Glucosidasa

EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA DE LA - GLUCOSIDASA
(-GLC) in vitro POR EXTRACTOS VEGETALES
IVONNE MELISSA AVELLANEDA ORTIZ
UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE PEREIRA
FACULTAD DE TECNOLOGA
ESCUELA DE TECNOLOGA QUMICA
PEREIRA
2013
CDIGO: 1087992796
TRABAJO DE GRADO
MONOGRAFA
Requisito parcial para optar al ttulo de Qumico Industrial
DIRECTOR DEL PROYECTO
OSCAR MARINO MOSQUERA MARTNEZ
Profesor Titular
Universidad Tecnolgica de Pereira
UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE PEREIRA
FACULTAD DE TECNOLOGA
ESCUELA DE TECNOLOGA QUMICA
PEREIRA
2013
NOTA DE ACEPTACIN DEL TRABAJO DE GRADO

MONOGRAFA
Presentado por:
El suscrito director y jurados del presente trabajo de grado, una vez revisada
la versin escrita y presenciado la sustentacin oral, decidimos otorgar la nota
de: __________________.
Con la connotacin: __________________.
Para la constancia firmamos en la ciudad de Pereira hoy 20 de Noviembre de

2013.
Director: __________________________
Oscar Marino Mosquera Martnez
Jurado: ___________________________
Juan Carlos Seplveda Arias

AGRADECIMIENTOS
A Dios, por estar siempre de mi lado.
A mi madre, Mara Ins Ortiz Vlez por darme la vida, su infinito amor,
comprensin, por la oportunidad de creer en m y en que puedo ser
alguien importante.
A mi abuelo, Vicente Avellaneda eres un ejemplo a seguir, un gran orgullo

para m; gracias por tu apoyo incondicional y tu hermosa humildad.
A Juan Manuel Gordillo Gonzlez, Rubiela Vlez, Janet y Aaron

Goffman, por la ayuda brindada.
A todos los miembros de mi familia, por ayudarme de alguna u otra

manera a resolver muchos de los obstculos que encontr en el camino.
Quiero agradecer especialmente a mi madrina, Elba Ortiz Vlez.
A mis profesores, especialmente Oscar Marino Mosquera y Jaime Nio

Osorio, por brindarme la oportunidad de pertenecer al Grupo
Biotecnologa Productos Naturales (GB-PN), por su paciencia, concejos,
apoyo y comprensin durante la ejecucin del proyecto.
A mis compaeras y compaeros del grupo GB-PN, por quienes tengo

mucho respeto, cario y admiracin.
A mi amigo de carrera, Andrs Mauricio Arias Gonzlez porque siempre

luchamos bajo todas las circunstancias acadmicas y naci una sincera
amistad.
A la Universidad Tecnolgica de Pereira.

TABLA DE CONTENIDO
AGRADECIMIENTOS ......................................................................................................3
TABLA DE CONTENIDO ................................................................................................. I
NDICE DE TABLAS ....................................................................................................... V
NDICE DE FIGURAS ................................................................................................. VII
NDICE DE ANEXOS ...................................................................................................... X
1. INTRODUCCIN....................................................................................................... 1
2. MARCO TERICO.........................................................................................................3
2.1 HIDROLASAS ..........................................................................................................3
2.1.1 Aspectos Bsicos ..................................................................................................3
2.1.2 Distribucin y funcin de las -Glucosidasas (-GLC) en los seres

vivos ....................................................................................................................................5
2.1.3 Clasificacin de las -Glucosidasas (-GLC) .................................................6
2.1.3.1 Clasificacin de las -Glucosidasas (-GLC) segn la Unin

Internacional de Bioqumica (UIB)............................................................................7
2.1.3.1.1 Mecanismos de hidrolisis de las glicsido hidrolasas ..........................7
2.1.3.2 Clasificacin de las -Glucosidasas (-GLC) segn su especificidad

por el sustrato ................................................................................................................9
2.1.3.3 Clasificacin de las -Glucosidasas (-GLC) segn la secuencia de

aminocidos en su estructura primaria ....................................................................9
2.1.4 Actividades biolgicas asociadas con la inhibicin de las -

Glucosidasas (-GLC) ................................................................................................... 11
2.1.5 Los inhibidores de las -Glucosidasas (-GLC).......................................... 12
I
2.1.5.1 Inhibidores de las -Glucosidasas (-GLC) con actividad
farmacolgica ................................................................................................................ 12
2.5.1.2 Inhibidores de las -Glucosidasas (-GLC) con actividad anti-

alimentaria ...................................................................................................................... 13
2.1.5.3 Inhibidores de la -Glucosidasa (-GLC) de origen natural y de

origen sinttico reportados en ola literatura...................................................... 15
2.1.6 Los mtodos para la evaluacin de la actividad inhibitoria de la -

Glucosidasa (-GLC) in vitro en extractos vegetales ........................................ 17
2.1.6.1 Fundamento del mtodo fotomtrico para la evaluacin de la

actividad inhibitoria de la -Glucosidasa (-G) in vitro .................................... 18
2.1.6.2 Sustratos utilizados en el estudio de la actividad enzimtica

glucsido hidrolasas (GH) ......................................................................................... 20
2.2 VARIABLES DE LA CINTICA DE UNA ENZIMA ................................... 21
2.3 ZONAS DE ESTUDIO ....................................................................................... 23
2.3.1 Reserva Natural Bremen-La Popa (RNB-LP) ............................................. 23
2.3.2 Parque Regional Natural Ucumar (PRNU) ................................................ 24
2.3.3 Familias de plantas de estudio ..................................................................... 25
2.3.3.1 Familia Annonaceae ....................................................................................... 25
2.3.3.2 Familia Apocynaceae .................................................................................... 26
2.3.3.3 Familia Asclepiadaceae .............................................................................. 26
2.3.3.4 Familia Asteraceae....................................................................................... 27
2.3.3.5 Familia Clusiaceae ......................................................................................... 27
2.3.3.6 Familia Costaceae ......................................................................................... 27
2.3.3.7 Familia Euphorbiaceae ................................................................................. 28
2.3.3.8 Familia Lamiaceae ......................................................................................... 28
2.3.3.9 Familia Lauraceae ......................................................................................... 29
2.3.3.10 Familia Malvaceae ....................................................................................... 29
II
2.3.3.11 Familia Melastomataceae .......................................................................... 30
2.3.3.12 Familia Passifloraceae ............................................................................... 30
2.3.3.13 Familia Piperaceae ...................................................................................... 30
2.3.3.14 Familia Solanaceae....................................................................................... 31
2.3.3.15 Familia Urticaceae ....................................................................................... 31
3.JUSTIFICACIN ....................................................................................................... 32
4. OBJETIVOS ................................................................................................................ 35
4.1 OBJETIVO GENERAL ........................................................................................ 35
4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ............................................................................ 35
SECCIN EXPERIMENTAL......................................................................................... 36
5.1 MATERIALES ................................................................................................... 36
5.1.1 Equipos y reactivos ....................................................................................... 36
5.1.2 Material vegetal ................................................................................................ 36
5.2 MTODOS ......................................................................................................... 37
5.2.1 Obtencin de los extractos crudos ............................................................. 37
5.2.2 Caracterizacin fitoqumica por cromatografa de capa delgada

(CCD) 38
6. RESULTADOS Y DISCUSIN ............................................................................... 41
6.1 OBTENCIN DE LOS EXTRACTOS CRUDOS ........................................... 43
6.2 CARACTERIZACIN FITOQUMICA POR CROMATOGRAFA DE

CAPA DELGADA (CCD) .............................................................................................. 44
6.3 FORMATO DEL MTODO FOTOMTRICO PARA LA EVALUACIN

DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA -GLUCOSIDASA (-GLC) ................. 51
6.4 VARIABLES IMPORTANTES EN EL DISEO DEL MTODO

FOTOMTRICO PARA LA EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD
INHIBITORIA DE LA -GLUCOSIDASA (-GLC) in vitro.......................... 52
6.4.1 La fuente de la -Glucosidasa (-GLC) ....................................................... 53
III
6.4.2 Seleccin del sustrato .................................................................................... 54
6.4.3 El pH y la temperatura del ensayo .............................................................. 54
6.4.4 Concentracin de la solucin buffer ........................................................... 55
6.4.5 La concentracin de la -Glucosidasa (-GLC) en el ensayo ................ 56
6.4.6 La concentracin final de p-Nitrofenil--D-glucopiransido (p-NFGP)

en el ensayo ................................................................................................................... 58
6.4.7 El tiempo de duracin del ensayo ................................................................ 59
6.4.8 La solubilidad de los reactivos en el momento del ensayo ................... 60
6.4.9 El perfil de los inhibidores enzimticos ..................................................... 61
6.5 Etapas del mtodo fotomtrico para la evaluacin de la actividad

inhibitoria -glucosidasa (-GLC) en plantas de la Ecorregin Eafetera
Colombiana (ECC) ........................................................................................................ 62
6.5.1 Ecuaciones para realizar los clculos de porcentajes de inhibicin y

actividad enzimtica. .................................................................................................. 64
6.6 TRATAMIENTO ESTADSTICO DE LOS DATOS OBTENIDOS EN

EL MTODO FOTOMTRICO PARA LA EVALUACIN DE LA
ACTIVIDAD INHIBITORIA DE LA -GLUCOSIDASA (-GLC) EN
PLANTAS DE LA ECORREGIN CAFETERA ..................................................... 66
7. CONCLUSIONES ....................................................................................................... 67
8. RECOMENDACIONES .............................................................................................. 68
9. BIBLIOGRAFA .......................................................................................................... 69
IV
NDICE DE TABLAS
Tabla 1. Caractersticas de los tipos de -Glucosidasa (-GLC) segn la

especificidad por el sustrato (Okuyama et al., 2005). ...........................................9
Tabla 2. Actividades biolgicas relacionadas con la inhibicin de la -
Glucosidasa (-GLC). ........................................................................................................ 11
Tabla 3. Lista de algunos inhibidores de la -Glucosidasa (-GLC) de origen
botnico. Las especies resaltadas en color verde presentan actividad anti-
alimentaria. ......................................................................................................................... 15
Tabla 4. Inhibidores de las -Glucosidasa (-GLC) de origen bacteriano. ...... 16
sinttico. ............................................................................................................................. 17
Tabla 6. Ingredientes activos de plaguicidas y bioplaguicidas aprobados por
la EPA (Enviromental Protection Agency) desde 1997 al 2010 ......................... 33
Tabla 7. Nombres cientficos de las especies de plantas estudiadas en el
proyecto. ............................................................................................................................ 37
Tabla 8. Sistemas de elucin utilizados en la caracterizacin fitoqumica por
CCD. ..................................................................................................................................... 39
Tabla 9. Patrones, reveladores y criterios de deteccin de metabolitos
secundarios usados en la caracterizacin fitoqumica por cromatografa de
capa delgada (CCD). ........................................................................................................ 40
Tabla 10. Caractersticas de absorcin en luz ultravioleta (360 nm) de los
diferentes tipos de flavonoides (Farnsworth, 1966). ........................................... 41
Tabla 11. Masas de los extractos crudos de n-hexano, diclorometano y
metanol obtenidas por maceracin pasiva................................................................ 43
Tabla 12. Clases de -Glucosidasas (-GLC) disponibles comercialmente y sus
caractersticas. ................................................................................................................ 53
Tabla 13. Condiciones experimentales de temperatura y pH ptimas para el
ensayo de acuerdo a las recomendaciones establecidas por el fabricante. .. 55
Tabla 14. Concentraciones de -Glucosidasa (-GLC) utilizadas en ensayos
actividad inhibitoria en extractos crudos de plantas. ......................................... 57
V
Tabla 17. Metodologa del mtodo fotomtrico para la evaluacin de la
actividad inhibitoria -Glucosidasa (-GLC) en plantas de la Ecorregin
Cafetera Colombiana . .................................................................................................... 63
VI
NDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructura en 3D de la -Glucosidasa aislada de Bacillus cereus

(Watanabe et al., 1997). ...................................................................................................3
Figura 2. Tipos de estructura tridimensional del sitio activo de las glicsido
hidrolasas. Tipo bolsillo (1). Tipo tnel (2). Tipo hendidura (3). (Davies and
Henrissat, 1995). ................................................................................................................4
Figura 3. Esquema del sitio activo de la -Glucosidasa (-GLC) aislada de
Saccharomyces cerevisiae frente a dos disacridos conformados por (I)
glucosa y manosa. (II) glucosa y galactosa. (Yao et al., 2003). ...........................6
Figura 4. Mecanismo de Inversin. Estas enzimas utilizan dos residuos
enzimticos, normalmente residuos carboxlicos, que actan como un cido y
una base respectivamente (Davies and Henrissat, 1995) ......................................7
Figura 5. Mecanismo de retencin. Estas enzimas actan mediante un
mecanismo de dos etapas. Una vez ms dos residuos se ven involucrados, uno
acta como nuclefilo y el otro como un cido o base. En el primer paso el
nuclefilo ataca en centro anmerico, dando como resultado la formacin de
una enzima glucosdica intermedia con un carcter cido provisto por el
carboxilato cido. En el segundo paso el ahora desprotonado carboxilato
cido acta como base y se une a una molcula de agua nucleoflica para
hidrolizar la enzima intermedia, dando el producto hidrolizado (Davies and
Henrissat, 1995). ................................................................................................................8
Figura 6. Estructura terciaria de algunas familias de glucsido hidrolasa
(GH) (Davies and Henrissat, 1995). ............................................................................ 10
Figura 7. Estructuras qumicas de los inhibidores de las -Glucosidasas (-
GLC) de origen bacteriano (Narender et al., 2013). Acarbosa, oligmero de
pseudoazcar (1). Voglibosa, amina poli-hidroxilada (2). Miglitol,
heterocclico N-sustituido poli-hidroxilado (3). ..................................................... 12
Figura 8. Estructura qumica de la Azadiractina (tri-terpenoide) componente
activo de bioplagacidas (Raizada et al., 2001). ........................................................ 14
VII
Figura 9. Metabolitos secundarios con actividad anti-alimentaria (Simmonds,
2006).................................................................................................................................... 14
Figura 10. Hidrlisis enzimtica del p-Nitrofenil--D-glucopiransido (p-
NFGP) por accin de la -Glucosidasa (-GLC) liberando unidades de p-
nitrofenolato y a-D-glucosa. Adaptado de (Cihan et al., 2010; Guo et al.,
2010). ................................................................................................................................... 19
Figura 11. Estructuras de resonancia del in p-nitrofenolato en medio bsico
(Adams and Langley, 1998). .......................................................................................... 20
Figura 12. Ecuacin general de una reaccin catalizada por enzimas (Segel,
1976). ................................................................................................................................... 21
Figura 13. Ecuacin de una reaccin catalizada por enzimas donde slo
participa un sustrato (Kargi, 2009). ........................................................................... 21
Figura 14. Relacin grfica de la constante de Michaelis-Menten y la
velocidad mxima (Vm) (Fromm and Hargrove, 2012). ......................................... 22
Figura 15. Expresin grfica de Lineweaver-Burke (Fromm and Hargrove,
2012) ................................................................................................................................... 23
Figura 16. Etapas desarrolladas durante la ejecucin del proyecto. ............... 42
Figura 17. Porcentajes de abundancia relativa de metabolitos secundarios en
extractos vegetales de n-hexano de plantas de la Ecorregin Cafetera
Colombiana. ........................................................................................................................ 45
extractos vegetales de diclorometano de plantas de la Ecorregin Cafetera
Colombiana. ........................................................................................................................ 47
extractos vegetales de metanol de plantas de la Ecorregin Cafetera
Colombiana ......................................................................................................................... 49
Figura 20. Actividad enzimtica de la polifenol oxidasa en funcin de la
concentracin de la solucin buffer pH 5 (Cestari et al., 2002)...................... 56
Figura 21. Distribucin de los tipos de muestras en la microplaca de 96
pozos. En la tabla se exponen los tipos de muestra estudiados en el
proyecto. ............................................................................................................................ 62
VIII
Figura 22. Caracterizacin de cumarinas en extractos de metanol.
(Revelador: KOH al 5%, observar en luz ultravioleta). ....................................... 112
IX
NDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Metodologa de la obtencin de los extractos crudos de n-hexano,

diclorometano y metanol (Nio et al., 2007). ......................................................... 90
Anexo 2. Procedimiento de la caracterizacin fitoqumica de los extractos
crudos por cromatografa de capa delgada (Wagner and Bladt, 1996). .......... 91
Anexo 3. Resultados de la caracterizacin fitoqumica de los extractos
crudos den-hexano, diclorometano y metanol por CCD. ...................................... 92
Anexo 4. Clculo de la relacin seal ruido (Skoog et al., 2008) ..................... 110
Anexo 5. Extraccin de la acarbosa a partir de pastillas de Glucobay 100
mg de Bayer (Cherkaoui et al., 1998). .......................................................................111
Anexo 6. Clculo de los porcentajes de abundancia relativa de metabolitos
secundarios en los extractos vegetales evaluados. ............................................ 112
X
1. INTRODUCCIN
El hombre ha dependido de la naturaleza desde el inicio de la humanidad

