oor GONSULTORIA AMBIENTA! NORMA ABNT NBR BRASILEIRA 15469 Primeira edigao 19.03.2007 Valida a partirde 19.04.2007 —_— Ecotoxicologia aquatica — Preservagao e preparo de amostras ‘Aquatic ecotoxicology ~ Preservation and handling of samples Palavras-chave: Ensaio de toxicidade. Amostra. Preservagao, Prepare. Descriptors: Toxicily test. Sample. Preservation. Handling. fos 13.020.40 ISBN 978-85-07-00345-8, mae sina cic some GN se eres TECNICAS 7 paginas ‘@ABNT 20071212014) 10 509491 Impresso: DA -07.074.499/0001-08 (Pet NSULTORIA AMBIENTAL L Pi Exem ABNT NBR 15469:2007 © ABNT 2007 Todos 0s direitos reservados. A menos que especiicado de outro modo, nenhuma parte desta publicagao pode ser reproduzida 04 por qualquer meio, eltiénico ou mecainico, incluinde fotocépia @ microfime, sem permissao por escrio pela ABNT. Sede da ABNT Au-Treze de Malo, 13 -28° andar 20031-001 - Rio de Janeiro - RU Fel: + 55 21 3974-2800 Fax: + 85 21 2220-1762 abn @abot org br ‘ww art. org. br Impeesse no Brasil (®ABNT 2007 - Todos os cteitos reservados16 (Pedid 508491 Impresso! 1 < usivo - RHIZOBIUM CONSU ABNT NBR 15469:2007 Sumario Pagina Profécio.. a seis 2 Terms ¢ dofinigdes... : 3 Coleta 34 Gondigdes gerais. I 3.2 Recipientes de coleta.............. we 2 4 Preservagio e validade da amostra.... 3 5 Preparo da amostra.. 3 54 Condigdes gerais 3 52 Aguas ofluentes... “3 53 Produtos quimicos. a oa 54 — Fracdo soltivel em agua (FSA). A 55 Fragio dispersa om agua (FDA).. 4 58 Fragio particulada suspensa (FPS), 4 57 Frag&o acomodada em agua (FAA) A 58 Sedimentos $ 5.81 Amostra integral. 8 58.2 Agua intersticlal “5 583 Elutriato 3 59 Solo... 5 59.1 Amostra integral i" 592 Elutriato. 6 Bibliogratia wat @ABNT 2007 - Todos 08 direitos reservados1.49910001-08 (Pedido 509491 Impresso: 11/12/2014) 130 exclusive - RHIZOBIUM CONSULTORIA AMBIENTAL LTDA - 07:0 ABNT NBR 15469:2007 = Prefacio ‘A Associagéio Brasileira de Normas Técnicas (ABNT) ¢ o Férum Nacional de Normalizagao. As Normas Brasileiras, cujo conteudo € de responsabilidade dos Comités Brasileiros (ABNT/CB), dos Organismos de Normalizacio Setoral (ABNT/ONS) e das Comissées de Estudo Especiais Temporarias (ABNT/CEET), so elaboradas por Comissées de Estudo (CE), formadas por representantes dos setores envolvidos, detas fazendo parte: produtores, consumidores ¢ neutros (universidades, laboratérios @ outros). AABNT NBR 15469 foi elaborada pela Comissao de Estudo Especial Temporaria de Andlises Ecotaxicoldgicas (CEET-00:001.44). O Projeto circulou em Consulta Nacional confoome Edital n° 12, de 29.12.2006, com o numero de Projeto 00:007.44-004. ‘QABNT 2007 - Todos os dees reservadosFAL LTDA -07.071, MBIEN TORIA NORMA BRASILEIRA ABNT NBR 15469:2007 aquatica — Preservacdo e preparo de amostras 1 Escopo 4.4 Esta Norma estabelece os procedimentos para preservacao e preparo de amostras a serem ulilizadas em ensaios ecotoxicolégicos. Condigdes especificas sao descritas nas normas dos respectivos ensaios. 