 54 58 58,5W Scleroderma sp. Mata de eucalipto Ex
PM61 Santana do Livramento 30 51 04,6 S 54 58 58,5W Scleroderma sp. Mata de eucalipto Ex
PM62 Santana do Livramento 30 51 04,6 S 54 58 58,5W Pisolithus sp. Mata de eucalipto Ex
2
PM63 Santana do Livramento 30 50 44,6 S 55 27 29,1W NI Mata de eucalipto Ex
PM64 Santana do Livramento 30 50 44,6 S 55 27 29,1W Pisolithus sp. Mata de eucalipto Ex
2
PM65 Santana do Livramento 30 50 44,6 S 55 27 29,1W NI Mata de eucalipto Ex
2
PM66 Santana do Livramento 30 50 44,6 S 55 27 29,1W NI Mata de eucalipto Ex
PM67 Santana do Livramento 30 50 44,6 S 55 27 29,1W Ramaria flavo brunessis (cf) Mata de eucalipto Ex
2
PM68 Santana do Livramento 30 50 44,6 S 55 27 29,1W NI Mata de eucalipto Ex
PM69 Santana do Livramento 30 50 44,6 S 55 27 29,1W NI2 Mata de eucalipto Ex
PM70 Santana do Livramento 30 50 44,6 S 55 27 29,1W Pisolithus arhizus Mata de eucalipto Ex
PM71 Santana do Livramento 30 50 44,6 S 55 27 29,1W Amanita pruitii Mata de eucalipto Ex
PM72 Candiota 31 34 36,1 S 53 43 54,3W Pisolithus sp. Mata de Accia negra Ex
PM73 Candiota 31 34 36,1 S 53 43 54,3W Scleroderma sp. Mata de Accia negra Ex
PM74 Candiota 31 34 36,1 S 53 43 54,3W Scleroderma sp. Eucalipto e Accia negra Ex
PM75 Candiota 31 34 36,1 S 53 43 54,3W Pisolithus sp. Mata de eucalipto Ex
PM76 Candiota 31 33 50,1 S 54 40 30,9W Hysterangium Mata de eucalipto Ex
2
PM77 Candiota 31 33 50,1 S 54 40 30,9W NI Mata de eucalipto Ex
PM78 Hulha negra 31 25 0,7 S 53 43 47,6W Ramaria sp. Mata de eucalipto Ex
PM79 Hulha negra 31 25 0,7 S 53 43 47,6W Pisolithus sp. Mata de eucalipto Ex
PM80 Hulha negra 31 25 0,7 S 53 43 47,6W Scleroderma sp. Mata de eucalipto Ex
PM82 Candiota 31 33 50,1 S 54 40 30,9W Descomyces sp. Mato de eucalipto Ex
PM83 Candiota 31 33 50,1 S 54 40 30,9W Scleroderma sp. Mato de eucalipto Ex
PM84 Cerrito 31 48 25,9 S 52 49 58,5W Scleroderma sp. Mato de eucalipto Ex
PM85 Cerrito 31 48 25,9 S 52 49 58,5W Scleroderma sp. Mato de eucalipto Ex
1
Cdigo de identificao; 2 NI (no 3 4
identificado); EF (espcie florestal), Ex (Extica), Nt (nativa); Plantao sobre rejeito de minerao de
carvo.
Figura 5. Diferentes isolados do fungo ectomicorrzico Pisolithus spp., coletados em diversos
municpios do Bioma Pampa do Rio Grande do Sul.