(Mukhtar et al., 2008) con el propsito de suplir sus necesidades bsicas
como la alimentacin de l y sus animales; de seguridad y proteccin, como la
obtencin de fertilizantes, agentes para el control de plagas, medicinas,
refugio, vestimenta; de confort como condimentos, cosmticos y fragancias
(Gurib-Fakim, 2006; Powell, 2009).
Las plantas han formado la base de sofisticados sistemas de medicina

tradicional en diferentes culturas del mundo desde hace miles de aos y
seguirn proporcionando a la humanidad nuevos compuestos con propiedades
teraputicas. Actualmente, el conocimiento emprico de las propiedades de
las plantas medicinales est siendo utilizado como gua de los qumicos en la
bsqueda de diferentes clases de fitocompuestos con inters farmacolgico
(Vitalini et al., 2009).
Los metabolitos secundarios de plantas y de origen microbiano, estn entre

los compuestos farmacuticos ms conocidos por la sociedad cientfica
(Carlson et al., 2008; Zhang and Tang, 2008) evidenciando actividades
biolgicas especficas (Feher and Schmidt, 2002) y eficaces en el
tratamiento contra el cncer, diferentes tipos de infecciones, inflamacin,
hipercolesterolemia, el rechazo de tejidos en el trasplante de rganos,
entre otros (Ojima, 2008); adems de biocompuestos que pueden ser usados
como ingredientes activos en plaguicidas (Kent, 2012).
Dada la importancia de las enzimas en la salud humana, el estudio de los

mecanismos enzimticos han proporcionado una interfaz entre la qumica
orgnica, el descubrimiento de frmacos (Khosla, 2000) y aplicaciones en el
campo de la biotecnologa; las enzimas son consideradas como marcadores de
importancia farmacolgica (Carlson et al., 2008) en el desarrollo de nuevos
1
agentes teraputicos (Komatsu et al., 2013) y mtodos para el control de
plagas (Nimpiboon et al., 2011).
El estudio de la actividad de inhibicin de la -glucosidasa est asociada con

las siguientes actividades biolgicas: anti-alimentaria en animales
herbvoros, anti-hiperglicemica (Raju et al., 2010), anti-infecciosa, anti-
metsica, anti-viral (VIH), efectos reguladores del crecimiento en las
plantas (Wrodnigg et al., 2006) y desarrollo de enfermedades por
almacenamiento excesivo en los lisosomas (Sawkar et al., 2006).
Conociendo la riqueza de flora de la Ecorregin Cafetera Colombiana , la

cual es fuente de metabolitos secundarios con actividades biolgicas
comprobadas (Nio et al., 2002; Nio et al., 2003) realizadas en estudios
previos y a la necesidad de encontrar fito-compuestos con potencialidad
para ser utilizados como inhibidores de esta glucsido hidrolasa (GH), se
propone el mtodo fotomtrico para evaluar la actividad inhibitoria de la -
Glucosidasa (-GLC) en extractos vegetales pertenecientes a la Ecorregin
Cafetera Colombiana. Este estudio ampliar el conocimiento de la flora de
esta regin y determinar los usos potenciales de la misma.
2
2. MARCO TERICO
2.1 HIDROLASAS
2.1.1 Aspectos Bsicos
Las hidrolasas son una clase de enzimas que catalizan las reacciones de
hidrlisis de diferentes sustratos como steres de cidos carboxlicos y de
cidos fosfricos, teres, pptidos y carbohidratos utilizando agua en el
proceso (Sacher et al., 2009). Las hidrolasas son importantes en la industria
qumica, farmacutica y de alimentos (Balogh et al., 2004).
Las glicsido hidrolasas (GH) son una subclase de las hidrolasas, que actan
sobre los enlaces glicosdicos ( y ) de di, oligo y polisacridos con el fin de
obtener unidades de monosacridos bajo dos mecanismos: inversin o
retencin (Davies and Henrissat, 1995). Las GH estn involucradas en
diferentes procesos biolgicos como la degradacin de la biomasa y el
reconocimiento viral (Kuntz et al., 2008). Las -Glucosidasas (-GLC) (figura
1) pertenecen a esta subclase de enzimas (Giannesi et al., 2006).
Figura 1. Estructura en 3D de la -Glucosidasa aislada de Bacillus cereus

(Watanabe et al., 1997).
3
Las glicsido hidrolasas (GH) presentan tres clases de estructura
tridimensional del sitio activo: bolsillo, tnel y hendidura (Davies and
Henrissat, 1995) como se presenta en la figura 2.
Figura 2. Tipos de estructura tridimensional del sitio activo de las glicsido

hidrolasas. Tipo bolsillo (1). Tipo tnel (2). Tipo hendidura (3). (Davies and
Henrissat, 1995).
4
2.1.2 Distribucin y funcin de las -Glucosidasas (-GLC) en los
seres vivos
Las -Glucosidasas (-GLC) estn presentes en una amplia gama de seres

vivos como microorganismos, hongos, plantas y animales (Yamamoto et al.,
2004). La especificidad por el sustrato y sus propiedades dependen en gran
medida de la fuente donde ella haya sido obtenida (Kim et al., 2008).
En humanos, las -Glucosidasas (-GLC) est presente en dos isoformas: EC

3.2.1.3 y EC 3.2.1.20, ambas codificadas por el gen GAA el cual se encuentra
en el cromosoma 17q25. Se sintetiza como un precursor de 110 kDa (nmeros
de aminocidos: 2-952, 29-952 y 68-952); su carcter es cido (Yoshimizu
et al., 2008). La funcin de estas enzimas es hidrolizar enlaces 1,4 y 1,6 de
oligo y disacridos liberando como producto de su accin unidades de -D-
glucosa (Moreland et al., 2012; Zeng et al., 2012).
La isoforma EC 3.2.1.3 de la -Glucosidasa (-GLC) est presente en todas

las clulas del organismo realizando funciones propias de catabolismo, como
la biosntesis de glicoconjugados en los lisosomas (Kakavanos et al., 2006);
mientras que la isoforma EC 3.2.1.20 est presente en las vellosidades del
intestino delgado realizando funciones anablicas, como la degradacin de
carbohidratos en la etapa final de la digestin; es una de las cuatro enzimas
encargadas de la degradacin completa del almidn (ysek et al., 2006;
Ferreira et al., 2010).
En plantas, las -Glucosidasas (-GLC) se encargan de la degradacin del

almidn presente en las semillas en germinacin; acta de manera sinrgica
junto con la -amilasa en este proceso (Nakai et al., 2007).
En insectos, las -Glucosidasas (-GLC) estan presentes en el tubo digestivo,

secreciones salivares y glndulas hipofaringeas de estos animales, puesto
que se alimentan de celulosa para llevar a cabo la digestin y sobrevivir;
5
estn presentes en una iso-forma, como -Glucosidasa II (-GLC II)
(Ghadamyari et al., 2010; Watanabe et al., 2013).
En Bacterias y hongos, la funcin de las -Glucosidasas (-GLC) es esencial

en el proceso de degradacin de oligo y disacridos (Figura 3) (Murray et al.,
2004; Kurakata et al., 2008) y de esta manera obtienen energa para llevar a
cabo sus funciones vitales (Lee et al., 2002).
Figura 3. Esquema del sitio activo de la -Glucosidasa (-GLC) aislada de

Saccharomyces cerevisiae frente a dos disacridos conformados por (I)
glucosa y manosa. (II) glucosa y galactosa. (Yao et al., 2003).
2.1.3 Clasificacin de las -Glucosidasas (-GLC)
Las -Glucosidasas pueden ser clasificadas segn el tipo de reaccin

hidroltica que catalicen de acuerdo a la Unin Internacional de Bioqumica
(UIB) (Sacher et al., 2009), su especificidad por el sustrato (Okuyama et
al., 2005) y la secuencia de aminocidos en su estructura primaria
(Henrissat and Bairoch, 1993). A continuacin, se describirn cada uno de
estos criterios de clasificacin.
6
2.1.3.1 Clasificacin de las -Glucosidasas (-GLC) segn la Unin
Internacional de Bioqumica (UIB)
El nmero de la comisin de enzimas (EC) para la -Glucosidasa (-GLC) se

presenta a continuacin (Motabar et al., 2009):
EC 3. Hidrolasa
EC 3.2. Glucsido hidrolasa
EC 3.2.1.Capaz de hidrolizar enlaces - O y -S glicosdicos
EC 3.2.1.20/3 -Glucosidasa
2.1.3.1.1 Mecanismos de hidrolisis de las glicsido hidrolasas
Las glicsido hidrolasas realizan su accin enzimtica bajo dos mecanismos:

inversin (figura 4) y retencin (figura 5).
+
+
-
O O O O
O O
H H

O O O HOR
O R 10,5 A O
CH2 R
O H O H OH

H H
-
O O O O OH
O
Figura 4. Mecanismo de Inversin. Estas enzimas utilizan dos residuos

enzimticos, normalmente residuos carboxlicos, que actan como un cido y
una base respectivamente (Davies and Henrissat, 1995)
7
+
+
O
O
O
O
H H

O 5,5 A O
O R O
CH2 R
- O
O O O
- O
O
H
O
O
+
+ H
O O

O O
O
HO
H

O O
OH O
CH2 H
-
O O
O O
Figura 5. Mecanismo de retencin. Estas enzimas actan mediante un

mecanismo de dos etapas. Una vez ms dos residuos se ven involucrados, uno
acta como nuclefilo y el otro como un cido o base. En el primer paso el
nuclefilo ataca en centro anmerico, dando como resultado la formacin de
una enzima glucosdica intermedia con un carcter cido provisto por el
carboxilato cido. En el segundo paso el ahora desprotonado carboxilato
cido acta como base y se une a una molcula de agua nucleoflica para
hidrolizar la enzima intermedia, dando el producto hidrolizado (Davies and
Henrissat, 1995).
8
2.1.3.2 Clasificacin de las -Glucosidasas (-GLC) segn su
especificidad por el sustrato
Las -glucosidasas (-GLC) se pueden clasificar en tres tipos de acuerdo a

su especificidad por el sustrato como se muestra en la tabla 1.
Tabla 1. Caractersticas de los tipos de -Glucosidasa (-GLC) segn la

especificidad por el sustrato (Okuyama et al., 2005).
TIPO DE -GLUCOSIDASA (-GLC) ESPECIFICIDAD

Hidroliza rpidamente sustratos
-Glucosidasa I
heterogneos como aril-glucsidos y
(-GLC I)
carbohidratos como la sacarosa.
Presenta una alta actividad enzimtica de
-Glucosidasa II
sustratos homogneos como di y
(-GLC II)
oligosacridos.
Su mayor actividad enzimtica es observada
-Glucosidasa III
al hidrolizar sustratos homogneos como
(-GLC III)
almidn soluble y glucgeno (polisacridos).
2.1.3.3 Clasificacin de las -Glucosidasas (-GLC) segn la secuencia

de aminocidos en su estructura primaria
Las glucsido hidrolasas (GH) estan clasificadas en 130 familias (Tagami et

al., 2013) segn su secuencia de aminocidos en la estructura primaria
(Henrissat and Bairoch, 1993); las -Glucosidasas (-GLC) estan distribuidas
en las siguientes familias de GH: GH4, GH13, GH31, GH63 y GH97 (Ernst et
al., 2006).
Las familias GH13 y GH31 comprenden el mayor nmero de -Glucosidasas,

las cuales se pueden distinguir por su especificidad por el sustrato; la GH31
ha sido la ms estudiada en trminos de su estructura tridimensional y
reconocimiento de sustratos adems, de ser la familia ms diversa ya que
9
est conformada por enzimas de los tres dominios de vida (animales, plantas
y microorganismos) las cuales presentan un amplio rango de actividades
hidrolticas (Ernst et al., 2006).
En la figura 6, se puede observar algunos tipos de estructura terciaria de

las familias de glucsido hidrolasas.
Figura 6. Estructura terciaria de algunas familias de glucsido hidrolasa

(GH) (Davies and Henrissat, 1995).
10
2.1.4 Actividades biolgicas asociadas con la inhibicin de las -
Glucosidasas (-GLC)
El estudio del mecanismo de inhibicin de la -Glucosidasa (-GLC) es

aplicable en el tratamiento de enfermedades en seres humanos (Ryu et al.,
2009) y en el diseo de nuevo mtodos para el control de plagas con el
propsito de proteger los cultivos de importancia agronmica (Ramzi and
Hosseininaveh, 2010). Las actividades biolgicas asociadas con la inhibicin
de la -Glucosidasa (-GLC) se presentan en tabla 2.
Tabla 2. Actividades biolgicas relacionadas con la inhibicin de la -

Glucosidasa (-GLC).
ACTIVIDADES BIOLGICAS ASOCIADAS CON LA INHIBICIN DE LA -GLUCOSIDASA (-GLC)
2.1.4.1 El mecanismo de inhibicin de las -Glucosidasas (-GLC) en animales herbvoros es el primer paso
ANTI-ALIMENTARIA para el diseo de un mtodo de control de plagas en plantas de importancia agronmica.
EN ANIMALES HERBVOROS (Nimpiboon et al., 2011; Vatanparast et al., 2012).
La capacidad de invasin y migracin de las clulas cancerosas es debido a que los patrones de
2.1.4.2 glicosilacin se encuentran alterados. Las -Glucosidasas (-GLC) que participan en este proceso,
ANTI-CNCER constituyen un tratamiento eficaz de esta enfermedad; adems reduce la progresin de las
clulas tumorales en los procesos de metstasis (Snchez and Cantalejo, 2010)
Los inhibidores de las -Glucosidasas (-GLC) retrasan la absorcin de carbohidratos; tienen un

2.1.4.3
papel en el estado pre-diabetico reduciendo la progresin de la diabetes (Liu et al., 2011)
ANTI-HIPERGLICEMICA
complicaciones vasculares crnicas (Shai et al., 2010) y la obesidad (Huang et al., 2011).
2.1.4.4 La inhibicin de la -Glucosidasa (-GLC) tiene un profundo efecto en la estructura del glicano
ANTI-VIRAL (Mehta et al., 1998) alterando los procesos de reconocimiento clula-clula o clula virus (Ryu et
al., 2009; Moorthy et al., 2011).
2.1.4.5 Los inhibidores de la -Glucosidasa, pueden comportarse como chaperonas porque corrigen
ALMACENAMIENTO anomalas en la estructura de la -Glucosidasa (-GLC), recuperando su estructura tridimensional
EXCESIVO DE y pueda ejercer su actividad enzimtica (Sawkar et al., 2006).
GLICOCONJUGADOS
11
2.1.5 Los inhibidores de las -Glucosidasas (-GLC)
2.1.5.1 Inhibidores de las -Glucosidasas (-GLC) con actividad

farmacolgica
Existen tres tipos de inhibidores de esta enzima basados en su estructura

qumica, generalmente hidroxilados: compuestos heterocclicos N-
sustituidos poli-hidroxilados (i), ciclo-alquenos poli-hidroxilados (ii) y
oligmeros de pseudoazcares (Kim et al., 2008).
A nivel farmacolgico, dentro de los inhibidores naturales de esta enzima,

existen compuestos de origen bacteriano como la acarbosa, el miglitol y la
Voglibosa (hemi-sinttico) (Naik and Kokil, 2013); son ingredientes activos
en medicamentos contra la diabetes tipo II (Liu et al., 2013). Las
estructuras qumicas de estos inhibidores, se presenta en la figura 7.
OH
H3C OH OH
O
HN O O
HO
HO OH HO HO
HO OH
O OH OH OH
O
OH
Acarbosa
OH
HO
N OH
HO
HO OH HO OH NH
CH3
HO
Miglitol
Voglibosa CH3
Figura 7. Estructuras qumicas de los inhibidores de las -Glucosidasas (-

GLC) de origen bacteriano (Narender et al., 2013). Acarbosa, oligmero de
pseudoazcar (1). Voglibosa, amina poli-hidroxilada (2). Miglitol,
heterocclico N-sustituido poli-hidroxilado (3).
12
Actualmente, los medicamentos procedentes de plantas que actan bajo del
mecanismo de inhibicin de las -Glucosidasas (-GLC) son muy pocos; los
metabolitos secundarios que son ingredientes activos en dichos
medicamentos, se les han realizado modificaciones hemi-sintticas como
tri-terpnos que han sido hibridados, la -amirina, el lupeol y la niacina N-
allicas/ N-alqulicas (Narender et al., 2013).
2.5.1.2 Inhibidores de las -Glucosidasas (-GLC) con actividad anti-

alimentaria
Dentro de los mtodos de control de plagas de origen botnico, el nico bio-

plaguicida cuyo mecanismo de accin sea la inhibicin de enzimas digestivas y
que se usa para proteger los cultivos de importancia agronmica es la
Azadiractina (Celis et al., 2008).
La Azadiractina (figura 8) es un tetra-terpenoide caracterstico de la

familia Meliaceae especialmente del rbol Neem (Azadirachta indica). Este
compuesto se encuentra en la corteza, hojas, frutos y, principalmente, en la
semilla del rbol. Se han identificado alrededor de 18 compuestos, entre los
que se destaca azadiractina, que se encuentra en mayor concentracin.
Muestra accin anti-alimentaria, reguladora del crecimiento, inhibidora de la
oviposicin y esterilizante. Actualmente, se pueden encontrar formulaciones
comerciales como Neem Gold, Neemazal, Econeem, Neemark, Neemcure y
Azatin, entre otros (Celis et al., 2008).
Adems de los tri-terpenoides, otros metabolitos secundarios tambien

presentan actividad anti-alimentaria como las furanocumarinas,
isoflavonoides y terpenoides (figura 9)(Simmonds, 2006).
13
MeO2C
O
H3C O OH
O O
O O
H3C H H
HO
AcO OH
H
MeO2C O
Azadiractina
Figura 8. Estructura qumica de la Azadiractina (tri-terpenoide) componente

activo de bioplagacidas (Raizada et al., 2001).
H
O
H H
H
O
O O O
OCH3 H H
H
HO O Xantotoxina O
H
H O OAc
O
O OCOCHMe2
H
Jodrellin B
Faseolina H
Figura 9. Metabolitos secundarios con actividad anti-alimentaria (Simmonds,