1.2. Esta Norma se aplica @ amostras soluvels ou pouco soldveis em agua, tais como: aguas, efluentes, sedimentos, solos, residuas sdlidos, fuidos, produtos quimicos, dleos e seus derivados, 2. Termos e definigdes Para os efeitos deste documento, aplicam-se os seguintes termos definigoes abaixo se aplicam, ‘gua ullizada no ensaio de ecotoxicidade 22 gua intersticial gua que ocupa os espacos entre as particulas sélidas do sedimento 23 gua processada agua com condutividade menor que 10 uS/om,apés tratamento por destilacdo, desionizacéo ou ultrapurificagso, 24 amostra volume ou massa definides, tals como: égua- continental (superficial, subterrénea ou intersticiall, agua do mar ‘ou estuarina (superficial ou intersticial), efluentes, sedimentos, solos, residuos s6lidos, fluidos, produtos quimicos, 6leos e seus derivados 25 amostra integral de sedimento ou solo poredo da amostra que mantém suas caracteristicas fisicas originais, jo submetida a tratamentos prévios 26 elutriato solugdo aquosa obtida apés adigéio de um liquido extrator a uma amostra de sedimento ou solo, 27 fracdo acomodada em agua (FAA) solugo aquosa de uma substancia de baixa miscibilidade em Agua, contendo a fraco dissolvida, suspensa elou emulsificada, preparada individualmente para cada solugao-teste 28 fracao dispersa em égua (FDA) solugdo aquosa de uma amostra de baixa miscibilidade em gua, dispersa mecanicamente [@ABNT 2007 Todos 08 eos reservados09481 lmpresso: 11/12/2014) TORIA AMBIENTAL LTDA -07.071.493/0001-08 (Pedigo 8 ABNT NBR 15469:2007 29 fraco particulada suspensa (FPS) solugao aquosa obtida apos adigao de 4gua a uma amosira de fluido de perfuragéo. 2.40 fragao soliivel em agua (FSA) solugao aquosa de uma amostra de baixa miscibildede em aqua, obtida apés procedimento de extragao com agua 3 Coleta 3.1 Condigées gerais 3.4.1 Elaborar um plano de amostragem e separar o material pertinente ao trabalho proposto, de acordo com ‘tipo de amostra, 3.4.2 Antes da manipulaco da amostra, € recomendavel o levantamento das suas caracteristicas fisicas, ‘quimicas e toxicolégicas, de modo a serem observados os cuidados necessérios. 3.1.3 Os técnicos envolvidos com o trabalho devem estar equipados com equipamentos de protegao individual (EP) adequados, 3.1.4 Para a coleta e armazenamento da amostra deve ser utlizado material que nao interfira no resultado do ensaio, 3.1.5 Para amostras liquidas © de sedimento, os recipientes devem ser totalmente preenchidos para minimizar 2 presenga de ar 3.4.8 No processo de obtengéo da amostra, 30 requisites minimos os seguintes registros: identificagao ‘numérica ou nominal da amosira; data e hora de coleta; tipo ¢ caracteristicas da amostra: quando pertinente, allocalizagio geagréfica (longitude ¢ latitude) ¢ identificagdo do ensaio a que se destina. 3.4.7 Para preservacdo e validade das amostras, ver tabela 1 NOTA Acescolhia do equipamento mais apropriado para a coleta deve seguir a ABNT NBR 2898. 3.2 Recipientes de coleta 3.24 Ostipos de recipientes adequados esto descritos na tabela 1 3.22 Os recipientes de video utlizados para armazenar a amostra devem ser descontaminados previamente com algum dos seguintes produtos quimicos: Acido cloridrice, Acido sulfirica, acido nittioo, hidroxido de s6dlio, detergentes, etanol, éter de petroleo ou acetona. Apés a utlizagao dos produtos, o enxagtie com aqua de abastecimento piblico e agua processada deve ser efetuado para garantir a remogao total dos agentes de limpeza 3.2.3 Os recipientes plasticos utiizados para armazenar a amostra devem ser descartados apés 0 uso. 3.2.4 Para amostras nao liquidas, utilizar, preferencialmente, frascos de boca larga ou sacos plasticos para faclitar 0 manuseio. 