6.3 Anlises moleculares

Durante as viagens prospectivas, parte das estruturas reprodutivas (basidiomas)


coletadas foi mantida em tubos de precipitao para microcentrfuga contendo 1 mL do
detergente catinico CTAB (cloreto de cetiltrimetilamnio) a 2%. Posteriormente, este
material foi congelado, sendo mantido a 20C. Parte do material tambm foi armazenada em
tubos de precipitao para microcentrfuga contendo slica gel, o que confere uma forma
alternativa de armazenagem. O material em slica gel permaneceu em temperatura ambiente
(aproximadamente 25C). Todo o material foi armazenado em, no mnimo, duas replicatas. J
para os morfotipos coletados (aps anlise das razes presentes no solo), utilizou-se o
armazenamento em tubos de precipitao para microcentrfuga contendo gua ultrapura. Este
material foi congelado e mantido em freezer a 20C. As extraes de DNA dos basidiomas,
bem como a amplificao via PCR da regio ITS do rDNA j foram efetuadas. As extraes
dos morfotipos esto em andamento, procurando-se fazer adequaes aos protocolos.
Para a extrao de DNA genmico utilizou-se o kit de extrao DNeasy Plant Mini
Kit (Qiagen), seguindo-se as instrues de uso do fabricante. O tecido fngico foi retirado do
CTAB e seccionado em pores de aproximadamente 20 mg. A reao em cadeia da
polimerase (PCR) seguiu o protocolo descrito por Lupatini et al. (2008) com modificaes. A
reao foi realizada em um volume total de 25 L, tendo como componentes: 10 ng de DNA
template, 25 pmoles de cada oligonucleotdeo iniciador (ITS 1 e ITS 4), 10 mM de Tris-HCl
(pH 8,3), 50 mM do tampo de reao, 2 mM de MgCl2, 2,5 M de cada um dos dNTPs
(dGTP, dCTP, dATP, dTTP) e 1 unidade de Taq DNA polimerase (Invitrogen). Para a
amplificao da regio do espao interno transcrito (ITS) do rDNA foram empregados os
oligonucleotdeos iniciadores ITS 1 (5 TTC CGT AGG TGA ACC TGC GG 3) e ITS 4 (5
TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3) descritos por WHITE et al. (1990). As reaes de
20

amplificao foram efetuadas por meio de uma desnaturao inicial a 94 C por 2 minutos,
seguida por 35 ciclos que consistiram de: desnaturao a 94 C por 1 minuto, anelamento a
55 C por 1 minuto, e extenso a 72 C por 1 minuto e 30 segundos. Por fim, realizou-se uma
extenso final a 72 C por 10 minutos.
Posteriormente amplificao, realizou-se a eletroforese dos produtos de PCR em gel
de agarose a 1,5%. A eletroforese foi conduzida em cuba horizontal contendo o gel submerso
em tampo TBE 1X (90 mM Tris-borato, 2 mM EDTA, pH 8,0). Para corar as bandas de
DNA e visualiz-las em transluminador, foi realizada a adio de 10 mg mL-1 de brometo de
etdeo, sendo o registro fotogrfico efetuado com o uso do aparato Cnon Snot S2IS.
Para purificao dos produtos de PCR utilizou-se protocolo baseado no uso de PEG
8000 a 13% descrito por DUNN e BLATTNER (1987). Adicionou-se um volume de soluo
de PEG 8000 (PEG a 13%, NaCl a 1,6M) homogeneizando-se cuidadosamente com o auxlio
de micropipeta. Este material permaneceu nesta condio overnight. Posteriormente, o
material foi centrifugado por 15 minutos a 13.000 rpm. Descartou-se a soluo de PEG e o
material passou por uma etapa de limpeza com a adio de 200 L de etanol a 70%, seguido
de uma centrifugao por 10 minutos a 13.000 rpm. O procedimento de limpeza foi repetido
por trs vezes. Por fim, os pellets foram secos temperatura ambiente com posterior eluio
em 8 L de gua ultrapura, conforme prope SAMBROOK et al. (1989).
O material foi enviado para sequenciamento onde foram utlizados os
oligonucleotdeos iniciadores ITS 1 e ITS 4. O sequenciamento foi realizado no sequenciador
Mega BACE 5000 (Amersham Bioscience), seguindo-se o protocolo fornecido pelo
fabricante. Com as sequncias analisadas obteve-se a sequncia concenso, com auxlio do
programa STADEN (STADEN et al. 1992-2000), assim como o alinhamento de sequncias
por meio do algoritmo ClustalW. As sequncias do GenBank foram escolhidas utilizando-se o
Algoritmo Megablast, disponvel na plataforma BLAST do NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e as anlises filogenticas foram realizadas com auxlio do
programa MEGA (TAMURA et al., 2006). O andamento das anlises moleculares dos
isolados est apresentado no quadro 1.
Na figura 6 apresentado o gel obtido aps a eletrofores do produto da PCR realizada
com os primers da regio ITS. Durante a realizao das anlises foi decidido incluir tambm
um par de primers para amplificar a regio 18S e posteriormente sequenci-la, uma vez que
esse dado auxilia na identificao dos fungos.
21