2006).
14
2.1.5.3 Inhibidores de la -Glucosidasa (-GLC) de origen natural y
de origen sinttico reportados en ola literatura
A continuacin se presentan en las tablas 3, 4 y 5 algunos los inhibidores de

la -Glucosidasa (-GLC) de origen natural y de origen sinttico reportados
en la literatura hasta el momento.

botnico. Las especies resaltadas en color verde presentan actividad anti-
alimentaria.
FITO-COMPUESTO
ESPECIE O REFERENCIA
METABOLITO SECUNDARIO
Acer rubrum Galo-taninos (Wan et al., 2012)

(Phuwapraisirisan et
Aegle marmelos Fenil-etil-cinamidas
al., 2008)
Aesculus hippocasteneum Terpenoide
Ajuga sp Terpenoide
Ammi majus Furanocumarinas (Simmonds, 2006)
Azadirachta indica Terpenoide
Citrus bergamia Furanocumarinas
Corchorus olitorius Poli-fenoles (Oboh et al., 2012)
Garcinia nobilis Xantonas (Fouotsa et al., 2012)

Glinus opositifolius Saponina tri-terpnica (Kumar et al., 2013)
2,4-di-bromofenol
Grateloupia elliptica (Kim et al., 2008)
2,4,6-tri-bromofenol
15
Gypsophila oldhamiana Saponinas tri-terpnicas (Luo et al., 2008)
Hedychium spicatum (Prabhakar Reddy et
Di-terpenos
(Ham. Ex Smith) al., 2009)
Panax japonicus C. A.
Poli-acetilnos (Chan et al., 2010)
Meyer var. Major
Phaseolus vulgaris Isoflavonoide (Simmonds, 2006)
cido cafeico
cido ferulico
Pinus pinaster Catequinas
(Naik and Kokil, 2013)
Epi-catequinas
Proantocianidinas,
Taxifolina
Rhus verniciflua Stokes Flavonoides (Kim et al., 2010)
Salacia hainanensis Chun
Tri-terpenos (Huang et al., 2012)
et How
Scutellaria sp
Scutellaria woronowii Terpenoides (Simmonds, 2006)
(Juss)
Tabla 4. Inhibidores de las -Glucosidasa (-GLC) de origen bacteriano.
ESPECIE METABOLITO SECUNDARIO REFERENCIA

Actinoplanes sp Acarbosa
Streptomyces
Voglibosa
hydroscopicus (Naik and Kokil, 2013)
Streptomyces sp
Miglitol
Bacillus sp
16
sinttico.
COMPUESTO REFERENCIA
Anlogos N-2-sustituidos-5-
(Bian et al., 2013)
(p-Toluenesulfonylamino)-ftalimida
Compuestos derivados de -acetamido
(Tiwari et al., 2008)
carbonilos
Compuestos derivados de
(Xu et al., 2007)
andrograflidos
Compuestos derivados de benzopiranos (Wang et al., 2010)
(Shen et al., 2010),
Compuestos derivados de la Cromenona
(Raju et al., 2010)
Derivados de N-fenil-carboxamida (Alves et al., 2011)
Derivados de los triazoles (Ferreira et al., 2010)
Derivados N-substituidos: valienamina y (ysek et al., 2006),
conduramina F-1 (Cumpstey et al., 2011)
Imino-azcares de la pirrolidina (Trapero and Llebaria, 2012)
(Guerreiro et al., 2013),
Imino-ciclitoles de cinco miembros
(Trapero and Llebaria, 2012)
Prolinas glicosidadas (Pandey et al., 2007)
Sales sulfonio de tioazcares,
(Xie et al., 2011)
neosalaprinol y neoponkoranol
2.1.6 Los mtodos para la evaluacin de la actividad inhibitoria de la

-Glucosidasa (-GLC) in vitro en extractos vegetales
Existen varios mtodos para cuantificar la actividad cataltica de una enzima

como los mtodos fotomtricos y los mtodos fluorimtricos (Rahman et al.,
2005); sin embargo, los mtodos fotomtricos son los ms utilizados para
este propsito (Glatz, 2006).
El mtodo fluorimtrico es mucho ms sensible que el mtodo

espectrofotomtrico, ya que son ms especficos al tener que utilizar dos
17
longitudes de onda en lugar de una, pero pueden sufrir ms interferencias
por impurezas presentes en el medio o por la inestabilidad que muchos
compuestos fluorescen al ser expuestos a la luz; por esta razn, no se
recomienda evaluar matrices complejas como los extractos vegetales por el
mtodo fluorimtrico (Glatz, 2006).
Es importante destacar que recientemente, se estn desarrollando estudios

para encontrar inhibidores de la -Glucosidasa (-GLC) en extractos
vegetales por Resonancia Magntica Nuclear (RMN) comparando las seales
en los espectros DOSY de la enzima, la enzima y un inhibidor con actividad
biolgica comprobada y de la cual se conoce el mecanismo de accin; y la
enzima junto al extracto crudo (Shang et al., 2012).
El cribado de inhibidores de la -Glucosidasa (-GLC) se ha convertido en el

gran atractivo para los cientficos a travs de RMN debido a su capacidad
nica para proporcionar informacin sobre la aspectos estructurales,
termodinmicos, y cinticos de la interaccin entre los inhibidores y los
residuos de aminocido de la enzima (Shang et al., 2012).
2.1.6.1 Fundamento del mtodo fotomtrico para la evaluacin de la

actividad inhibitoria de la -Glucosidasa (-G) in vitro
El mtodo por el cual se propone la evaluacin de la actividad inhibitoria -

Glucosidasa (-GLC) en extractos vegetales, consiste en la hidrolisis
enzimtica del sustrato de origen sinttico, p-Nitrofenil--D-
glucopiransido (p-NFGP) que por accin de la -Glucosidasa (-GLC), libera
unidades de p-nitrofenolato y -D-glucosa (Cihan et al., 2010; Damsud et al.,
2013) como se presenta en la figura 10.
El in p-nitrofenolato presenta una coloracin amarillo claro que evidencia

que la reaccin de hidrlisis enzimtica se ha llevado a cabo; sin embargo, en
ocasiones no se observa claramente (Oh and Kang, 2004). Varios autores
18
proponen que para intensificar el color, se debe adicionar una solucin bsica
(Dingee and Anton, 2010) con el objetivo de generar un ambiente denso en
electrones para que el anin p- nitrofenolato entre en resonancia y se
estabilice (Adams and Langley, 1998) como se muestra en la figura 11,
teniendo en cuenta que toda la concentracin sustrato (p-NFGP) ha
reaccionado con la enzima y no se presenten falsos-positivos en los
resultados debido que el sustrato p-NFGP es susceptible de reaccionar
frente a una hidrlisis bsica.
OH
O
HO
HO
O
OH
O
+
N O
+ H H
-
O
p-Nitrofenil-a-D-glucopiransido
a-Glucosidasa
OH O
-
HO O +
O N
HO + -
OH O
OH
In p-nitrofenolato
a-D-Glucosa
Figura 10. Hidrlisis enzimtica del p-Nitrofenil--D-glucopiransido (p-

NFGP) por accin de la -Glucosidasa (-GLC) liberando unidades de p-
nitrofenolato y a-D-glucosa. Adaptado de (Cihan et al., 2010; Guo et al.,
2010).
19
- O
O O O
+ + ++
- N - N N N
O O O O - - -
O O O O
In p-Nitrofenolato
(405 nm)
Figura 11. Estructuras de resonancia del in p-nitrofenolato en medio bsico

(Adams and Langley, 1998).
2.1.6.2 Sustratos utilizados en el estudio de la actividad enzimtica

glucsido hidrolasas (GH)
Los sustratos recomendados para estudiar la actividad cataltica de las

glucsido hidrolasas son los glicosidos de mono y di-nitro-fenoles, debido a
que los compuestos liberados como producto de la hidrlisis enzimtica,
presentan compuestos nitro-fenlicos fcilmente detectables por su
coloracin (Dingee and Anton, 2010). La estructura qumica de este tipo de
sustratos son especficas para cada tipo de glucsido hidrolasa estudiada
(Dingee and Anton, 2010); el sustrato indicado para la -Glucosidasa (-GLC)
es el p-nitrofenil--D-glucopiransido (p-NFGP). La aglicona nitro-fenlica
del p-NFGP, imita a una unidad de monosacrido, la cual encaja en el sitio
activo de la -GLC y no interfiere en el mecanismo cataltico de hidrlisis
enzimtica (Dingee and Anton, 2010).
20
2.2 VARIABLES DE LA CINTICA DE UNA ENZIMA
Cualquier reaccin catalizada por enzimas puede ser escrita como la

ecuacin 1 (Figura 12):
Enzima
Sustrato Producto (Ecuacin 1)
Figura 12. Ecuacin general de una reaccin catalizada por enzimas (Segel,
1976).
Las reacciones qumicas catalizadas por enzimas donde se involucra un solo

sustrato, se describen como la siguiente ecuacin 2 (Figura 13); la -
Glucosidasa (-GLC) slo requiere un solo sustrato (Guo et al., 2010).
E+S
ES E + P (Ecuacin 2)
Figura 13. Ecuacin de una reaccin catalizada por enzimas donde slo
participa un sustrato (Kargi, 2009).
Donde E es la enzima, S es el sustrato, ES es el complejo enzima-sustrato y

P es el producto. La reaccin enzimtica transcurre en dos etapas: en la
primera etapa, la enzima se enlaza al sustrato con el propsito de formar el
complejo enzima sustrato la cual es una reaccin reversible; mientras que en
la segunda etapa, el sustrato se ha transformado en producto y la enzima
permanece sin ninguna modificacin durante el ciclo cataltico (Kargi, 2009).
Dentro de los parmetros cinticos que se conocen para definir las

propiedades de las enzimas son la constante de Michaelis Menten y la
velocidad mxima (Vm), las cuales se relacionan grficamente como se
presenta en la figura 14 (Fromm and Hargrove, 2012).
21
Figura 14. Relacin grfica de la constante de Michaelis-Menten y la
velocidad mxima (Vm) (Fromm and Hargrove, 2012).
La constante de Michaelis Menten se define como la concentracin de

sustrato a la cual se obtiene la mitad de la velocidad mxima (Vm). El Valor
de Km nos da una idea la afinidad que tiene el enzima por su sustrato, cuanto
mayor es Km, menor es la afinidad (predominan las formas E y S libres);
cuanto menor es Km, mayor es la afinidad (predomina la forma ES) (Fromm
and Hargrove, 2012). La velocidad mxima (Vm) se define como la velocidad
cuando todo el enzima se encuentra unido al sustrato, es decir, estima el
nmero de centros activos del enzima (Fromm and Hargrove, 2012).
De acuerdo a la figura 14, se puede observar que a bajas concentraciones de

sustrato, la velocidad de reaccin inicial (1/2 Vm) es proporcional al valor de
Km, la cual es un valor especfico de concentracin del sustrato donde la
reaccin es de primer orden con respecto al sustrato (Rahman et al., 2005).
Si la concentracin de sustrato aumenta, la velocidad de reaccin se

convierte esencialmente independiente de la concentracin de sustrato y se
aproxima una velocidad constante; esto significa que en este rango de
valores la reaccin es de orden 0, dado que la enzima se encuentra saturada
(Rahman et al., 2005). Para hallar los valores de Km y V mxima, se puede
utilizar la expresin grfica de Lineweaver-Burke la cual es til para
22
proveer informacin importante acerca de la cintica de las enzimas
(Rahman et al., 2005) como se observa en la figura 15.
Figura 15. Expresin grfica de Lineweaver-Burke (Fromm and Hargrove,

2012)
2.3 ZONAS DE ESTUDIO
La variacin en el relieve, los climas y los suelos de la Ecorregin Cafetera

Colombiana generan una diversidad de ecosistemas o tipos de vegetacin
tales como: bosques secos y humedales en los valles, bosques andinos en la
zona cafetera, bosques alto-andino y pramos en las partes altas de las
cordilleras; la ECC es muy diversa en especies de animales y plantas
incluyendo especies endmicas (Guevara et al., 2009).
2.3.1 Reserva Natural Bremen-La Popa (RNB-LP)
La Reserva Natural Bremen-La Popa (RNB-LP) forma parte de la Estrella

fluvial del Quindo la cual fue establecida, junto con otras fincas en un plan
23
de adquisicin realizado por la Corporacin Regional del Quindo (CRQ) en
1968 para la proteccin de cuencas hidrogrficas y bosques naturales
(Corporacin Regional del Quindo et al., 2002; Nieto and Londoo, 2006). La
RNB-LP se ubica en el Municipio de Filandia, Departamento del Quindo,
tiene 747 hectreas; 450 hectreas estn sembradas en plantaciones
conferas (pino ptula y ciprs) que estn siendo aprovechadas para dejar en
regeneracin y de las cuales quedan 15 hectreas, mientras que 230
hectreas corresponden a bosque nativo (Nieto and Londoo, 2006;
Echeverri et al., 2007).
La RNB-LP es el atractivo natural de gran importancia para el municipio de

Filandia, su gran diversidad biolgica en cuanto a flora se expresa en 143
especies de rboles y 7 especies de bejucos (Echeverri et al., 2007).
2.3.2 Parque Regional Natural Ucumar (PRNU)
El Parque Regional Natural Ucumar (PRNU) se fund 1984 por el Concejo

Municipal de Pereira y actualmente, se encuentra a cargo de la Corporacin
Autnoma Regional del Risaralda (Galeano and Bernal, 1993).
El PRNU se ubica en el departamento de Risaralda, en la zona de

amortiguacin del Parque Nacional Los Nevados en un rango altitudinal entre
1850 y 2600 msnm (Galeano and Bernal, 1993); consta de 3986 hectreas
localizadas en la vertiente occidental de la Cordillera Central (Guevara,
1999).
La flora del PRNU es relativamente rica, se han encontrado

aproximadamente 598 especies pertenecientes a 113 familias de plantas
superiores (Galeano and Bernal, 1993); El PRNU es considerado un
ecosistema estratgico debido a su gran biodiversidad de especies de
plantas y animales (Guevara, 1999).
24
2.3.3 Familias de plantas de estudio
Este estudio se realiz con 36 especies de plantas recolectadas en la