3.2.5 Vedar os recipientes corretamente e veriticar possiveis vazamentos. 2 [BABI 2007 - Todos os drettos reservadosABNT NBR 15469:2007 4 Preservagao e validade da amostra {As informagdes sobre tempo e preservagao das amostras estéo descatas na tabela 1, sendo que o tempo entre a coleta eo ensaio deve ser o minimo possivel olégicos ‘Tabela 1 — Preservacao e validade de amostras para ensaios ecoto: | Validade da " Aguas eefuentes | Vidro ou plastica ‘som congelamento escongolamento a amesta nao pade ser recongelada, ‘Congelar abaixo do — 10°C aié 48 h apés a coleta 60 dias viaro ou pisstico Manter abaivo de 10°C, ‘Aamostra no dove sor | Sedineios, soles | Yeo plstoo fs Searumeaee Sebel ou | MENT Soncreno | 288 Sgn | Morr aan do 16 aan | Recamenda eno conga | ‘sem congelamento, _| amostra em vidro. Apés 0 | ‘Agua inerstcial Video ou pléstco an mosis em vito. Apds a | CSrguarsatoes—rorc] aon |caeeeeamenaa | Nao realizar 0 ensaio caso a ‘amesira apresente pontos pretos e ador de H:5 (Idicativos de amostra degradada) Fluidos de —Vidro‘ou plstico | Manter abaixo de 10°C, perfuragao ‘de boca larga ‘sem congelamerto sales ; No preenche taente 0 Cleo devados | Vo Preservar ire 10°C | ingofnida_|recpont, Pode ser ubtzado vdeo Stra ou incor 20 sig da. Na auséncia de informagaes do | 7 Soguir as informagses do. | ,S°8UN8? | fabricante, preservar em ambiente | Produtos quimicos Vidro ou plastica ee inforngio do | Sue, ot ern ent | 40°C @ 30°C, . [NOTA No coso de congelamento de amostms liqudas Ge 0 reciplonte estver compelamenta precnchida, & nevessano homagenizar fe dosprecar ima paquena quantdade da amosta para evar a rptura do recipiente 5 Preparo da amostra 5.1 Condigdes gerais ‘A manipulagao da amostra deve ser efetuada em local com temperatura ambiente entre 10°C @ 30°C. 2 5.2 Aguas ¢ efluentes 5.24 Homageneizar a amostra antes de ullizé-la no ensaio ecotoxicalégico, 5.2.2 Amosiras com materiais em suspensao podem ser submetidas @ decantagao em recipiente coberto. Apds esse processo, utlizar 0 sobrenadante para o ensaio ecotoxical6cico. 5.2.3. Aamosira pode ser fitrada para a remogdo de organismos predadores ou competidores, [EABNT 2007 Todos os tres reservadosPedido 508491 Impresso: 11/12/20 Z 5 e é z z para uso exe ABNT NBR 15469:2007 5.3. Produtos quimicos Produtos com baixa solubilidade podem ser dissolvidos ou dispersos utilizando ultra-som, solventes (por exemplo, dimetiformamida, acetona, alcool isopropilice, acetonitria) ou dispersantes, desde que a maior concentragdo utilizada nao cause efeito téxico aos organismos ullizades no ensaio. 5.4 Fragao soluvel em agua (FSA) 5.4.1 _Colocar em um recipiente de vidro, conterido um bastéo magnético, um volume apropriado na proporcéo. de uma parte de amostra para nove partes da agua de diluigao a ser utiizada no ensaio (1:9) NOTA Adicionar ao recipiente primeiro o bastéo magnético, em seguida a gua e por timo @ amostra 54.2 Tampa a boca do recipiente com aigodao envolto em gaze. 5.4.3 Colocar o recipiente sobre o agitador magnético e ajustar a velocidade de agitagao de forma que o vortex formado ngo ullrapasse 25% da altura da coluna de liquido. 