Figura 6. Eletrofores dos produtos de PCR obtidos a partir do uso de primers que flanqueiam a
regio ITS do rDNA. A primeira coluna evidencia o padro 100 pb, onde foram destacados os
fragmentos de 850 e 650 pb. Observam-se as bandas formadas a partir da amplificao dos fungos
onde as letras PM, seguida de diferentes nmeros, representa o registro de coleta e C- o controle
negativo.

De maneira geral foi possvel amplificar a regio ITS da maioria dos fungos coletados.
Parte das sequencias j foi analisada e os resultados esto apresentados na tabela 2.
importante salientar que apenas uma frao dos resultados esto apresentados neste
relalatrio, j que muitas sequencias ainda esto sendo analisadas.

Tabela 2. Espcies de fungos ectomicorrzicos com a identificao baseada na sequencia ITS.


Amostra Espcie mais prxima N acesso* Similaridade
PM01 Scleroderma bovista HM237175 99%
PM02 Scleroderma bovista HM237175 99%
PM05 Scleroderma bovista HM237175 99%
PM10 Setchelliogaster tenuipes AF325624 99%
PM12 Scleroderma bovista HM237175 99%
PM13 Scleroderma aurantium HM237174 99%
PM14 Scleroderma bovista HM237175 99%
PM42 Scleroderma aurantium HM237174 99%
PM46 Scleroderma bovista HM237175 99%
PM55 Scleroderma bovista HM237175 99%
PM71 Amanita sp prutitii HQ625011 99%
PM72 Pisolithus tinctorius AF374700 99%
PM73 Scleroderma polyrhizum EU718123 100%
PM74 Scleroderma polyrhizum EU718123 100%
PM84 Scleroderma bovista HM237175 99%
*N de acesso no GenBank da espcie com maior similiaridade com a amostra.
22

Quadro 1. Andamento das anlises moleculares realizadas nos isolados ectomicorrzicos coletados.
Extrao Extrao PCR Purificao Sequenciamento
CI1
DNA MF2 DNA MC2 18S ITS 18S ITS 18S ITS
PM 01
PM 02
PM 03
PM 04
PM 05
PM 06
PM 07
PM 08
PM 09
PM 10
PM 11
PM 12
PM 13
PM 14
PM 15
PM 16
PM 17
PM 18
PM 19
PM 20
PM 21
PM 22
PM 23
PM 24
PM 25
PM 26
PM 27
PM 28
PM 29
PM 30
PM 31
PM 32
PM 33
PM 34
PM 35
PM 36
PM 37
Lacunas sombreadas indicam tarefas j realizadas;
1
Cdigo de identificao;
2
Miclio fresco;
3
Meio de cultura.
23

Quadro 1. Continuao ...


PM 38
PM 39
239
PM 40
30
PM 41
PM 42
PM 43
PM 44
PM 45
PM 46
PM 47
PM 48
PM 49
239
PM 50
30
PM 51
PM 52
PM 53
PM 54
PM 55
PM 56
PM 57
PM 58
PM 59
239
PM 60
30
PM 61
PM 62
PM 63
PM 64
PM 65
PM 66
PM 67
PM 68
PM 69
239
PM 70
30
PM 71
PM 72
PM 73
PM 74
PM 75
PM 76
PM 77
PM 78
PM 79
239
Lacunas sombreadas indicam tarefas j realizadas;
1
Cdigo de identificao;
2
Miclio fresco;
3
Meio de cultura.
24

Quadro 1. Continuao ...