Reserva Natural Bremen-La Popa (RNB-LP) y el Parque Regional Natural
Ucumar (PRNU) las cuales se caracterizan por presentar diferentes tipos
de actividades biolgicas o por demostrar cierto carcter medicinal. Las
plantas de estudio pertenecen a las siguientes familias botnicas:
Annonaceae, Apocynaceae, Asclepiadaceae, Asteraceae, Clusiaceae,
Costaceae, Euphorbiaceae, Lamiaceae, Lauraceae, Malvaceae,
Melastomataceae, Passifloraceae, Piperaceae, Solanaceae y Urticaceae. A
continuacin, se describir brevemente su ubicacin geogrfica en el mundo
y en Colombia, el tipo de metabolitos secundarios presentes en ellos
(Fitoqumica) y su situacin en la RNB-LP y el PRNU.
2.3.3.1 Familia Annonaceae
Es un conjunto de plantas muy conocido en medicina popular. Comprende

alrededor de 120 gneros y 2100 especies en el mundo (Trease, 2009). En
Colombia, su conocimiento es escaso y slo existen 72 especies distribuidas
en 17 gneros (Murillo, 2001); en el PRNU existen dos especies: Guatteria sp
y Rollinia sp (CARDER, 2012 ). La RNB-LP se destaca por la presencia de
especies del gnero Cynanchum sp y Guatteria sp. Los metabolitos
secundarios ampliamente encontrados en esta familia son los alcaloides del
tipo isoquinolina (Trease, 2009).
25
2.3.3.2 Familia Apocynaceae
Las plantas de la familia Apocynaceae est estrechamente vinculada con la

familia Asclepiadaceae. Comprende 250 gneros y 2000 especies alrededor
del mundo, especficamente en los trpicos y sub-trpicos (Trease, 2009).
En el PRNU hay una especie correspondiente al gnero Mandevilla sp
(CARDER, 2012 ), mientras que en la RNB-LP se destaca por la presencia de
especies del gnero Oxypetalum sp. Los metabolitos secundarios reportados
en la familia Apocynaceae son: glucsidos cianognicos, leucoantocianinas,
saponinas, taninos, cumarinas, cidos fenlicos, ciclitoles, tri-terpenoides,
alcaloides esteroidales en el gnero Hollarhena, alcaloides del tipo harmano
en los gneros Amsonia y Aspidosperma (Trease, 2009).
2.3.3.3 Familia Asclepiadaceae
Las plantas de la familia Asclepiadaceae se ubican en zonas tropicales,

comprende 172 gneros y 3000 especies (Jrgens et al., 2008). Estudios
filogenticos han demostrado que la familia Asclepiadaceae pertenece a la
familia Apocynaceae (Heneidak et al., 2006). En el PRNU nicamente se
encuentra la especie Orthosia stenophylla (CARDER, 2012 ), mientras que la
RNB-LP se encuentran especies del gnero Blepharodon sp. Los fito-
compuestos de mayor importancia en esta familia son: los alcaloides del
indol, fenantrohidro-indolizidina y del tipo piridina; cardenlidos; glucsidos
cianognicos, saponinas, taninos y ciclitoles (Trease, 2009).
26
2.3.3.4 Familia Asteraceae
La familia Asteraceae est conformada por 1500 gneros y 23000 especies

con distribucin cosmopolita agrupadas en 3 subfamilias y 17 tribus (Zavada
and Lowrey, 2010) constituyendo, la mayor familia de plantas con flores
incluyendo dos grupos monofilticos de tamao notablemente desigual
(Gruenstaeudl et al., 2009). En Colombia hay 236 gneros y 1435 especies
(Rangel, 2006); PRNU hay 24 especies de esta familia (CARDER, 2012 )
mientras que la RNB-LP se encuentran plantas del gnero Clivadium sp,
Tilesia sp y Verbesina sp. Los metabolitos secundarios encontrados en la
familia Asteraceae y sus subfamilias son: flavonoles, flavonas y
especialmente, flavonoides (Emerenciano et al., 2001).
2.3.3.5 Familia Clusiaceae
Las plantas de la familia Clusiaceae se encuentran ampliamente distribuidas

en la zona tropical de Asia, frica, Nueva Caledonia y Polinesia (Lavaud et
al., 2012). Esta familia consta de 40 gneros y 1200 especies en el mundo
(Marti et al., 2009). En Colombia existen 20 gneros (Galeano and Bernal,
1993); en el PRNU existen 5 especies (CARDER, 2012 ) mientras que en la
RNB-LP hay una especie del gnero Clusia sp. Esta familia se caracteriza por
sintetizar compuestos poli-fenlicos (Lavaud et al., 2012).
2.3.3.6 Familia Costaceae
Esta familia se conoce comnmente como Jengibre espiral; es originaria

de frica y contiene 4 gneros, de los cuales Costus tiene el mayor nmero
de especies (Kay et al., 2005) y 130 de ellas estn distribuidas en las
27
regiones tropicales . En Colombia hay 35 especies (Salinas et al., 2007).Se
caracteriza por la presencia de saponinas, flavonoides, esteroides y
alcaloides (Britto et al., 2011 ).
2.3.3.7 Familia Euphorbiaceae
La familia Euphorbiaceae cuenta con especies de importancia econmica por

estar conformada por plantas productoras de aceites (Ricinus), ltex
(Hevea, Mabea, Sapium), almidn (Manihot), madera (Hura, Hyeronima) y
especies ornamentales (Euphorbia plucherrima) . Comprende 300 gneros y
6000 especies alrededor del mundo. En Colombia existen 75 gneros y 438
especies (Rangel, 2006); en el PRNU hay 10 especies (CARDER, 2012 )
mientras que la RNB-LP se caracteriza por especies del gnero Hyeronima
sp y Croton sp. Los metabolitos secundarios encontrados en esta familia son
antraquinonas, tri-terpenos, cidos grasos epoxidados, cidos grasos
insaturados y agentes antitumorales; alcaloides del tropano, indol, quinolina,
piridina y aporfina (Trease, 2009).
2.3.3.8 Familia Lamiaceae
Es una familia de plantas altamente desarrollada. Dada la variabilidad de la

estructura de sus miembros, es difcil establecer un procedimiento para
clasificarlas. Se le atribuyen aproximadamente 220 gneros y 4000
especies en el mundo pero se encuentra mejor representada en la regin del
Mediterrneo y Asia. En Colombia, hay unas 110 especies; el gnero Hyptis
cuenta con 44 especies de hierbas y arbustos; y Salvia con 85 taxones
reconocidos (Fernndez, 2010); El PRNU contiene 9 especies (CARDER, 2012
), mientras que la RNB-LP presenta especies del gnero Aegiphila sp. Los
metabolitos secundarios encontrados normalmente en esta familia son los
28
terpenoides, especialmente los del tipo sesqui, di y tri terpnos; adems de
varios tipos de compuestos fenlicos, especialmente cidos fenlicos, como
el cido rosmarnico y flavonoides (Wink, 2003).
2.3.3.9 Familia Lauraceae
La familia Lauraceae est conformada por 52 gneros y 3000 especies, la

mayora se encuentran en regiones tropicales y subtropicales clidas
(Takaku et al., 2007); en el PRNU existen 6 especies (CARDER, 2012 ),
mientras que en la RNB-LP hay especies del gnero Aniba sp, Ocotea sp y
Persea sp. Los fito-compuestos que se encuentran en esta familia son
alcaloides de la aporfina y bencil-isoquinolina, lignanos del tipo furofurano y
di-hidro-benzo-furanos (Coy and Cuca, 2008); adems de neo-lignanos biciclo
[3.2.1] octnicos (Coy et al., 2009), aceites voltiles, aceites fijos y
flavonoides glucosidados (Trease, 2009).
2.3.3.10 Familia Malvaceae
Las plantas de la familia Malvaceae comprende 250 gneros y 4230 especies

que estn distribuidas en todo el mundo. Particularmente, son muy
abundantes en las zonas tropicales de Sur (Oliveira da Silva et al., 2010) . En
Colombia hay 140 especies (Galeano and Bernal, 1993); en el PRNU existen 2
especies: Pavonia pseudotyphalaea Linden & planchon y Sida rhombifolia L
(CARDER, 2012 ). Los metabolitos secundarios encontrados en esta familia
son cidos polifenlicos, flavonoides y antocianinas (Chen et al., 2003).
29
2.3.3.11 Familia Melastomataceae
Esta familia es una de las ms abundantes y biodiversas en los trpicos, pero

sus relaciones intrafamiliares y la evolucin morfolgica son poco conocidas.
Comprende entre 150 - 166 gneros y 4570 especies (Clausing and Renner,
2001). En Colombia existen 68 gneros y 974 especies (Rangel, 2006); en el
PRNU existen 31 especies (Galeano and Bernal, 1993). La fitoqumica de la
familia Melastomataceae es poco conocida; sin embargo, los metabolitos
secundarios encontrados comnmente son los taninos hidrolizables y
condensados (Yoshida et al., 2008).
2.3.3.12 Familia Passifloraceae
Las plantas de la familia Passifloraceae son muy conocidas en los bosques

tropicales de Amrica del sur (Matsui et al., 2010). Comprende 12 gneros y
600 especies (Trease, 2009) alrededor del planeta. En Colombia hay 2
gneros (Galeano and Bernal, 1993) y 167 especies, siendo el gnero
Passiflora el ms importante con 162 especies (Prez et al., 2007); en el
PRNU existen 7 especies (CARDER, 2012 ) y en la RNB-LP hay especies del
gnero Passiflora sp. Los fito-constituyentes de esta familia son:
flavonoides, trazas de glucsidos cianognicos, aceites voltiles y alcaloides
del tipo harmano (Trease, 2009)
2.3.3.13 Familia Piperaceae
La familia Piperaceae es fuente de muchos fito-compuestos biolgicamente

activos, con un gran potencial en medicina y agricultura (Scott et al., 2005);
esta familia est conformada por 4000 especies (Lpez et al., 2010).
30
Colombia posee 7 gneros y 604 especies (Rangel, 2006); el PRNU tiene 23
especies (CARDER, 2012 ). Los metabolitos secundarios encontrados en esta
familia son: steres y teres fenlicos, alcaloides del tipo pirrolidina,
aceites voltiles y lignanos (Trease, 2009).
2.3.3.14 Familia Solanaceae
Las plantas de la familia Solanaceae son de gran importancia econmica en

las industrias farmacutica y de alimentos. Comprende alrededor de 96
gneros y 3000 especies. En Colombia hay 42 gneros y 402 especies
(Rangel, 2006); el PRNU existen 39 especies (CARDER, 2012 ) y en la RNB-
LP hay especies del gnero Solanum sp. Las plantas de esta familia producen
una amplia variedad de metabolitos segundarios como alcaloides del tropano,
piridina y alcaloides esteroidales, witanolidos, ecdi-esteroides, sesqui-
terpnos, di-terpnos y antraquinonas (Wink, 2003).
2.3.3.15 Familia Urticaceae
Comprende 45 gneros y 550 especies distribuidas en regiones tropicales y

subtropicales alrededor del mundo (Vargas, 2002). En Colombia existen 100
especies (Galeano and Bernal, 1993); en el PRNU 13 especies (CARDER, 2012
). Los metabolitos secundarios reportados en esta familia son: alcaloides
fenantro-quinolizidnicos, antraquinonas, flavonoides y terpenoides (Cai et
al., 2006). Son utilizadas en medicina natural en combinacin con otras
especies para el tratamiento de la hiperplasia benigna de la prstata
(Trease, 2009).
31
3.JUSTIFICACIN
Varios estudios ampliamente citados, han estimado que los daos econmicos
y ambientales causados por especies invasoras en cultivos agrcolas en
Estados Unidos tienen un costo entre 97 US$ - 137 US$ millones y en el
resto del mundo puede tener un estimativo de 1.5 US$ billones de dlares
por ao (Abhilash and Singh, 2009); adems de que el uso de los pesticidas
es de dos millones de toneladas anuales. En Colombia se usan
aproximadamente 40.000 toneladas anuales por un valor de 23.000 millones
de pesos (Jaramillo et al., 2007).
Las compaas farmacuticas y grupos de investigacin enfocados en el

campo de la biotecnologa, estn tratando de reformar el paradigma del
cribado aleatorio a un diseo racional que considere el uso de los compuestos
de origen natural, los cuales son un modelo probado para el descubrimiento
y desarrollo de nuevos frmacos, agroqumicos, cosmticos, compuestos
qumicos puros, nutracuticos (McChesney et al., 2007).
Los Botnicos estiman que el nmero de plantas superiores en el planeta

puede estar entre 300.000 y 320.000 especies; slo un porcentaje muy
pequeo de estas ha sido investigado por las propiedades de sus fito-
constituyentes; es una fuente que no ha sido explorada y aprovechada lo
suficiente (Powell, 2009).
Esto puede demostrarse con los porcentajes de ingredientes activos en

plaguicidas aprobados por la EPA (Enviromental Protection Agency) desde el
ao 1997 al 2010 como se muestra en la tabla 6.
32
Tabla 6. Ingredientes activos de plaguicidas y bioplaguicidas aprobados por
la EPA (Enviromental Protection Agency) desde 1997 al 2010
DESCRIPCIN DEL TIPO DE FUENTE PORCENTAJE
Compuestos sintticos 78%

Compuestos naturales con modificaciones hemi-sintticas 15%
Compuestos de origen microbiano 1%
Compuestos de origen natural 6%
Como se observa en la tabla 6, es evidente que el uso de los pesticidas de

origen sinttico predomina como un producto de alto impacto para los
agricultores.
Las plantas son fuente de fito-compuestos variables estructuralmente con

un amplio rango de actividades biolgicas, que podran ser tiles para el
desarrollo de una terapia alternativa o adyuvante de muchas enfermedades
(Zhang et al., 2013), pero tambin es fuente de biocompuestos con
aplicacin en el rea de la agricultura en la bsqueda de metabolitos con
posible actividad anti-alimentaria (Vatanparast et al., 2012)
La inhibicin de la -Glucosidasa (-GLC) est asociada a diferentes

actividades biolgicas como anti-alimentaria en animales herbvoros
(Vatanparast et al., 2012), anti-cncer y anti-metsica (Borges de Melo et
al., 2006), anti-hiperglicemica (Ha et al., 2012) y anti-viral (VIH) (Moorthy
et al., 2011); convirtindose en objeto de investigacin por abarcar distintas
areas a nivel farmacolgico y a nivel ambiental.
Teniendo en cuenta la biodiversidad de plantas de la Ecorregin Cafetera

Colombiana (Guevara et al., 2009) y la abundancia de metabolitos
secundarios y fito-compuestos (Nio et al., 2002; Nio et al., 2003), se
propone investigar las condiciones experimentales del mtodo fotomtrico
para la evaluacin de la actividad inhibitoria -Glucosidasa (-GLC) in vitro
en extractos vegetales con el objetivo de evaluar dichos extractos y
33
encontrar fito-compuestos que puedan convertirse en una posible
alternativa que pueda ser utilizado en un biopreparado para el control de
plagas basado en este mecanismo de inhibicin. Este estudio ampliara el
conocimiento de la flora de la Ecorregin Cafetera Colombiana.
34
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL
Definir las condiciones experimentales del mtodo fotomtrico para la

evaluacin de la actividad inhibitoria -glucosidasa (-GLC) in vitro en
extractos vegetales.
4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS
Obtener los extractos de n-hexano, diclorometano y metanol de 36

especies de plantas seleccionadas de las familias: Annonaceae,
Apocynaceae, Asclepiadaceae, Asteraceae, Clusiaceae, Costaceae,
Euphorbiaceae, Lamiaceae, Lauraceae, Malvaceae, Melastomataceae,
Passifloraceae, Piperaceae, Solanaceae y Urticaceae de la Ecorregin
Cafetera Colombiana.
Caracterizar los metabolitos secundarios seleccionados presentes en

los extractos crudos de n-hexano, diclorometano y metanol por
Cromatografa de Capa Delgada (CCD).
Proponer las condiciones experimentales del mtodo

espectrofotomtrico para evaluar la actividad inhibitoria de la -
Glucosidasa (-GLC) in vitro en extractos vegetales.
35
SECCIN EXPERIMENTAL
5.1 MATERIALES
5.1.1 Equipos y reactivos
Los solventes orgnicos empleados fueron de grado analtico: acetato de

etilo, diclorometano, iso-propanol, n-hexano y metanol analtico, marca
Mallinckrodt; con excepcin de los solventes utilizados en la obtencin de los
extractos crudos, los cuales fueron de grado comercial, marca Carlo Erba.
En la obtencin de los extractos se utiliz un rotaevaporador Heidolph
Laborata 4000 (Alemania).
En la Caracterizacin Fitoqumica por Cromatografa de Capa Delgada (CCD),

los reactivos empleados para la preparacin de los reveladores y patrones
utilizados fueron de las marcas Merck y Sigma-Aldrich. Las cromatoplacas
utilizadas fueron de slica gel 60 F254 20x20 cm, Merck (Alemania) y una
lmpara ultravioleta Elma LC-30H (Alemania).
5.1.2 Material vegetal
En la tabla 7, se presentan los nombres cientficos de las plantas

recolectadas en la Reserva Natural Bremen-La Popa (RNB-LP) y el Parque
Regional Natural Ucumari (PRNU) y junto con su voucher de identificacin
(Cdigo del Herbario de la Universidad de Antioquia, FJR).
36
5.2 MTODOS
5.2.1 Obtencin de los extractos crudos
La extraccin del material vegetal se realiz mediante maceracin pasiva con

los solventes n-hexano, diclorometano y metanol, respectivamente, siguiendo
la metodologa descrita por Nio et al., (2007) como se presenta en el anexo
1. La mayora de los extractos ya haban sido obtenidos por trabajos previos.
Tabla 7. Nombres cientficos de las especies de plantas estudiadas en el

proyecto.
Familia Especies N UTP FJR

Annonaceae Guatteria petiolata 198 4052
Apocynaceae Mandevilla veraguensis 200 4054
Asclepiadaceae Blepharodon grandifolium 201 4055
Calea angosturana 95 4046
Clivadium asperum 191 4045
Asteraceae Clivadium funkise 89 3909
Munnzonia hastifolia 190 4044
Pentacalia americana 96 3916
Chrysoclamys floribunda 180 4035
Clusiaceae
Vismia laevis 184 4039
Costaceae Costus sp 187 4029
Acalypha diversifolia 62 3726
Acalypha macrostachya 196 4050
Alchornea grandis 202 4056
Euphorbiaceae
Hyeronima antioquiensis 85 3905
Hyeronima Macrocarpa Mll 104 3925
Mavea montana 92 3912
Lamiaceae Salvia scutellarioides 186 4041
Ocotea insulares 176 4031
Ocotea paulii 179 4034
Lauraceae
Nectandra acutifolia 177 4032
Nectandra lineatifolia 178 4033
37
Malvaceae Pavonea septioides 181 4036
Miconia sp 73 3739
Melastomataceae
Tibouchina lepidota 185 4040
Passiflora danielii 182 4037
Passifloraceae
Passiflora rubra 183 4038
Piper calceolarium 194 4048
Piperaceae Piper crassinervium 175 4030
Piper danielli-gonzalezii 197 4051
Browalia speciosa 171 4025
Deprea glabra 170 4024
Solanaceae Solanum brevifolium 174 4028
Solanum sp 189 4043
Solanum trachycyphum 188 4042
Urticaceae Phenax uliginosus 143 3990
5.2.2 Caracterizacin fitoqumica por cromatografa de capa delgada