5.4.4 Manter 0 recipiente ao abrigo da luz e em agitaggo por 20 h. 5.4.5 Apds 0 término da agitagao, deixar em repouso por 1 h. Em seguida drenar somente a fase aquosa. 5.4.6 Manter o extrato recolhide sob agitagdo lenta, no agitador magnético, durante a retirada das aliquotas necessarias ao ensaio ecotoxicalégico. 5.5 Fracao dispersa em agua (FDA) 5.5.1 Colocar em um recipiente um volume apropriado de agua de diluigéo e adicionar a amostra para obter a concentragao de 1 000 mg/L ou outra desejada. Agitar em agitador de hélice fixa por § s apés adicao da amostra, na velocidade de 12.000 rpm a 14 000 rpm. 5.5.2 Manter o extrato sob agitagao lenta durante a retirada das aliquotas necessarias ao ensaio ecotoxicoldgico. 5.6 Fragdo particulada suspensa (FPS) 5.6.1 Agitar a amostra de fluido de perfuracao na velocidade de 1500 rpm, por 30 min, utilizango agitador de hélice movel 5.6.2 Transferir uma aliquota da amostra para um recipiente graduado @ adicionar agua de diluicao na proporgéo de uma parte de amostra para nove de agua de diluigao. 5.6.3 Posicionar a hélice do agitador no centro do recipiente, a uma cisténcia aproximada de 1 cm do fundo e agitar a 150 rpm por § min, Durante a agitagao, 0 pH da mistura deve ser ajustado para + 0,2 unidade do pH da agua de diluigao, 5.6.4 Deixar 0 exirato decantar por 1h. Apés esse periodo, retirar 0 sobrenadante, evitando ressuspender a fragao sedimentada, 5.6.5. Manter o extrato sob agitagdo lenta durante a retirada das aliquotas necessérias a0 ensaio ecotoxicatigico, 5.7. Frag acomodada em dgua (FAA) 5.7.1 Definir as solugdes-teste a serem utiizadas no ensaio ecotoxicol6gico. 5.7.2 Preparar cada solugSo-teste pesando diretamente as devidas quantidades da amostra e diluindo-ds com gua de diluicdo. 4 (@ABNT 2007 Todos os dreias reservadosIBIENTAL LTDA - 0 RHIZOBIUM CONSULTORI ABNT NBR 15469:2007 8.7.3 Manter cada solupao-teste sob agitago magnética por 30 min com velocidade suficiente para ressuspender 0 material 5.7.4 Deixar sedimentar por 1 h todas as solucdes-teste e retirar a fase aquosa de cada uma delas para ser utiizada no ensaio ecotoxicalégico. 5.8 Sedimentos O sedimento deve ser previamente homogeneizado antes do uso em uma das matrizes desoritas om 5.8.1 a 5.8.3. 5.8.1 Amostra integral A amostra nao deve ser peneirada para remogéo dos organismos nativos, a menos qué haja uma razao para supor que eles influenciarao a resposta do organismo-teste, coma no caso da presenca de organismos predadores e competidores. Materials sintéticos ou naturais, como galhos, folhas, entre outros, devem ser removidos. pds esse processo, ullizar a amostra para 0 ensaio ecotoxicolégico. Para a separagdo da agua intersticil, varios métodos estao disponiveis. Entre eles os mais utlizados séo a ccontrifugagao @ a suceao. 5.8.2.1 Centrifugacao A centriugacéio deve ser realizada no minimo a 2 000 x g* durante 30 min. Repetir a centrifugagao caso 0 sobrenadante permanega turvo, ou seja, com material em suspensao visivel. O volume sobrenadante deve ser Utlizado no ensaio ecotoxicolégica. 