PM 80
30
PM 81
PM 82
PM 83
PM 84
PM 85
PM 86
Lacunas sombreadas indicam tarefas j realizadas;
1
Cdigo de identificao;
2
Miclio fresco;
3
Meio de cultura.

6.5 Anlises de compatibilidade in vitro

As espcies nativas que esto sendo estudadas so: angico-vermelho (Parapiptadenia


rgida (Benth) Brenan), canafstula (Peltophorum dubium (Spreng.) Taub.), grpia (Apuleia
Ieiocarpa (Vogel) J.F. Macbr.), timbava (Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong) e
sibipiruna (Caesalpinia peltophoroides (Benth)). As sementes foram doadas pelo Centro de
Pesquisa de Recursos Florestais (FEPAGRO FLORESTA), Santa Maria-RS.
Os isolados fngicos obtidos neste trabalho foram cultivados em placa de Petri, em
incubadora microbiolgica a 28 C, em meio de cultura slido MNM - Merlin Norkrans
Modificado (MARX, 1969) durante 20 dias, sendo posteriormente repicados para erlenmeyer
de 250 mL, contendo 60 mL do meio de cultura MNM slido.
As sementes utilizadas foram esterilizadas pela imerso em hipoclorito de sdio 10%
por 30 minutos e lavadas em gua esterilizada, por trs vezes consecutivas. Posteriormente, as
sementes foram novamente esterilizadas, em lcool a 70 % por mais 30 minutos. As sementes
de canafstula foram esterilizadas com hipoclorito de sdio 10% por 20 minutos e lavadas em
gua esterilizada, por trs vezes consecutivas. Posteriormente, as sementes foram
desinfetadas, em lcool 70% por 20 minutos. Aps a esterilizao em lcool 70%, as sementes
foram lavadas novamente, em gua esterilizada, por trs vezes.
Para a germinao, as sementes previamente esterilizadas foram colocadas em placa
de Petri em meio de germinao esterilizado em autoclave. O meio de germinao continha
500 M de CaSO4.2H2O, 3M de H3BO3, 7,5g de gar e 2g de glicose por litro de gua, com o
pH ajustado para 5,7. Em seguida, as placas de Petri foram incubadas a 25 C por 7 dias.
Quando as sementes germinaram e atingiram a fase de plntula, foram transferidas para os
erlenmeyers com capacidade de 250 mL, com 60 mL de meio MNM slido. Aps a
25

solidificao do meio, o frasco foi fechado com papel alumnio e plstico de PVC
transparente, para esterilizao em autoclave a 1 atm., durante 20 minutos. Aps a
autoclavagem, os erlenmeyers estavam prontos para a inoculao das plntulas com os fungos
ectomicorrzicos.
Trs discos de 10 mm de dimetro foram transferidos para os erlenmeyer de 250mL
contendo o meio MNM slido. Esses erlenmeyer foram incubados em estufa a 28 C, durante
30 dias para o crescimento do miclio fngico. Aps a preparao das sementes, duas
sementes pr-germinadas foram adicionadas em cada erlenmeyer. Os erlenmeyers foram
mantidos em incubadora com fotoperodo de 12 horas a 241 C, por perodo de 35 dias.
Durante a conduo do experimento, realizou-se rodzio dos erlenmeyers, duas vezes
por semana, atendendo s exigncias do delineamento experimental, cujo objetivo foi eliminar
possveis diferenas quanto incidncia de luz, temperatura e sombreamento. O delineamento
experimental utilizado foi o inteiramente casualizado.
Ao trmino do experimento, as plntulas das cinco espcies foram avaliadas quanto
formao de associao micorrzica com os isolados avaliados.
Nesta fase do trabalho, houve contratempos devido constante adaptao de
metodologias para conduo dos ensaios, em funo de contaminaes oriundas da incubao
das sementes florestais. De todas as espcies florestais avaliadas neste trabalho, observou-se
apenas associao ectomicorrzica in vitro da grpia (Apuleia Ieiocarpa) e da canafstula
(Peltophorum dubium) com o fungo Suillus luteus, e da espcie sibipiruna (Caesalpinia
peltophoroides) com o fungo Pisolithus sp. Nestas espcies, aps o perodo de incubao,
observou-se a presena de rede de Hartig, o que evidencia a associao ectomicorrzica
(Figura 7).