(CCD)
Los extractos crudos plantas poseen una mezcla compleja de fito-

compuestos que proceden de su metabolismo primario y secundario (Trease,
2009) por lo tanto, en la caracterizacin de los ncleos fitoqumicos, es
importante encontrar un sistema de solventes que permita una buena
separacin de los fito-componentes ya que de esto depende su deteccin.
Los sistemas de solventes utilizados para la elucin de los tres tipos

extractos estudiados, fueron encontrados siguiendo la metodologa descrita
previamente por Jaramillo, (1987), los cuales se muestran en la tabla 8.
38
Tabla 8. Sistemas de elucin utilizados en la caracterizacin fitoqumica por
CCD.
Polaridad del sistema

Extracto Sistema de elucin
(P)
n-Hexano-Acetato de etilo
n-Hexano 0.989
(77:23)
Cloroformo -Acetato de etilo-Isopropanol
Diclorometano 4.382
(82:17:1)
Cloroformo-Acetato de etilo- Isopropanol
Metanol 4.392
(90:7:3)
Con el propsito de caracterizar los metabolitos secundarios presentes en

los extractos (n-hexano, diclorometano y metanol) de las 36 plantas que
estudiaron en este proyecto, se realiz la marcha fitoqumica por
cromatografa de capa delgada (CCD) siguiendo la metodologa descrita por
(Wagner and Bladt, 1996) como se muestra en el anexo 2, usando criterio
de deteccin, la formacin de manchas las cuales se compararon con
patrones cuando estas fueron reveladas con un reactivo qumico adecuado
para cada tipo de ncleo estudiado.
La presencia o ausencia del fito-compuesto analizado, se determin

mediante la observacin de una coloracin o fluorescencia, a la luz del da o
haciendo uso de la lmpara ultravioleta (=240 nm y =360 nm).
Por ejemplo, para la deteccin de cumarinas y quinonas se us como

revelador qumico KOH al 5% en etanol absoluto, seguido de la observacin
en luz ultravioleta a 360 nm; la 7-hidroxicumarina como patrn de cumarinas
y de antraquinona como patrn de quinonas. Los metabolitos secundarios, los
reveladores, los patrones y los criterios de deteccin de los fito-
compuestos caracterizados en este proyecto, se presentan en las tablas 9 y
10.
39
Tabla 9. Patrones, reveladores y criterios de deteccin de metabolitos secundarios usados en la
caracterizacin fitoqumica por cromatografa de capa delgada (CCD).
Metabolitos secundarios Patrn (300 ppm) Revelador Caracterstica de la mancha Referencia

Alcaloides Papaverina Dragendorff Naranja
KOH al 5% en
(Harborne, 1998)
Cumarinas 7-Hidroxicumarina etanol absoluto Azul o blanco fosforescente
(UV 254 - 360 nm)
-Estradiol,
Esteroides y/o saponinas
Diosgenina, Verde, amarillo o azul
esteroidales
Hecogenina, (Farnsworth,
Liebermann-
Esteroles, Di, tri, terpnos Colesterol, 1966)
Burchard Rosado o lila
y/o saponinas tri-terpnicas Lupeol,
Colesterol,
Esteroles Amarillo plido o gris
Estigmasterol,
Flavonoides: auronas,
AlCl3 al 1% en
catequinas, chalconas, Apigenina y
metanol analtico (Ver tabla 10)
flavonas, flavonoles, Naringenina,
(UV 360 nm)
Flavononas e isoflavonas
Negro o azul para taninos
Taninos: hidrolizables y/o
cido Glico y hidrolizables y compuestos
compuestos fenlicos; o FeCl3
Kaempferol fenlicos; caf o verde para
taninos condensados
taninos condensados (Harborne, 1998)
KOH al 5% en
Naranja, amarillo, rojo, vinotinto,
Quinonas Antraquinona etanol absoluto
morado y caf
(UV 360 nm)
(Wagner and
Sesquiterpenlactonas Digitoxina Kedde Violeta, morado o vinotinto
Bladt, 1996)
40
Tabla 10. Caractersticas de absorcin en luz ultravioleta (360 nm) de los
diferentes tipos de flavonoides (Farnsworth, 1966).
RECONOCIMIENTO DE FLAVONOIDES USANDO COMO REVELADOR CLORURO DE

ALUMINIO AL 1% SEGUIDO DE LA OBSERVACIN EN LUZ UN A 360 nm
TIPO DE FLAVONOIDE REGIN VISIBLE REGIN UV (360 nm)
Caf
Naranja fluorescente
Auronas Amarillo plido
Rosado
Amarillo-Blanco
Catequinas Incoloro Azul plido
Incoloro
Amarillo Naranja fluorescente
Chalconas Naranja Caf
Amarillo-Naranja Rosado
Verde fluorescente
Flavonas Amarillo plido Amarillo
Caf
Amarillo o verde fluorescente
Flavonoles Amarillo
Amarillo o verde fluorescente

Flavononas Incoloro
Azul-Blanco
Isoflavonas Incoloro Amarillo fluorescente
6. RESULTADOS Y DISCUSIN
Para el anlisis de resultados obtenidos en este proyecto, se sigui el esquema que

se muestra en la figura 16, en el cual se observan las etapas que se desarrollaron
teniendo en cuenta los objetivos especficos planteados en este estudio.
41
Obtencin de Caracterizacin Condiciones experimentales del mtodo
Extractos fitoqumica por fotomtrico para la evaluacin de la
Vegetales cromatografa de actividad inhibitoria -Glucosidasa
capa delgada (CCD) (-GLC) en extractos vegetales
n-Hexano Alcaloides Caractersticas ptimas Variables en el

Abundancia
Diclorometano Cumarinas de ensayos de tamizaje desarrollo del mtodo
Esteroides Relativa de
Metanol en productos naturales Fotomtrico para
Esteroles Metabolitos
Flavonoides secundarios evaluacin de la
Quinonas Actividad inhibitoria
Taninos -Glucosidasa (-GLC)
Saponinas
-Tipo de muestra
-Fuente de la -Glucosidasa -Actividad inhibitoria
-Seleccin del sustrato (p-Nitrofenil--D-
(% de inhibicin)
glucopiransido) -Perfil de los inhibidores
-pH y temperatura del ensayo
-Cofactores METODOLOGA
-Concentracin de la solucin buffer
-Concentracin de la -Glucosidasa (-GLC)
-Concetratracin del sustrato -Formato del ensayo
-Tiempo de duracin del ensayo -Relacin seal/ruido
-Solubilidad de los reactivos
Figura 16. Etapas desarrolladas durante la ejecucin del proyecto.
42
6.1 OBTENCIN DE LOS EXTRACTOS CRUDOS
A continuacin en la tabla 11, se encuentran los valores de las masas de los

extractos crudos de n-hexano, diclorometano y metanol obtenidos a travs de
maceracin pasiva y concentradas a 50C siguiendo la metodologa de Nio et al.,
(2007).
Tabla 11. Masas de los extractos crudos de n-hexano, diclorometano y metanol

obtenidas por maceracin pasiva.
MASAS DE EXTRACTOS CRUDOS OBTENIDOS POR MACERACIN PASIVA (g)

NOMBRE CIENTFICO n-Hexano Diclorometano Metanol
Guatteria petiolata 2,3142 17,2717 10,1374
Mandevilla veraguensis 7,5838 5,9912 17,6008
Blepharodon grandifolium 8,0466 5,1797 10,9138
Calea angosturana 3,5635 5,8709 8,2776
Clivadium asperum 1,5581 3,5513 6,6557
Clivadium funkise 7,2534 5,4337 10,6985
Munnzonia hastifolia 7,2215 5,5685 8,1138
Pentacalia americana 6,0284 6,2498 7,749
Chrysoclamys floribunda ----- 8,1444 7,2008
Vismia laevis 3,8123 2,8488 7,7866
Costus sp ---- 1,8381 19,0775
Acalypha diversifolia 4,279 5,469 22,178
Acalypha macrostachya 6,2319 5,8346 6,503
Alchornea grandis 2,227 3,159 14,058
Hyeronima antioquiensis 4,8124 4,3338 18,3213
Hyeronima Macrocarpa Mll 21,5953 ---- ----
Mavea montana 8,0815 5,4216 28,9335
Salvia scutellarioides 4,5364 6,7065 15,3539
Ocotea insulares 3,3898 4,1877 6,5223
Ocotea paulii 6,8258 6,6573 20,6937
Nectandra acutifolia 12,2728 14,8267 27,8171
Nectandra lineatifolia 8,9025 12,6264 38,0924
43
Pavonea septioides 3,3173 3,3879 7,0045
Miconia sp ---- ---- ----
Tibouchina lepidota 2,984 3,7096 12,427
Passiflora danielii 2,1085 0,9999 12,7491
Passiflora rubra 2,3365 1,7581 19,2893
Piper calceolarium 5,254 10,2006 12,2128
Piper crassinervium 14,2375 36,9265 25,9078
Piper danielli-gonzalezii 4,8979 13,1173 11,5188
Browalia speciosa 3,6596 4,409 24,7426
Deprea glabra 1,0034 ---- ----
Solanum brevifolium 4,1119 6,7074 20,6981
Solanum sp 3,1360 3,5578 13,3046
Solanum trachycyphum 12,987 6,720 11,695
Phenax uliginosus 1.8973 6,9708 35,2439
Estos extractos crudos se utilizaron en la caracterizacin fitoqumica por

cromatografa de capa delgada (CCD).
6.2 CARACTERIZACIN FITOQUMICA POR CROMATOGRAFA DE CAPA

DELGADA (CCD)
La marcha fitoqumica por CCD determin los ncleos fitoqumicos presentes en

los extractos de n-hexano, diclorometano y metanol de las plantas evaluadas en
este trabajo recolectadas en las zonas de estudio, la Reserva Natural Bremen-La
Popa (RN-BLP) y el Parque Regional Natural Ucumar (PRNU) se muestran en el
anexo 3.
En la figuras 17, 18 y 19 se presentan los porcentajes de abundancia relativa de

metabolitos secundarios en los extractos vegetales de n-hexano, diclorometano y
metanol estudiados respectivamente en este proyecto.
44
ABUNDANCIA RELATIVA DE METABOLITOS SECUNDARIOS EN
EXTRACTOS VEGETALES DE n-HEXANO
97,22 97,22
100,00 88,89 91,67
80,00
60,00 52,78
47,22
30,56 33,33
40,00 27,78
22,22
20,00 11,11
2,78 2,78 0,00
0,00

extractos vegetales de n-hexano de plantas de la Ecorregin Cafetera Colombiana.
Con relacin a los resultados presentados en la figura 17, se pueden destacar los
siguientes aspectos:
La nica especie que present alcaloides en el extracto de n-hexano fue

Ocotea Paulii (Lauraceae). Existen reportes en la literatura de la presencia
de alcaloides del tipo bencil-iso-quinolina en especies del gnero Ocotea
(Coy and Cuca, 2009).
45
La presencia de esteroles, esteroides; di, tri, terpnos y saponinas
(esteroidales y tri-terpnicas) se evidenciaron de manera predominante en
todas las especies de plantas estudiadas; esto tiene concordancia con los
estudios realizados por (Zhou et al., 2008) indicando que los esteroles y
compuestos relacionados constituyen el 80% de las partes vegetativas de las
plantas, son insolubles en agua y se pueden extraer con solventes como n-
hexano y diclorometano. Esto explica la razn por la cual estos fito-
compuestos presentan altos porcentajes de abundancia relativa en este
trabajo.
Dentro de las especies de plantas estudiadas en este tipo de extracto,

Vismia laevis (Clusiaceae UTP 184, FJR 4039) se destac por la presencia de
varios tipo de flavonoides a diferencia de las especies Guatteria petiolata
(UTP 198, FJR 4052), Clivadium asperum (UTP 191, FJR 4045), Pentacalia sp
(UTP 96 , FJR 3916), Alchornea grandis (UTP 202, FJR 4056), Ocotea
insulares (UTP 176, FJR 4031), Tibouchina lepidota (UTP 185, FJR 4040),
Passiflora rubra (UTP 183, FJR 4038), Passiflora danielli-gonzalezii (UTP
197, FJR 4051), Piper calceolarium (UTP 194, FJR 4048), Piper
crassinervium (UTP 175, FJR 4030) y Piper danielii-gonzalezii (UTP 197,
FJR 4051) cuya presencia de flavonoides fue nula.
Todas las especies de plantas estudiadas en este proyecto evidenciaron la

presencia de quinonas en gran proporcin en los tres tipos de extractos
estudiados. El resultado anterior correlaciona los estudios de (Harborne,
1998) probando que las quinonas se distribuyen de manera cosmopolita en las
plantas superiores.
La nica especie estudiada en este proyecto que evidenci la presencia de

sesquiterpenlactonas fue Vismia laevis (Clusiaceae UTP 184, FJR 4039).
Existen reportes de lactonas en plantas de la familia Clusiaceae (Guimares
et al., 2013).
La presencia de taninos condensados fue predominante en la mayora de los

extractos de n-hexano ms no de taninos hidrolizables. Esto puede deberse
46
a la polaridad de este tipo de metabolitos, los taninos hidrolizables son de
naturaleza polar por lo tanto, no se detectaron en este tipo de extracto.
A continuacin, se presentan los porcentajes de abundancia relativa de metabolitos

secundarios en los extractos vegetales de diclorometano.

EXTRACTOS VEGETALES DE DICLOROMETANO
100,00 100,00 97,22

100,00
80,00
61,11 58,33
60,00 50,00
36,11
40,00 25,11 25,00 27,78
16,67 16,67
20,00
2,78 0,00
0,00

extractos vegetales de diclorometano de plantas de la Ecorregin Cafetera
Colombiana.
47
De la figura 18 se destacan los siguientes aspectos:
El extracto vegetal de diclorometano Phenax uliginosus (Urticaceae UTP

143, FJR 3990) no mostr la abundante presencia de los metabolitos
secundarios, como cumarinas, alcaloides, flavonoides, quinonas; los nicos
metabolitos que se evidenciaron en esta especie fueron di y tri-terpnos y
esteroles.
El contenido de quinonas y cumarinas de este tipo de extractos comparados

con los extractos de n-hexano, no evidenciaron grandes diferencias en los
porcentajes de estos dos tipos de metabolitos secundarios evaluados.
Segn la marcha fitoqumica de los extractos vegetales de diclorometano al

igual que en los extractos vegetales de n-hexano hubo presencia de
esteroles, esteroides y saponinas esteroidales, di-tri-terpnos y saponinas
tri-terpnicas. La especie Piper danielii-gonzalezii (Piperaceae UTP 197,
FJR 4051) evidenci la posible presencia de tri-terpnos y/o saponinas tri-
terpnicas. Actualmente, existen reportes de actividad anti-secretora, anti-
inflamatoria y anti-Helicobacter pylori en extractos vegetales del gnero
Piper (Qulez et al., 2010).
Cerca del 97% de la plantas de los extractos de diclorometano presentaron

taninos condensados y slo un porcentaje muy pequeo evidenci la
presencia de taninos hidrolizables y/o compuestos fenlicos
correspondiente al 21,78 %. La especie Piper danelli-gonzalezii (Piperaceae
UTP 197, FJR 4051) se destac por presentar taninos hidrolizables y
compuestos fenlicos.
El extracto vegetal de la especie Ocotea Paulii (Lauraceae UTP 179, FJR

4034) fue el nico que present alcaloides en los extractos vegetales de
diclorometano caracterizados. Las especies del gnero Ocotea se
caracterizan por presentar actividad anti-plaquetaria y anti-trombtica
(Ballabeni et al., 2007).
48
A continuacin se presentan los porcentajes de abundancia relativa en extractos
vegetales de metanol en la figura 19.