5.8.2.2 Suegio O sistema para sucgdo da agua do sedimento consiste er uma seringa ou bomba acoplada a um tubo com comprimenta varidvel que, inserido no sedimento na profundidade desejada, permite a sucgao manual cu por vacuo. Uma pedra porasa pode ser fixada na ponta do tubo para servir coma filtro de particulas. NOTA Esse procedimento pode ser realizado em campo ou em laboratéio. Apés a succao, centritugar a aqua obtida, conforme 5.8.2.1 5.8.3. Elutriato (© elutriato € obtido pela mistura de uma parte de sedimento e quatro partes de agua de diluigéo. A mistura é submetida a agitag4o por 30 min com velocidade suficiente para ressuspender 0 material. Apos a sedimentaco por 1 h, retirar 0 sobrenadante a ser utlizado no ensaio ecotoxicolégico. NOTA Seno howver a sedimentagdo do material, centriftugar 0 sobrenadante conforme 5.8.2.1 5.9 Solo ( solo deve ser previamente homogeneizado e seco em temperatura que ndo deve exceder 25°C antes do uso ‘em uma das matrizes de 6.9.1 € 5.9.2 * ge aunidade de aceleragao que expressa a forga centrifuga relatva, [EABNT 2007 - Tod06 08 dalios reservados1 (0001.08 (Pedieo 609401 imprest o7 07149: IBIENTAL LTDA IM CONSULTORIA AI RHIZOBI xem ABNT NBR 15469:2007 6.9.1. Amostra integral ‘A amostra integral deve ser peneirada para remogo de materiais sintéticos ou naturais, como galhos, folhas, pedras, entre outros, A granulomeltria da amostra deve ficar, preferencialmente, abaixo de 4 mm. Apés esse processo, utlizar a amostra para o ensalo ecotoxicoldgico 5.9.2 Elutriato © olutriato é obtido pela mistura de uma parte de solo (seco em temperatura ambiente) ¢ quatro partes de agua de diluicdo (1:4), Essa mistura é submetida 8 agitagao por 20 h a 24 h e sedimentada por um periodo entre 1h @ 2h. (0 sobrenadante é retirado e centrifugado por 30 min a 2 000 x g para uso no ensaio ecotoxioalogico. 6 [EABNT 2007 - Todo os deine reeorvados1272014) i £ i ABNT NBR 15469:2007 Bibliografia ABNT NBR 9898:1987 — Preservacao e técnicas de amostragem de efluentes Iiquidos e corpos receptores [1] AMERICAN PETROLEUM INSTITUTE. API RP 13H:1984: Recomended practice: standard procedure for liquid driling fuid bioassays (tentative), [2] ANDERSON, J. 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Porewater toxicity: biological, chemical, and ecological considerations with a review of methods and applications, and recommendations for future areas of research, Pensacola: R. S Carr, M. Nipper, 2001. 38p. [9] DUKE, T. W. et al. Acute toxicity of eight laboratory-prepared generic drilling fluids to mysids (Mysidopsis bahia). Gulf Breeze: Environmental Protection Agency. 4p (EPA-600/S3-84-087), 1984. {10} OECD. Guidance document on aquatic toxicity testing of difficult substances and mixtures, OECD Series on Testing and Assessment Number 23, 2000. 22p. Tarzwell, C.M, 1969. Standart methods for the determination of relative toxicity of oil dispersants and ‘mixtures of dispersants and various oils to aquatic organisms. In: Proceedings Joint Conference on Prevention and Control of Oil Spills. American Petroleum Institute and Federal Water Pollution Control Administration. December 15-17, 1969. New York. p179-186. LGABNT 2007 - Todos os drotos reservados 7