Figura 7. Cortes transversais de razes de mudas de sibipiruna (Caesalpinia peltophoroides)


inoculadas com o fECM Pisolithus sp. Aumento de 200x.
7 ATIVIDADES PREVISTAS X ATIVIDADES DESENVOLVIDAS
Quadro 2. Cronograma de atividades previstas e desenvolvidas. As atividades previstas encontram-se marcadas em preto e as j executadas
marcadas em azul.
2010 2011 2012
ATIVIDADES
N D J F M A M J J A S O N D J F M A M J J A S O
Reviso de literatura X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Coletas X X X X X X X X X X X X
X X X X X X X X X X X X
Identificao e acondicionamento do material X X X X X X X X X X X X
X X X X X X X X X X X X
Caracterizao morfolgica X X X X X X X X
X X X X X
Extrao de DNA X X X X X X
X X X X X
Amplificao via PCR X X X X
X X X
Sequenciamento X X X X
X X X
Isolamento de inculos X X X X X X X X X X X
X X X X X X X X
Anlise de resultados parciais X X X X X X X X X X
X X X X X X X X
Anlises de compatibilidade in vitro X X X X X X X X X X X X
X X X X X
Elaborao de artigos cientficos X X X X X X X X X X X X
X X X
Elaborao do relatrio final X X X X X X
X X X
8 PUBLICAES

Artigos publicados

STEFFEN, G. P. K.; STEFFEN, R. B.; ANTONIOLLI, Z. I. Contaminao do solo e da gua


pelo uso de agrotxicos. Tecno-lgica, Santa Cruz, v.15, n. 1, p. 15-21, 2011.

STEFFEN, G. P. K.; ANTONIOLLI, Z. I.; STEFFEN, R. B.; SCHIEDECK, G. Utilizao de


vermicomposto como substrato na produo de mudas de Eucalyptus grandis e Corymbia
citriodora. Pesquisa Florestal Brasileira, v. 31, n. 66, p. 75-82, 2011.

STEFFEN, R. B.; STEFFEN, G. P. K.; ANTONIOLLI, Z. I.; JACQUES, R. J. S. Ao do


leo essencial de eucalipto na micorrizao e no estabelecimento de Eucalyptus grandis em
solo contaminado por cobre. Pesquisa Florestal Brasileira, v. 31, n. 67, p. 245-255, 2011

STEFFEN, R. B.; STEFFEN, G. P. K.; ANTONIOLLI, Z. I.; JACQUES, R. J. S.; SANTOS,


M. L. dos. Efeito do leo essencial de Eucalyptus grandis no crescimento de isolados de
fungos ectomicorrzicos em diferentes concentraes de cobre, zinco e nquel. Pesquisa
Florestal Brasileira, v. 31, n. 67, p. 227-234, 2011.

STEFFEN, R. B.; STEFFEN, G. P. K.; ANTONIOLLI, Z. I.; JACQUES, R. J. S. Influncia


do leo essencial na micorrizao e no crescimento de mudas de eucalipto. Pesquisa
Florestal Brasileira, v. 31, n. 67, p. 235-243, 2011.