EXTRACTOS VEGETALES DE METANOL
100,000 100,000
94,444
100,000 86,111
77,778 75,000
80,000
60,000 47,222
40,000
22,222
20,000 11,111 11,111 11,111
5,556 5,556
0,000
0,000

extractos vegetales de metanol de plantas de la Ecorregin Cafetera Colombiana
Con base a la figura 19, se destacan los siguientes aspectos:
49
Los extractos vegetales de las especies (Melastomataceae Tibouchina
lepidota, UTP 185), y los miembros de la familia Solanaceae (Solanum
trachycyphum, UTP 189) y (Solanum sp, UTP 188) evidenciaron la posible
presencia de alcaloides en los extractos de metanol. Actualmente, no
existen reportes sobre la presencia de alcaloides en plantas de la familia
Melastomataceae. Las plantas de la familia Solanaceae contienen un gran
variedad de alcaloides tales como: alcaloides del tropano, proto-alcaloides;
alcaloides del tipo indol, iso-quinolina, purina, pirazol, piridina, pirrolidina,
quinazolidina, alcaloides esteroidales y gluco-alcaloides (Trease, 2009); las
especies del gnero Solanum se caracterizan por su alto contenido de
alcaloides esteroidales y del tropano (Eltayeb et al., 1997; Trease, 2009).
Los extractos que evidenciaron la mayor abundancia de Cumarinas fueron los

extractos de n-hexano 25,11% y metanol 47,11%. Dentro de las familias de
que manifestaron la presencia de cumarinas se encuentran la familia
Annonaceae, Apocynaceae, Asclepiadaceae, Clusiaceae, Costaceae,
Euphorbiaceae, Lauraceae, Melastomataceae, Piperaceae y Solanaceae.
Existen reportes de extractos crudos con gran abundancia de cumarinas en
las familias antes mencionadas y adems han sido evaluadas contra
Staphylococcus aureus (Yasunaka et al., 2005).
Segn la marcha fitoqumica, los extractos crudos de diclorometano (figura

18) y los extractos de metanol (figura 19) no evidencian la presencia de
Sesquiterpenlactonas.
Los extractos vegetales de las familias Annonaceae, Asteraceae y

Euphorbiaceae presentaron un amplio contenido de taninos hidrolizables y/o
compuestos fenlicos en contraste de los extractos vegetales de n-hexano.
Los compuestos fenlicos de origen vegetal son conocidos por su papel en la
calidad y seguridad alimentaria, puesto que contribuyen de manera
significativa al gusto, sabor, color y estabilidad de los alimentos. A su vez
que, se reconocen cada vez ms como factores importantes en la salud a
largo plazo, lo que ayuda a reducir el riesgo de enfermedades crnicas
(Arapitsas, 2012).
50
Los extractos vegetales que presentaron mayor contenido de flavonoides
fueron los extractos de metanol. Dentro de las familias de plantas de
estudio, las siguientes presentan una abundancia significativa de
flavonoides: Annonaceae, Asteraceae, Euphorbiaceae, Lauraceae y
Solanaceae. La importancia de estos metabolitos radica en que ayudan a
contrarrestar el efecto de los radicales libres que causan stress oxidativo
(Cook and Samman, 1996).
6.3 FORMATO DEL MTODO FOTOMTRICO PARA LA EVALUACIN DE

LA ACTIVIDAD INHIBITORIA -GLUCOSIDASA (-GLC)
Los aspectos importantes que se tendrn en cuenta en el diseo del mtodo

fotomtrico atendiendo la metodologa propuesta por Rahman et al., (2005).
Dentro de los aspectos que se deben tener en cuenta para el diseo del mtodo es
El formato del ensayo.
Un ensayo primario es un trabajo exploratorio donde se requiere evaluar muchos y

diferentes objetos de estudio, por esta razn se recomienda usar un equipo que
permita analizar muchas muestras como los lectores de microplaca.
Las ventajas de utilizar un espectrofotmetro con lector de microplacas (Biotek,

2012; vintessential, 2013):
El volumen de la muestra oscila entre 50 - 200 L
El nmero de pozos en las microplacas, permite distribuir del nmero de

muestras como lo requiera el ensayo y puede leer todos las absorbancias de
dichas muestras en el mismo periodo en que transcurra la reaccin. El
formato ms comn en los centros de investigacin es la microplaca de 96
pozos adems de que permite al menos leer tres longitudes de onda en un
slo ensayo.
Las muestras no requieren dilucin .
51
Se pueden ensayos de cuantificacin de ADN y ARN, ensayos de protenas,
ensayos de enzimas, ensayos de cintica, ensayos inmunolgicos, ensayos de
proliferacin y citotoxicidad de clulas, ensayos de Apoptosis y ensayos de
GPCR.
Para los ensayos primarios de la actividad inhibitoria -Glucosidasa in vitro, se

recomienda el uso de microplacas de fondo plano fabricadas en poliestireno
transparente (Liu et al., 2011).
6.4 VARIABLES IMPORTANTES EN EL DISEO DEL MTODO

FOTOMTRICO PARA LA EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA
DE LA -GLUCOSIDASA (-GLC) in vitro
Las variables que se deben tener en cuenta para desarrollo del mtodo
fotomtrico se muestran a continuacin siguiendo la metodologa de (Rahman et al.,
2005):
La fuente de la -Glucosidasa (-GLC) y seleccin del sustrato.
El pH y la temperatura del ensayo.
La concentracin final de la -Glucosidasa (-GLC) en el ensayo.
La concentracin final del p-Nitrofenil--D-glucopiransido (p-NFGP) en el

ensayo.
El tiempo de duracin del ensayo.
La solubilidad de los reactivos en el momento del ensayo.
Perfil de los inhibidores enzimticos.
A continuacin se describirn las variables del mtodo fotomtrico para evaluar la

actividad inhibitoria -Glucosidasa (-GLC) in vitro siguiendo la metodologa
descrita por Rahman et al., (2005).
52
6.4.1 La fuente de la -Glucosidasa (-GLC)
Una de las consideraciones importantes para el desarrollo del mtodo fotomtrico

para evaluar la actividad enzimtica, es la seleccin de una fuente viable de la
enzima (Rahman et al., 2005). La -Glucosidasa puede ser aislada de diferentes
organismos (Yamamoto et al., 2004); sin embargo, no siempre comparten las
mismas caractersticas como su especificidad por el sustrato y condiciones de
experimentacin (Ota et al., 2009). En la tabla 12, se presentan las diferentes
clases de -Glucosidasas (-GLC) disponibles comercialmente.
Tabla 12. Clases de -Glucosidasas (-GLC) disponibles comercialmente y sus

caractersticas.
Familia pH
Especificidad
Nmero de ptimo Temperatura
Organismo por el Fabricante Referencia
EC glucsido de (C)
sustrato
hidrolasa trabajo
Aspergillus niger 3.2.1.20/3 II 31 4.5 40 Sigma- (Kim et al.,

Aldrich 2005),
Bacillus (Tagami et
stearothermophilus 3.2.1.20 I 13 6.8 37 Megazyme al., 2013)
(Henrissat
and
Candida Bairoch,
tsukubaensis 3.2.1.20 II 31 2.4-4.8 55 1993),
(Kinsella et
Sigma- al., 1991)
Aldrich
Saccharomyces
(Kim et al.,
cerevisiae I 13 6.8 37
2005)
3.2.1.20 (Nakai et
Oryza sativa III 31 4 37
al., 2007)
Rhizopus sp. (Chen et
-- 15 6 37 Merkmillipore
al., 2012)
53
Maltasa de
(Frandsen
levadura
I 13 6.4-6.8 40 Megazyme et al.,
(Saccharomyces
2002)
cerevisiae)
El objetivo principal de este proyecto al obtener las variables de esta metodologa

es la bsqueda de compuestos que puedan ser usados como posibles inhibidores de
las enzimas hidrolticas en los insectos y disear un biopreparado. Por lo general,
estos organismos presentan alrededor de 5 enzimas para degradar la celulosa y el
almidn de las plantas; entre ellas, la -Glucosidasa II (-GLC II) (Watanabe et al.,
1997); por lo tanto las enzimas aisladas de Aspergillus niger y Candida
tsukubaensis. Estas enzimas deben ser almacenadas entre 0-4C.
6.4.2 Seleccin del sustrato
Como se mencion anteriormente, los sustratos recomendados para estudiar la

actividad cataltica de las glucsido hidrolasas, son glicsidos de mono y di-nitro-
fenoles debido a su fcil deteccin por espectrofotometra UV-Visible; en el
diseo del mtodo fotomtrico para la evaluacin de la actividad inhibitoria de la
-Glucosidasa (-GLC) in vitro, el sustrato recomendado es el p-Nitrofenil--D-
glucopiransido (p-NFGP) (Cihan et al., 2010).
Es muy importante tener en cuenta que p-Nitrofenil--D-glucopiransido es

susceptible de hidrolisis bsica, adems de que debe ser conservado a una
temperatura de -20C.
6.4.3 El pH y la temperatura del ensayo
El pH y la temperatura del mtodo fotomtrico para la evaluacin de la actividad

inhibitoria -Glucosidasa (-GLC) in vitro, estn en funcin de las condiciones de
54
pH ptimo y temperatura donde sea ms estable y se evidencie su mxima
actividad enzimtica (Rahman et al., 2005). La Glucosidasa tipo II (-GLC II) se
obtendr comercialmente por lo tanto, el ensayo se llevar a cabo de acuerdo a las
condiciones de pH y temperatura ptimas establecidas por el fabricante como se
muestra en la tabla 13.
Tabla 13. Condiciones experimentales de temperatura y pH ptimas para el ensayo

de acuerdo a las recomendaciones establecidas por el fabricante.
Fuente de la
-Glucosidasa II pH ptimo de
Temperatura Fabricante
(-GLC II) trabajo
EC 3.2.1.20
4.5 40
Aspergillus niger
Sigma Aldrich
Candida tsukubaensis 4.8 55
6.4.4 Concentracin de la solucin buffer
Como se expuso anteriormente, el pH ptimo de trabajo de la -Glucosidasa tipo II

(-GLC II) es 4.8. sin embargo, la actividad enzimtica es dependiente de la
concentracin salina de la solucin buffer (Rahman et al., 2005). Para cumplir dicha
condicin, es importante usar la concentracin adecuada de sal y del cido dbil
con el objeto de que la reaccin de hidrlisis catalizada por accin de la -
Glucosidasa (-GLC) se realice exitosamente.
55
Figura 20. Actividad enzimtica de la polifenol oxidasa en funcin de la
concentracin de la solucin buffer pH 5 (Cestari et al., 2002).
De igual manera que los ensayos realizados por (Cestari et al., 2002) (figura 20),
se propone evaluar la -Glucosidasa tipo I (-GLC) (pH ptimo=6.8) a diferentes
concentraciones de la solucin buffer fosfato como son 20, 40, 60, 80, 160 y 200
mM como lo sugiere (Guo et al., 2010) frente a la actividad enzimtica. Se debe
tener en cuenta la relacin seal/ruido.
6.4.5 La concentracin de la -Glucosidasa (-GLC) en el ensayo
La concentracin final de -Glucosidasa (-GLC) es una variable importante en el

desarrollo del ensayo de evaluacin de actividad inhibitoria, el cual debe ser un
valor pequeo; sin embargo, debe generar un valor de la seal alto y de esta
manera el cociente obtenido de la relacin seal/ruido del ensayo tambin lo ser
(Rahman et al., 2005).
Segn reportes de la literatura, las concentraciones de -Glucosidasa (-GLC) del

mtodo fotomtrico para la evaluacin de la actividad inhibitoria de la -
56
Glucosidasa (-GLC) in vitro en extractos vegetales se muestran a continuacin en
la tabla 14.
Tabla 14. Concentraciones de -Glucosidasa (-GLC) utilizadas en ensayos

actividad inhibitoria en extractos crudos de plantas.
Fuente de la
Tipo de
-Glucosidasa I
Concentracin inicial extracto crudo
(-GLC I) usada Referencia
(U/mL) evaluado
en el ensayo de
actividad inhibitoria
Bacillus
0.5 U/mL Etanol (Kim et al., 2011)
stearothermophilus
Etanol-Agua
(Lordan et al.,
0.1 U/mL (8:2)
2013)
Etanol-Agua
(Rubilar et al.,
0.6 U/mL (5:5)
2011)
0.6 U/mL Acetona (Shai et al., 2010)

Saccharomyces
cerevisiae 1 U/mL Etanol (Wang et al., 2012)
Fracciones
obtenidas de
un extracto
(Damsud et al.,
0.1 U/mL crudo de
2013)
n-Hexano-
Acetato de etilo
(7:3)
Dadas las concentraciones de -Glucosidasas (-GLC) utilizadas en las metodologas

para la evaluacin de la actividad inhibitoria (-GLC) en los extractos vegetales, se
propone evaluar en el rango de concentraciones desde 0,2 U/mL a 1 U/mL de -
Glucosidasa tipo II (-GLC II) a las condiciones de temperatura y pH ptimas
recomendadas por el fabricante con las diferentes concentraciones de sustrato
57
con el objeto de hallar la relacin existente entre la actividad enzimtica de la -
Glucosidasa tipo I (-GLC I) y la concentracin de sustrato en la cual se debe
encontrar una relacin proporcional; al aumentar la concentracin de enzima, la
velocidad enzimtica tambin se incrementar (una respuesta lineal) en condiciones
de saturacin del sustrato. De acuerdo con los valores obtenidos se seleccionar
aquella concentracin de enzima que presente la mejor relacin seal/ruido (Guo et
al., 2010).
6.4.6 La concentracin final de p-Nitrofenil--D-glucopiransido (p-NFGP)

en el ensayo
En las reacciones enzimticas donde se catalice un solo sustrato, este debe

presentar una alta afinidad de interaccin con la enzima; es decir, un valor de Km
bajo lo que permitira el uso de bajas cantidades de sustrato en el ensayo, as como
proporcionar sensibilidad al ensayo para detectar los inhibidores que compiten con
el sustrato por el sitio activo de la enzima. Adems la reaccin enzimtica
proceder de manera ms rpida; en estudios fisiolgicos tienen mayor relevancia
aquellos donde el valor de Km sea bajo (Rahman et al., 2005).
La constante Km de la -Glucosidasa tipo II (-GLC II) puede ser determinada

experimentalmente usando como sustrato p-Nitrofenil--D-glucopiransido (p-
NFGP), evaluando la relacin lineal que existe entre el sustrato y la velocidad
inicial de la reaccin (1/2 Vm) (Rahman et al., 2005) como se muestra en las
figuras 14 y 15.
En el mtodo fotomtrico para la evaluacin de la actividad inhibitoria de la -

Glucosidasa (-GLC) in vitro, se recomienda escoger como concentracin de p-
Nitrofenil--D-glucopiransido (p-NFGP) un valor que incluya el valor de Km; al
usar un valor por debajo de este, el valor de la relacin seal/ruido disminuir;
aquellas concentraciones por encima del valor de Km, incrementar el valor de la
relacin seal/ruido, pero har que el ensayo no sea tan sensible cuando se
requiera detectar el perfil de los inhibidores enzimticos.
58
Por consiguiente se debe encontrar el equilibrio entre la relacin seal/ruido y la
sensibilidad del ensayo (Rahman et al., 2005). Esto tiene correlacin con los
estudios realizados por (Motabar et al., 2009) donde se evaluaron diferentes
concentraciones de un sustrato fluorogenico, 4-metil-umbelliferil--D-
glucopiransido (4-MUGP) frente a la -Glucosidasa (-GLC) y se encontr que el
valor de Km fue de 76 M; decidieron aumentar cuatro unidades el valor de Km
para saturar la enzima por ende, la concentracin escogida para el sustrato 4-
MUGP fue de 80M.
6.4.7 El tiempo de duracin del ensayo
El tiempo de incubacin es uno de los factores que habitualmente se investiga

cuando se desarrolla un mtodo para la determinacin de una alguna actividad
enzimtica. Normalmente la reaccin enzimtica se incrementa de manera lineal
con el tiempo de incubacin hasta un determinado momento en el que se pierde la
linealidad, lo que puede ocurrir debido a que la concentracin de sustrato es un
factor limitante o debido a la inhibicin por los productos de la reaccin
enzimtica.
De acuerdo con los reportes de la literatura, el tiempo durante el que la reaccin

es lineal vara enormemente dependiendo de la enzima que se trate (Garca et al.,
2003)
La incubacin de un ensayo enzimtico debe llevarse a cabo con base a la velocidad

inicial, donde la reaccin es de primer orden con respecto a la concentracin de
sustrato y tiene un comportamiento lineal normalmente el tiempo de reaccin varia
de 30 a 60 minutos (Rahman et al., 2005).
En estudios realizados de la actividad inhibitoria de la -Glucosidasa (-GLC) en

extractos de plantas, normalmente se encuentran dos periodos de tiempo: un
periodo de incubacin en el cual la -Glucosidasa (-GLC) se activa y un tiempo de
59
reaccin donde realiza la actividad de la hidrlisis enzimtica del sustrato p-
Nitrofenil--D-glucsido (p-NFGP).
Experimentalmente, se ha determinado que un periodo de incubacin para la -

Glucosidasa (-GLC) en un periodo de 40 minutos donde el tiempo de reaccin se
comporta de manera lineal frente a la actividad enzimtica; se considera que 10
minutos de tiempo de incubacin y 10 minutos de tiempo de reaccin, generan una
buena relacin de seal/ruido (Motabar et al., 2009).
6.4.8 La solubilidad de los reactivos en el momento del ensayo
En los ensayos de actividad inhibitoria de la -Glucosidasa (-GLC), la enzima, el

sustrato y los extractos a evaluar la actividad se disuelven en la misma solucin
buffer con el pH ptimo de la enzima con el objetivo de evitar cambios abruptos
que puedan afectar la estructura terciaria de la enzima (Staniszewski, 2009).
La solubilidad es un factor importante dado que en la medida en que los fito-

compuestos presentes en los extractos crudos se encuentren en solucin aumenta
la probabilidad de que la -Glucosidasa (-GLC) actu frente estos metabolitos y
conviertan en posibles inhibidores de la enzima .
Segn los estudios realizados por (Nurok et al., 1999) demuestran que los
disolventes hidroflicos, como el metanol pueden distorsionar la forma en que el
agua se asocia con la enzima y puede afectar negativamente la actividad
enzimtica, por lo tanto, no es recomendable solubilizar los extractos crudos de
plantas de n-hexano, diclorometano y metanol considerados en este proyecto en
sus respectivos solventes dado que puede afectar la medicin de la actividad
enzimtica y de inhibicin de la -Glucosidasa (-GLC).
Existen reportes en la literatura de la evaluacin de la actividad inhibitoria -

Glucosidasa (-GLC) en extractos de plantas In Vitro por fotometra como
extractos crudos de etanol (Kim et al., 2011), acetona (Deutschlnder et al., 2011),
metanol y diclorometano (Ranga Rao et al., 2009); y n-hexano (Rao et al., 2007)
60
usando como solvente, una solucin tampn de buffer fosfato, cuyo rango de viraje
en la escala de pH es de 6.3 7, prximos al pH ptimo de la -Glucosidasa (-
GLC).
6.4.9 El perfil de los inhibidores enzimticos
La inhibicin enzimtica es de gran importancia fisiolgica, ya que a veces la

inhibicin de una sola enzima que forma parte de una cadena de reacciones
metablicas puede inhibir por completo a todo el proceso metablico involucrado y
ejercer en esa forma un efecto profundo y a veces fatal sobre el organismo. La
importancia que este fenmeno tiene lugar en farmacologa y toxicologa as como
tambin, en el desarrollo de herbicidas e insecticidas. De ah que el estudio del
mecanismo de accin de los inhibidores se haya constituido en una de las ms
exploradas de la enzimologa prctica.
Es importante comprender el mecanismo por el cual los extractos vegetales

inhiben la enzima; la -Glucosidasa (-GLC) exhibe cintica de Michaelis-Menten y
por lo tanto, la descripcin de su mecanismo de inhibicin puede ser estudiado por
grficas de dobles recprocos (Kumar et al., 2013).
Como se mencion anteriormente, la acarbosa es un inhibidor de la -Glucosidasa

(-GLC) cuyo mecanismo de inhibicin es competitivo y se recomienda ser utilizado
para hallar el valor del IC50 con el objetivo de discriminar los extractos crudos con
actividad inhibitoria -Glucosidasa (-GLC) (Hasegawa et al., 2008), adems de ser
el control positivo para el ensayo del mtodo fotomtrico; la acarbosa se
comercializa con el nombre de Glucobay (Bayer, 100 mg) y puede ser extrada de
las tabletas como se describe en anexo 5 siguiendo la metodologa descrita por
(Cherkaoui et al., 1998).
61
6.5 Etapas del mtodo fotomtrico para la evaluacin de la actividad
inhibitoria -glucosidasa (-GLC) en plantas de la Ecorregin Eafetera
Colombiana (ECC)
La primera etapa del mtodo inicia con la distribucin de los diferentes tipos de
muestras en la microplaca de 96 pozos como se muestra en la figura 21.
Control negativo Patrones del extracto II

. Control positivo Control del extracto II
Blanco fotomtrico Patrones del extracto III
Pozos vacos Control del extracto III
Patrones del extracto I Patrones del extracto IV
Control del extracto I Control del extracto IV
Control del sustrato
Figura 21. Distribucin de los tipos de muestras en la microplaca de 96 pozos. En la

tabla se exponen los tipos de muestra estudiados en el proyecto
62
La metodologa del mtodo se presenta en la tabla 17.
Tabla 17. Metodologa del mtodo fotomtrico para la evaluacin de la actividad

inhibitoria -Glucosidasa (-GLC) en plantas de la Ecorregin Cafetera Colombiana .
METODOLOGA PARA LA EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA -GLUCOSIDASA (-GLC) EN

PLANTAS DE LA ECORREGIN CAFETERA COLOMBIANA
TIPOS DE MUESTRAS
Mezcla
Control
Control Control reaccionante Blanco Blanco del
del
negativo positivo -Glucosidasa fotomtrico extracto
sustrato
REACTIVOS (-GLC)
-GLC + + + - - -
Solucin de extracto a
evaluar la actividad - - + - - -
inhibitoria
Acarbosa - + - - - -
Buffer Fosfato
(pH=6.8) + + - + + +
Periodo de activacin de la -Glucosidasa (-GLC) a las condiciones de pH y temperatura ptimas por 10
minutos. Monitorear la reaccin cada minuto
p-NFGP + -
Periodo de reaccin enzimtica de la -Glucosidasa (-GLC) a las condiciones de pH y temperatura ptimas por
10 minutos. Monitorear la reaccin cada minuto
Solucin bsica
(Detiene la reaccin +
enzimtica)
Medir espectrofotomtricamente a 405nm
(-) No requieren del reactivo
(+) Requieren del reactivo.
63
Se debe tener en cuenta en el momento de calcular los volmenes de las muestras
que sern adicionadas a los pozos:
Las concentraciones iniciales y finales de las soluciones en la microplaca en

el momento de realizar los clculos.
La concentracin final no tiene en cuenta el volumen de la solucin que

detiene la reaccin enzimtica.
La capacidad mxima de los pozos (300 L).
Aquellas muestras que no requieran de la adicin de algn volumen de los

reactivos, se reemplazar por un volumen de solucin buffer fosfato
(pH=6.8). Por ejemplo, el control negativo contiene la enzima y el sustrato en
contraste del control positivo que contiene adicionalmente la acarbosa; en
ese caso, el volumen de acarbosa en el control negativo debe ser
reemplazado por volumen equivalente de solucin buffer fosfato (pH=6.8).
6.5.1 Ecuaciones para realizar los clculos de porcentajes de inhibicin y

actividad enzimtica.
Porcentajes de inhibicin de acuerdo a los trabajos realizados por (Shai et

al., 2010).
64
Velocidad enzimtica en funcin de la actividad enzimtica de acuerdos
a los estudios realizados por (Watanabe et al., 2013)
i a m n am z a a i nan
i i a nzim i a ( )
Dnde:
Coeficiente de extincin molar () del p-Nitrofenol= 18200 mol. L-1. cm-1
Distancia recorrida por la luz (d).
65
6.6 TRATAMIENTO ESTADSTICO DE LOS DATOS OBTENIDOS EN EL
MTODO FOTOMTRICO PARA LA EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD
INHIBITORIA DE LA -GLUCOSIDASA (-GLC) EN PLANTAS DE LA
ECORREGIN CAFETERA
Evaluar la actividad inhibitoria -Glucosidasa (-GLC) in vitro de los

extractos vegetales de cinco concentraciones iniciales: 30 ppm, 100 ppm,
300 ppm, 1000 ppm y 3000 ppm como se sugiere en la metodologa de
(Orhan et al., 2013).
Determinar el IC 50 como criterio de inhibicin frente a la -Glucosidasa

(Alexander et al., 1999), como base el IC50 de la acarbosa (30 ppm, 100 ppm,
300 ppm, 1000 ppm y 3000 ppm), la cual es un inhibidor de las -
Glucosidasas (- GLC) y de las -amilasas (-AML) usando el programa
Graphpad Prism.
Realizar el ensayo por triplicado en dos das diferentes.
Los valores de los datos se expresaran como media desviacin estndar
66
7. CONCLUSIONES
El anlisis de la actividad inhibitoria -Glucosidasa (-GLC) en muestras

multi-componente como los extractos vegetales, requiere del diseo de
un mtodo altamente sensible debido a la complejidad de la matriz.
Este proyecto plantea las variables requeridas para desarrollar el

mtodo fotomtrico para la evaluacin de la actividad inhibitoria -
Glucosidasa (-GLC) y que este pueda ser adaptado a diversas
investigaciones.
67
8. RECOMENDACIONES
Continuar con la aplicacin y ejecucin del mtodo fotomtrico para la

evaluacin de la actividad inhibitoria de la -Glucosidasa (-GLC) in vitro
en extractos vegetales, puesto que contribuye al conocimiento de flora
de nuestra regin, adems de que las actividades biolgicas asociadas
con la inhibicin de la -Glucosidasa (-GLC) como la actividad anti-
alimentaria en animales herbvoros, anti-hiperglicemica y anti-viral estn
relacionadas con problemticas farmacolgicas y ambientales a nivel
mundial y nacional como son el control de plagas, la bsqueda de nuevos
compuestos para combatir el VIH y la diabetes.
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88
ANEXOS
89
Anexo 1. Metodologa de la obtencin de los extractos crudos de n-hexano,
diclorometano y metanol (Nio et al., 2007).
Material vegetal
Secar el material vegetal en estufa a 50 C por 48 horas
Moler
Pesar 300g de material vegetal seco y molido
(Someter a extraccin por lixiviacin durante

48 horas con n-hexano) x3
Filtrar
Extracto de n-hexano Marco vegetal
(Extraer con diclorometano por

lixiviacin durante 48 horas) x3
Filtrar
Extracto de diclorometano Marco vegetal
(Extraer con metanol por

lixiviacin durante 48 horas) x3
Filtrar
Extracto de metanol Eliminar marco vegetal
Concentrar cada extracto en rotaevaporador a 50 C hasta sequedad
Almacenar los extractos crudos a -10C
90
Anexo 2. Procedimiento de la caracterizacin fitoqumica de los extractos
crudos por cromatografa de capa delgada (Wagner and Bladt, 1996).
Seleccione 5 plantas de estudio aleatoriamente y buscar las

mismas en cada tipo de extracto: n-hexano, diclorometano y
metanol y preparar una soluciones madre de 10000 ppm a
partir de sus extractos crudos
Encontrar el sistema de adecuado para cada tipo de

extracto
Mantener el Sembrar los extractos en cromatoplacas de slica gel

ambiente libre de 60 F254 (5 cm X 10 cm) junto con el patrn del ncleo
humedad usando fitoqumico que se requiera caracterizar
un secador
Eluir las respectivas cromatoplacas con el sistema de

solventes que se encontr para cada tipo de extracto
Revelar las placas (inmersin o spray) usando el

reactivo que permita la deteccin del ncleo
fitoqumico objeto de investigacin
Observar en luz ultravioleta (=254 nm

y =365 nm) en caso de ser necesario
91
Anexo 3. Resultados de la caracterizacin fitoqumica de los extractos crudos den-hexano, diclorometano y
metanol por CCD.
METABOLITOS SECUNDARIOS
ESTEROIDES
UTP EXTRACTO
FAMILIA ESPECIE Y/O DI-TRI-TERPNOS
N (10000 ppm) ALCALOIDES CUMARINAS
SAPONINAS Y/O SAPONINAS ESTEROLES
ESTEROIDALES TRI-TERPNICAS
n-Hexano - +++ ++ - +++
Guatteria
Annonaceae 198 Diclorometano - - - ++ ++
petiolata
Metanol - - ++ + +
Mandevila n-Hexano - - - ++ +++
Apocynaceae veraguensis 200 Diclorometano - - - ++ -
Metanol - +++ ++ + ++
Blepharodon n-Hexano - - - ++ -
Asclepiadaceae grandifolium 201 Diclorometano - - - ++ -
Metanol - - ++ + ++
Calea n-Hexano - ++ ++ - ++
angosturana 95 Diclorometano - - - ++ -
Metanol - - ++ ++ +
Clivadium n-Hexano - +++ ++ ++ ++
Asteraceae asperum 191 Diclorometano - - +++ ++ -
Metanol - - +++ ++ +
Clivadium sp n-Hexano - - - ++ ++
89 Diclorometano - - ++ ++ -
Metanol - ++ ++ + +
KOH al 5% en
Reveladores Dragendorff Liebermann- Burchard
etanol absoluto
7-Hidroxi
Patrones (300 ppm) Papaverina -estradiol, Colesterol, Diosgenina, Estigmasterol, Hecogenina, Lanosterol, Lupeol
cumarina
(-) Ausente (+)Presente (++)Moderado (+++)Abundante
92
Continuacin anexo 3:
ESTEROIDES
UTP EXTRACTO DI-TRI-TERPNOS
FAMILIA ESPECIE Y/O
N (10000 ppm) ALCALOIDES CUMARINAS Y/O SAPONINAS
SAPONINAS ESTEROLES
TRI-TERPNICAS
ESTEROIDALES
Munnzonia n-Hexano - - - ++ ++
190
hastifolia Diclorometano - - - +++ -
Asteraceae
Metanol - - +++ ++ +
n-Hexano - - - ++ ++
96
Pentacalia sp Diclorometano - - - ++ -
Metanol - - ++ + ++
Chrysoclamys n-Hexano - + +++ - +++
180
floribunda Diclorometano - - - ++ ++
Clusiaceae
Metanol - + + ++ ++
Vismia n-Hexano - ++ ++ ++ ++
184
laevis Diclorometano - - +++ ++ ++
Metanol - - ++ ++ ++
n-Hexano - ++ - ++ ++
187
Costaceae Costus sp Diclorometano - - - ++ -
Metanol - - + + +
n-Hexano - - ++ - ++
Acalypha
Euphorbiaceae 62 Diclorometano - + - ++ -
diversifolia
Metanol - - + ++ +
KOH al 5% en
etanol absoluto
7-Hidroxi
cumarina
93
METABOLITOS SECUNDARIO
ESTEROIDES
FAMILIA ESPECIE Y/O
SAPONINAS ESTEROLES
TRI-TERPNICAS
ESTEROIDALES
Acalypha n-Hexano - - ++ ++ +++
196
macrostachya Diclorometano - - ++ + -
Metanol - - ++ ++ ++
Alchornea n-Hexano - - ++ ++ +++
202
grandis Diclorometano - - +++ ++ -
Metanol - + + + +
Euphorbiaceae
n-Hexano - - ++ + ++
85
Hyeronima sp Diclorometano - - - ++ -
Metanol - + + + +
n-Hexano - ++ - ++ ++
104
Hyeronima sp Diclorometano - - - ++ ++
Metanol - + ++ + +
n-Hexano - - ++ + ++
92
Mavea sp Diclorometano - - ++ ++ -
Metanol - + + + ++
n-Hexano - - - ++ +++
Salvia
Lamiaceae 186 Diclorometano - - + + -
Scutellarioides
Metanol - - + + +
KOH al 5% en
etanol absoluto
7-Hidroxi
cumarina
94
ESTEROIDES
FAMILIA ESPECIE Y/O
SAPONINAS ESTEROLES
TRI-TERPNICAS
ESTEROIDALES
Ocotea n-Hexano - - - ++ ++
176
insulares Diclorometano - - ++ ++ ++
Metanol - + - + +
Ocotea n-Hexano +++ - - ++ ++
Lauraceae 179
paulii Diclorometano +++ - ++ ++ +
Metanol +++ - ++ ++ +
Nectandra n-Hexano - - ++ ++ ++
177
acutifolia Diclorometano - - - ++ ++
Metanol - + - ++ +
Nectandra n-Hexano - - - ++ ++
178
lineatifolia Diclorometano - - - ++ ++
Metanol - + - ++ +
Pavonea n-Hexano - - ++ ++ ++
Malvaceae 181
septioides Diclorometano - - ++ ++ ++
Metanol - - ++ ++ +
n-Hexano - - ++ ++ +
Melastomataceae Miconia sp 73 Diclorometano - - ++ ++ ++
Metanol - - - + +
KOH al 5% en
etanol absoluto
7-Hidroxi
cumarina
95
ESTEROIDES
FAMILIA ESPECIE Y/O
SAPONINAS ESTEROLES
TRI-TERPNICAS
ESTEROIDALES
Tibouchina n-Hexano - - ++ + ++
185
Melastomataceae lepidota Diclorometano - - ++ + ++
Metanol +++ + ++ ++ +
Passiflora n-Hexano - - - ++ +
182
danielii Diclorometano - - ++
Metanol - - - ++ +
Passifloraceae
Passiflora n-Hexano - - - ++ +
183
rubra Diclorometano - - ++ ++ ++
Metanol - - - ++ +
Piper n-Hexano - - - ++ +++
194
calceolarium Diclorometano - - - ++ ++
Metanol - + - + ++
Piperaceae Piper n-Hexano - - - +++ +++
175
crassinervium Diclorometano - - +++ ++ +
Metanol - + ++ + +
n-Hexano - + - ++ +
Piper danielii-
197 Diclorometano - + + ++ +
gonzalezii
Metanol - + ++ + +
KOH al 5% en
etanol absoluto
7-Hidroxi
cumarina
96
ESTEROIDES
FAMILIA ESPECIE Y/O
SAPONINAS ESTEROLES
TRI-TERPNICAS
ESTEROIDALES
Browalia n-Hexano - - +++ ++ +
171
speciosa Diclorometano - - ++ ++ +
Metanol - - - + +
Deprea n-Hexano - - + +++ -
170
glabra Diclorometano - - ++ +++ +
Metanol - + - + +
Solanaceae Solanum n-Hexano - - ++ ++ -
174
brevifolium Diclorometano - - ++ +++ +
Metanol - + - + ++
n-Hexano - - ++ +++ ++
189
Solanum sp Diclorometano - - ++ +++ +
Metanol ++ - - + +
Solanum n-Hexano - - +++ +++ -
188
trachycyphum Diclorometano - - ++ +++ +
Metanol ++ - - + ++
n-Hexano - - - ++ +
Phenax
Urticaceae 143 Diclorometano - - ++ ++ +
Uliginosus
Metanol - - - + +
KOH al 5% en
etanol absoluto
7-Hidroxi
cumarina
97
UTP EXTRACTO FLAVONOIDES
FAMILIA ESPECIE
N (10000 ppm) AURONAS Y/O FLAVONAS Y/O
CATEQUINAS FLAVONONAS ISOFLAVONAS
CHALCONAS FLAVONOLES
Guatteria n-Hexano - + + - +
198
Annonaceae petiolata Diclorometano - - + - -
Metanol - - ++ + -
Mandevila n-Hexano - - + - +
Apocynaceae 200
veraguensis Diclorometano - - - - -
Metanol - - +++ ++ ++
Blepharodon n-Hexano - - + - +
Asclepiadaceae 201
grandifolium Diclorometano - - - - -
Metanol - ++ ++ - -
Calea n-Hexano - - + - +
95
angosturana Diclorometano - - - - -
Metanol - - ++ + -
Asteraceae Clivadium n-Hexano - +++ - ++ -
191
asperum Diclorometano - - - - -
Metanol - - ++ + +
n-Hexano - - - + -
Clivadium sp 89 Diclorometano - - - - -
Metanol ++ - ++ - -
Reveladores AlCl3 al 1% en etanol absoluto
Patrones (300 ppm) Apigenina, Narigenina
98
T
FAMILIA ESPECIE
Munnzonia n-Hexano - - - + -
190
hastifolia Diclorometano - - ++ + -
Asteraceae
Metanol ++ - ++ + +
n-Hexano - - - - -
96
Pentacalia sp Diclorometano - - - - -
Metanol + - + + +
Chrysoclamys n-Hexano - - - - -
180
floribunda Diclorometano - - ++ + +
Clusiaceae
Metanol - - ++ ++ ++
Vismia n-Hexano +++ +++ +++ +++ -