STEFFEN, R. B.; STEFFEN, G. P. K.; ANTONIOLLI, Z. I.; SILVA, R. F. da. leo essencial
de Eucalyptus grandis Hill em Maiden no estmulo micorrizao de mudas de sibipiruna
(Caesalpinia peltophoroides Benth.). Cincia Florestal, v. 22, n. 1, p. 69-78, 2012.

SILVA, R. F.; SAIDELLES, F. L. F.; KEMERICH, P. D. C.; STEFFEN, R. B.;


SWAROWSKY, A.; SILVA, A. S. Crescimento e qualidade de mudas de Timb e Dedaleiro
cultivadas em solo contaminado por cobre. Revista Brasileira de Engenharia Agrcola e
Ambiental, v.16, n.8, p.881886, 2012.

Artigos aceitos para publicao

SILVA, R. F.; BERTOLLO, G. M.; CORASSA, G. M.; COCCO, L. B.; STEFFEN, R. B.


Influncia de doses de dejetos de sunos na fauna do solo em sistema plantio direto e cultivo
mnimo. Cincia Florestal, 2012.

STEFFEN, R. B.; STEFFEN, G. P. K.; ANTONIOLLI, Z. I.; JACQUES, R. J. S.; SANTOS,


M. L.; BOGUSZ JUNIOR, S.; GODOY, H. T. leo essencial de eucalipto como
bioestimulador do crescimento de fungos ectomicorrzicos in vitro. Cincia Florestal, 2012.
28

9 REFERNCIAS

BILENCA, D.; MIARRO, F. Identificacin de reas valiosas de pastizal en las Pampas y


Campos de Argentina, Uruguay y Sur de Brasil. Fundacin Vida Silvestre, 2004.

BOLDRINI, I. I. Campos no Rio Grande do Sul. Fisionomia e problemtica ocupacional.


Boletim do Instituto Central de Biocincias, v. 56, 1997. p. 1-39.

BRIDGE, P.D.; ARORA, D.K. Interpretation of PCR methods for species definition. In:
BRIDGE, P.D.; ARORA, D.K.; REDDY, C.A.; ELANDER, R.P. Applications of PCR in
mycology. CAB International: New York, 1998. p.63-84.

BRUNDRETT, M. et al. Working with mycorrhizas in forestry and agriculture. Canberra,


ACIAR, Monograph 32. 373p.

BRUNNER, I. Ectomycorrhizas: their role in forest ecosystems under the impact of acidifying
pollutants. Perspectives in Plant Ecology, Evolution and Systematics, Zrich, v. 4, n. 1, p.
13-27, 2001.

CARVALHO, P. C. F.; BATELLO, C. Access to land, livestock production and ecosystem


conservation in the Brazilian Campos biome: The natural grasslands dilemma. Livestock
Science, v. 120, p. 158-162, 2009.

DUNN, I.S.; BLATTNER, F.R. Charon-36 to charon-40 multi enzyme, high-capacity,


recombination deficient replacemet vectors with polylinkers and polystuffers. Nucleic Acids
Research, n. 15, p. 2677-2698, 1987.

GOMES, E.A. et al. Polymorphism in the internal transcribed spacer (ITS) of the ribosomal
DNA of 26 isolates of ectomycorrhizal fungi. Genetics and molecular biology, v.25, n.4,
2002. p. 477-483.

HOBBIE, E. A. Carbon allocation to ectomycorrhizal fungi correlates with belowground


allocation in culture studies. Ecology, Davis, v. 87, n. 3, p. 563-569, 2006.

IBGE - Instituto brasileiro de geografia e estatstica. Mapa dos biomas brasileiros. Acesso
on line em 22 de maro de 2010. Disponvel em:
<http://www.ibge.gov.br/home/presidencia/noticias/21052004biomas.shtm>.

LUPATINI, M.; et al. Mycorrhizal morphotyping and molecular characterization of


Chondrogaster angustisporus Giachini, Castellano, Trappe & Oliveira, na ectomycorrhizal
fungus from Eucalyptus. Mycorrhiza, n. 18, p. 437 442, 2008.

MARX, D. H. The influence of ectotrophic mycorrhizal fungi on the resistance of pine roots
to pathogenic fungi and soil bacteria. I. Antagonism of mycorrhizal fungi to root pathogenic
fungi and soil bacteria. Phytopathology, St. Paul, 59: 153-163, 1969.

MELLO, A. H. de et al. Fungos arbusculares e ectomicorrzicos em reas de eucalipto e de


campo nativo em solo arenoso. Cincia Florestal, Santa Maria, v. 16, n. 3, p. 293-301, 2006.
29

MOLINA, M. L.; LEDESMA, L. M.; MEDINA, M. S. Importncia del manejo de hongos


micorrizgenos en el establecimiento de rboles en sistemas silvopastoriles. Revista
Colombiana de Cincias Pecurias, Medelln, v. 18, n. 2, p. 162-175, 2005.

MORRIS, M. H. et al. Influence of host species on ectomycorrhizal communities associated


with two co-occuring oaks (Quercus spp.) in a tropical cloud forest. FEMS Microbiology
ecology, v. 69, n.2, 2009. p. 274-287

NARA, K.; HOGETSU, T. Ectomycorrhizal fungi on established shrubs facilitate subsequent


seedling establishment of successional plant species. Ecology, v. 85, n.6, 2004. p. 1700-1707.

OLIVEIRA, V. L.; GIACHINI, A. J. Ecologia e aplicao de ectomicorrizas. In: SIQUEIRA,


J. O. et al. Inter-relao fertilidade, biologia do solo e nutrio de plantas. UFLA: Lavras,
1999. 818p.

OVERBECK, G. E. et al. Brazils neglected biome: The south Brazilian Campos.


Perspectives in Plant Ecology, Evolution and Systematics, v. 9, 2007. p. 101-116.

RILLIG, M.C.; MUMMEY, D.L. Tansley review: mycorrhizas and soil structure. New
Phytol, v.171, 2006. p. 41-53

SBS Sociedade Brasileira de Silvicultura. Fatos e nmeros do Brasil florestal. Sociedade


Brasileira de Silviculta, 2007. 109 p.

SILVA, R. F. da; ANTONIOLLI, Z. I.; ANDREAZZA, R. Efeito da inoculao com fungos


ectomicorrzicos na produo de mudas de Eucalyptus grandis W. ex Maiden em solo
arenoso. Cincia Florestal, Santa Maria, v. 13, n. 1, p. 33-42, 2003

SMITH, S. E.; READ, D.J. Mycorrhizal symbiosis. London: Academic press, 1997. 605p.

SUERTEGARAY, D. M. A. Deserto Grande do Sul: Controvrsia. Porto Alegre: UFRGS,


1998. 130 p.

TAMURA, K.; KUMAR, S.; NEI, M. Mega: integrated software for molecular evolutionary
genetics analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinformatics, Baltimore, v.5,
p.150-163, 2006.

TAYLOR, R. J. Plants, fungi and bettongs: A fire-dependent co-evolutionary relationship.


Austral Ecology, Adelaide, v. 16, n. 3, p. 409-411, 1991.

TEDERSOO, L. et al. Ectomycorrhizal fungi of the Seychelles: diversity patterns and host
shifts from the native Vateriopsis seychellarum (Dipterocarpaceae) and Intsia bijuca
(Caesalpiniaceae) to the introduced Eucalyptus robusta (Myrtaceae), but not Pinus caribea
(Pinaceae). New Phytol, v. 175, 2007. p. 321-333.

VELLINGA, E. C.; WOLFE, B. E.; PRINGLE, A. Global patterns of ectomycorrhizal


introdictions. New Phytologist, 10: 1-14, 2009.
30

WHITE, T. J. et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for
phylogenetics. In: Innis, M.A. et al. (Eds.) PCR protocols. A guide to methods and
applications. Academic press, San Diego, 1990. p. 315-322.