184
laevis Diclorometano - - - - -
Metanol ++ - + + -
n-Hexano - ++ - ++ -
Costaceae 187
Costus sp Diclorometano - - - - -
Metanol - - ++ - -
n-Hexano - - - - -
Acalypha
Euphorbiaceae 62 Diclorometano - - ++ + -
diversifolia
Metanol - - ++ - -
99
FAMILIA ESPECIE
Acalypha n-Hexano - - - - -
196
macrostachya Diclorometano - - - - -
Metanol - - ++ + +
Alchornea n-Hexano - - - - -
202
grandis Diclorometano - - + ++ +
Euphorbiaceae Metanol - - ++ + +
n-Hexano - - - - -
85
Hyeronima sp Diclorometano - - + - -
Metanol - - + + +
n-Hexano - - - - -
104
Hyeronima sp Diclorometano - - +++ ++ +
Metanol - - + + +
n-Hexano - - - - -
92
Mavea sp Diclorometano - - ++ ++ ++
Metanol - - + + +
n-Hexano - - - - -
Salvia
Lamiaceae 186 Diclorometano - - - - -
scutellarioides
Metanol - - + + +
100
METABOLITOS SECUDARIOS
FAMILIA ESPECIE
Ocotea n-Hexano - + + - -
176
insulares Diclorometano - - ++ + -
Metanol - - ++ + +
Ocotea n-Hexano - + + - -
179
paulii Diclorometano ++ ++ ++ ++ +
Metanol - - ++ - +
Lauraceae
Nectandra n-Hexano - + + - -
177
acutifolia Diclorometano ++ + ++ - +
Metanol - - ++ + +
Nectandra n-Hexano - + ++ - -
178
lineatifolia Diclorometano ++ + + - -
Metanol - - ++ + +
Pavonea n-Hexano - - - - -
181
Malvaceae septioides Diclorometano - - - - -
Metanol - - + - +
n-Hexano - - + - -
Melastomataceae Miconia sp 73 Diclorometano - - - - -
Metanol ++ ++ ++ + +
101
FAMILIA ESPECIE
Tibouchina n-Hexano - +++ ++ - -
Melastomataceae 185
lepidota Diclorometano +++ - ++ + ++
Metanol - - + + +
Passiflora n-Hexano - - ++ + +
182
danielii Diclorometano - - - - -
Passifloraceae Metanol - - + + +
Passiflora n-Hexano - - ++ + +
183
rubra Diclorometano - - + - -
Metanol - - + + +
Piper n-Hexano +++ - + ++ +
194
calceolarium Diclorometano - - + + -
Metanol + + - - -
Piper n-Hexano ++ ++ +++ ++ +++
Piperaceae 175
crassinervium Diclorometano - ++ +++ ++ +++
Metanol + + + +++ +
Piper n-Hexano ++ ++ +++ ++ +++
197
danielii- Diclorometano ++ + ++ + +
gonzalezii Metanol + - + + +
(-)Ausente (+)Presente (++)Moderado (+++)Abundante
102
FAMILIA ESPECIE
Browalia n-Hexano - - + ++ -
171
speciosa Diclorometano - - - - -
Metanol - ++ + +
Deprea n-Hexano - - - - -
170
glabra Diclorometano - - - - -
Solanaceae Metanol - - ++ + +
Solanum n-Hexano - - - - -
174
brevifolium Diclorometano - - - - -
Metanol - - ++ + +
n-Hexano - - + - -
189
Solanum sp Diclorometano ++ ++ +++ - -
Metanol - - + + +
Solanum n-Hexano - - - ++ +
188
trachycyphum Diclorometano - - - - -
Metanol - - +++ + +
Phenax n-Hexano - - - - -
143
Urticaceae uliginosus Diclorometano - - - - -
Metanol - - - - -
103
UTP EXTRACTO TANINOS
FAMILIA ESPECIE
N (10000 ppm) QUINONAS SESQUITERPENLACTONAS
CONDENSADOS HIDROLIZABLES
Guatteria n-Hexano +++ - + -

Annonaceae 198
petiolata Diclorometano +++ - ++ -
Metanol +++ - - ++
Mandevila n-Hexano +++ - - -
Apocynaceae 200
veraguensis Diclorometano +++ - + +
Metanol +++ - - ++
Blepharodon n-Hexano +++ - + -
Asclepiadaceae 201
grandifolium Diclorometano +++ - ++ -
Metanol +++ - - ++
Calea n-Hexano ++ - + -
95
angosturana Diclorometano + - ++ -
Metanol ++ - - ++
Asteraceae
Clivadium n-Hexano +++ - + -
191
asperum Diclorometano +++ - ++ -
Metanol +++ - - ++
n-Hexano ++ - + -
Clivadium sp 89
Diclorometano ++ - + -
Metanol ++ - - ++
KOH al 5% en
Reveladores Kedde FeCl3 al 5% en HCl 0.5 N
etanol absoluto
Patrones (300 ppm) Antraquinona Digitoxina cido glico, Kaempferol
104
FAMILIA ESPECIE
Munnzonia n-Hexano +++ - + -

190
hastifolia Diclorometano +++ - + -
Asteraceae
Metanol +++ - - ++
n-Hexano ++ - ++ -
96
Pentacalia sp Diclorometano ++ - ++ -
Metanol ++ - - ++
Chrysoclamys n-Hexano +++ - ++ -
Clusiaceae 180
floribunda Diclorometano +++ - ++ -
Metanol +++ - - -
Vismia n-Hexano +++ +++ ++ -

184 - ++
laevis Diclorometano +++ ++
Metanol +++ - - -
n-Hexano +++ - + -
187
Costaceae Costus sp Diclorometano +++ - + +
Metanol +++ - - -
Acalypha n-Hexano +++ - ++ -
62
Euphorbiaceae diversifolia Diclorometano +++ - ++ +
Metanol +++ - - +++
KOH al 5% en
etanol absoluto
105
FAMILIA ESPECIE
Acalypha n-Hexano +++ - ++ -

196
macrostachya Diclorometano +++ - ++ ++
Metanol +++ - - ++
Alchornea n-Hexano +++ - ++ -
202
grandis Diclorometano +++ - ++ +++
Metanol +++ - - ++
Euphorbiaceae n-Hexano ++ - ++ -
85
Hyeronima sp Diclorometano ++ - ++ -
Metanol ++ - - ++
n-Hexano +++ - ++ -
104 Diclorometano +++ ++ -
Hyeronima sp -
Metanol +++ - - +++

n-Hexano +++ - ++ -
92
Mavea sp Diclorometano +++ - ++ +
Metanol +++ - - +++
Salvia n-Hexano +++ - + -
Lamiaceae 186
scutellarioides Diclorometano +++ - + -
Metanol +++ - - +
KOH al 5% en
etanol absoluto
106
FAMILIA ESPECIE
Ocotea n-Hexano +++ - ++ -

176
insulares Diclorometano +++ - ++ -
Metanol +++ - + -
Ocotea n-Hexano - - ++ -
179
paulii Diclorometano +++ - ++ -
Lauraceae Metanol +++ - + -
Nectandra n-Hexano ++ - ++ -
177
acutifolia Diclorometano ++ - ++ -
Metanol ++ - - +++
Nectandra n-Hexano ++ - ++ -
178 Diclorometano ++ ++ -
lineatifolia -
Metanol ++ - - +++
Pavonea n-Hexano ++ - +++ -
181
Malvaceae septioides Diclorometano ++ - +++ -
Metanol ++ - - +
n-Hexano ++ - ++ -
Melastomataceae 73
Miconia sp Diclorometano ++ - ++ +
Metanol ++ - - +
KOH al 5% en
etanol absoluto
107
FAMILIA ESPECIE
Tibouchina n-Hexano +++ - +++ -

185
Melastomataceae lepidota Diclorometano ++ - +++ -
Metanol +++ - - ++
Passiflora n-Hexano +++ - ++ -

182
danielii Diclorometano +++ - ++ -
Metanol +++ - - -
Passifloraceae
Passiflora n-Hexano ++ - ++ -
183
rubra Diclorometano ++ - ++ -
Metanol ++ - - ++
Piper n-Hexano +++ - ++ -

194 Diclorometano ++
calceolarium - ++ -
Metanol +++ - - ++
Piperaceae
Piper n-Hexano +++ - ++ -
175
crassinervium Diclorometano +++ - ++ -
Metanol +++ - - ++
Piper n-Hexano +++ - +++ -

197
danielii- Diclorometano +++ - +++ +++
gonzalezii Metanol ++ - - ++
KOH al 5% en
etanol absoluto
108
FAMILIA ESPECIE
Browalia n-Hexano +++ - ++ -

171
speciosa Diclorometano +++ - ++ +
Metanol +++ - - +
Deprea n-Hexano +++ - ++ -
170
glabra Diclorometano ++ - ++ -
Metanol +++ - - +
Solanum n-Hexano ++ - ++ -
Solanaceae 174
brevifolium Diclorometano ++ - ++ -
Metanol ++ - - +
n-Hexano + - ++ -
189
Solanum sp Diclorometano + - ++ -
Metanol + - - +
Solanum n-Hexano ++ - +++ -
188
trachycyphum Diclorometano ++ - +++ -
Metanol ++ - - +
Phenax n-Hexano + - + -
Urticaceae 143
uliginosus Diclorometano + - + +
Metanol + - - +
KOH al 5% en
etanol absoluto
109
Anexo 4. Clculo de la relacin seal ruido (Skoog et al., 2008)
( ) ( )
Donde:
n es el nmero de repeticiones del ensayo.
es la media de las absorbancias a 400 nm.
S es la desviacin estndar de las absorbancias a 400 nm.
110
Anexo 5. Extraccin de la acarbosa a partir de pastillas de Glucobay 100 mg
de Bayer (Cherkaoui et al., 1998).
Pulverizar finamente cinco

tabletas de Glucobay
Disolver en 25 mL de agua
desionizada
Sonicar por 15 minutos

Realizar tres
veces este
Homogenizar en un vortex en procedimiento
intervalos de 5 minutos
Centrifugar
Sobrenadante Almidn
Aforar a 100 mL con

agua desionizada
Filtrar usando una

membrana de 0.2 m
Concentrar a 40 C
Almacenar a -10 C
111
Anexo 6. Clculo de los porcentajes de abundancia relativa de metabolitos
secundarios en los extractos vegetales evaluados.
Ejemplo: A continuacin se presentan los cromatoplacas donde fueron

sembrados 36 extractos vegetales de metanol, el metabolito que se va a
caracterizar son las cumarinas usando como revelador hidrxido de sodio al 5%
en etanol, seguido de la observacin en luz ultravioleta a 360 nm. La presencia
de este tipo de compuestos se caracteriza con la aparicin de fluorescencias
blancas y azules como se muestra en la figura 22.
Figura 22. Caracterizacin de cumarinas en extractos de metanol. (Revelador:

KOH al 5%, observar en luz ultravioleta).
El clculo del porcentaje de abundancia relativa (%AR) se calcula de siguiente

manera:
112

Glucosidasa

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EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA DE LA - GLUCOSIDASA

(-GLC) in vitro POR EXTRACTOS VEGETALES

IVONNE MELISSA AVELLANEDA ORTIZ

UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE PEREIRA

ESCUELA DE TECNOLOGA QUMICA

IVONNE MELISSA AVELLANEDA ORTIZ

Requisito parcial para optar al ttulo de Qumico Industrial

DIRECTOR DEL PROYECTO

OSCAR MARINO MOSQUERA MARTNEZ

Universidad Tecnolgica de Pereira

UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE PEREIRA

ESCUELA DE TECNOLOGA QUMICA

EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA DE LA - GLUCOSIDASA

IVONNE MELISSA AVELLANEDA ORTIZ

Con la connotacin: __________________.

Para la constancia firmamos en la ciudad de Pereira hoy 20 de Noviembre de

Oscar Marino Mosquera Martnez

Juan Carlos Seplveda Arias

A Dios, por estar siempre de mi lado.

A mi abuelo, Vicente Avellaneda eres un ejemplo a seguir, un gran orgullo

A Juan Manuel Gordillo Gonzlez, Rubiela Vlez, Janet y Aaron

A todos los miembros de mi familia, por ayudarme de alguna u otra

A mis profesores, especialmente Oscar Marino Mosquera y Jaime Nio

A mis compaeras y compaeros del grupo GB-PN, por quienes tengo

A mi amigo de carrera, Andrs Mauricio Arias Gonzlez porque siempre

A la Universidad Tecnolgica de Pereira.

TABLA DE CONTENIDO ................................................................................................. I

NDICE DE TABLAS ....................................................................................................... V

NDICE DE FIGURAS ................................................................................................. VII

NDICE DE ANEXOS ...................................................................................................... X

2.1 HIDROLASAS ..........................................................................................................3

2.1.1 Aspectos Bsicos ..................................................................................................3

2.1.2 Distribucin y funcin de las -Glucosidasas (-GLC) en los seres

2.1.3 Clasificacin de las -Glucosidasas (-GLC) .................................................6

2.1.3.1 Clasificacin de las -Glucosidasas (-GLC) segn la Unin

2.1.3.1.1 Mecanismos de hidrolisis de las glicsido hidrolasas ..........................7

2.1.3.2 Clasificacin de las -Glucosidasas (-GLC) segn su especificidad

2.1.3.3 Clasificacin de las -Glucosidasas (-GLC) segn la secuencia de

2.1.4 Actividades biolgicas asociadas con la inhibicin de las -

2.1.5 Los inhibidores de las -Glucosidasas (-GLC).......................................... 12

2.5.1.2 Inhibidores de las -Glucosidasas (-GLC) con actividad anti-

2.1.5.3 Inhibidores de la -Glucosidasa (-GLC) de origen natural y de

2.1.6 Los mtodos para la evaluacin de la actividad inhibitoria de la -

2.1.6.1 Fundamento del mtodo fotomtrico para la evaluacin de la

2.1.6.2 Sustratos utilizados en el estudio de la actividad enzimtica

2.2 VARIABLES DE LA CINTICA DE UNA ENZIMA ................................... 21

2.3 ZONAS DE ESTUDIO ....................................................................................... 23

2.3.1 Reserva Natural Bremen-La Popa (RNB-LP) ............................................. 23

2.3.2 Parque Regional Natural Ucumar (PRNU) ................................................ 24

2.3.3 Familias de plantas de estudio ..................................................................... 25

2.3.3.1 Familia Annonaceae ....................................................................................... 25

2.3.3.2 Familia Apocynaceae .................................................................................... 26

2.3.3.3 Familia Asclepiadaceae .............................................................................. 26

2.3.3.4 Familia Asteraceae....................................................................................... 27

2.3.3.5 Familia Clusiaceae ......................................................................................... 27

2.3.3.6 Familia Costaceae ......................................................................................... 27

2.3.3.7 Familia Euphorbiaceae ................................................................................. 28

2.3.3.8 Familia Lamiaceae ......................................................................................... 28

2.3.3.9 Familia Lauraceae ......................................................................................... 29

2.3.3.10 Familia Malvaceae ....................................................................................... 29

2.3.3.12 Familia Passifloraceae ............................................................................... 30

2.3.3.13 Familia Piperaceae ...................................................................................... 30

2.3.3.14 Familia Solanaceae....................................................................................... 31