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Rio Grande-RS
2012
3
Dedico esta dissertao aos meus familiares: minha me Norma Rodrigues Machado,
irm Maria Ins Rodrigues Machado e sobrinha Victoria Leitzke, pelo apoio,
companheirismo e presena constante em minha vida.
ii
4
Agradecimentos
Aos meus familiares: minha me, apoio, amor, tambm a uma pessoa que no
est mais conosco, meu pai, pois sei que de onde estiver estar torcendo por mim.
minha irm Maria Ins pelo incentivo, contribuies, correes e palavras de coragem,
minha amada sobrinha pelo carinho e abrao;
orientao da professora Leonor de Souza Soares meus sinceros
agradecimentos pelo auxilio a execuo desta obra, amizade, conselhos e grande
aprendizagem. colega de equipe que se tornou uma grande amiga e incentivadora
e uma grande colaboradora deste projeto Leticia Assis ;
FURG atravs dos laboratrios de: Bioengenharia, Cincia de Alimentos,
Tecnologia de Alimentos, pelos emprstimos de equipamentos; principalmente s
funcionrias: Maria de Jesus Lamego e Sabrine. Aos colegas de Ps-Graduao:
Maira Mendes, Vanessa Ribeiro, Cristiano, Renata, Helen, Lisiane, Michele Souza,
Priscila Tessmer, Alessandra, Lidiane Moreira, Marina, Juliana,Gilberto, Larine,
Fernanda,Tnia, e demais colegas. Agradecimentos ao departamento de Quimica-
FURG em especial ao Tito pela ajuda nas analises. Aos Professores Jorge Alberto e
Eliana Badiale Furlong pelas importantes contribuies neste trabalho.
UFPEL: antigo Departamento de Cincia de Alimentos-Quimica de Alimentos.
s professoras Mirian Galvo Machado e Rosane Rodrigues pelas co-orientaes,
auxilio, apoio e amizade. Ao Biotrio Central, a Zootecnia, ao Centro de Biotecnologia;
aos Laboratrios de Anlises Clnicas e Regional de Diagnstico, atravs das equipes
das professoras Carmen Lcia Ribeiro e Ana Lcia Schild.
professora Amanda Motta pelo o auxilio, apoio na execuo deste projeto e sua
estagiria Michele Mello pelos ensinamentos.
Ao curso de Engenharia de Materiais, especialmente ao professor Neftali Carreo,
Bianca e Matheus Zorzelli Krolow;
(Autor desconhecido)
iv
2
SUMRIO
LISTA DE FIGURAS......................................................................................... IX
LISTA DE EQUAES.......................................................................................... X
CAPTULO I.......................................................................................................... XI
RESUMO................................................................................................................ XII
ABSTRACT............................................................................................................ XIII
1. INTRODUO GERAL..................................................................................... 1
2.OBJETIVOS........................................................................................................ 3
3.JUSTIFICATIVA.................................................................................................. 4
CAPTULO II.......................................................................................................... 6
4. REVISO BIBLIOGRFICA............................................................................. 7
4.3.Legislao......................................,,.......................................................... 11
4.4.1.Proteinas e Aminocidos..................................................................... 11
4.4.2.Vitaminas........................................................................................... 11
4.4.3 Pigmentos........................................................................................... 11
V
4.5 Nanotecnologia em alimentos................................................................... 14
4.6 Encapsulao.............................................................................................. 16
4.6.2. Lipossomas............................................................................................ 19
5 MATERIAL E MTODOS.................................................................................. 22
5.1. Material........................................................................................................... 22
5.2. Mtodos.......................................................................................................... 24
5.2.9.1 Peletizao....................................................................................... 29
5.2.9.2 Animais............................................................................................. 30
vi
5.2.10.1 Determinao de Lipidios- ............................................................... 31
APNDICES.......................................................................................................... 136
vii
2
LISTA DE TABELAS
viii
LISTA DE FIGURAS
ix
LISTA DE EQUAES
x
Capitulo I
Resumo
Abstract
Introduo geral
Objetivo
Geral
Especifico
Justificativa
xi
RESUMO
xii
2
Abstract
Spirulina microalgae is classified as a GRAS (Generally Recognized as Safe) by FDA
(Food and Drug Administration), which ensures its use as food without health risks.
However, in Brazil, although Spirulina, be considered a novel food, the
recommendation of its use is limited to 1.6 g daily. Thus, several studies in the area of
nanotechnology are working to develop new foods, which remain inert in the body and
release nutrients to cells when needed. A key element in this sector is the development
of nanocapsules that can be incorporated into food to distribute nutrients. In the food
industry encapsulation is a process in which one or more ingredients or additives (the
core) are coated with an edible capsule. Spirulina was used in this process as the core
encapsulation. The benefits of Spirulina aims to encapsulate the masking undesirable
flavor compounds, delaying changes that may result in loss of flavor, color change or
loss of nutritional value, when the application in formulations, and also allow the
release directly into the body. The objective of this study was to evaluate the biological
and nutritional properties of Spirulina biomass LEB-18/FURG in their micro-and
nanometer sizes, but also analyze the specific method of encapsulation of casein and
spirulina encapsulation process occurred through the methodology hydration of the
lipid film. To check the morphology of the particles we used scanning electron
microscopy. Therefore, to analyze the average size used the technique of dynamic light
scattering. The experiment was conducted for 15 days to check the ratio of net
efficiency of the experiment protein. We used 24 females of Rattus norvegicus, newly
weaned(21 days0, Wistar/ UFPEL from the Central Animal Laboratory, Federal
University of Pelotas. For were offered four diets termed C (casein as protein source),
S (Spirulina micrometer), A (non-protein) and Sn (Spirulina nano). During and at the
end of the experiment were observed animal weight and daily intake of diet, collected
biological materials, such as feces, blood and livers for subsequent determinations. It
was found that phosphatidylcholine is a viable possibility in the application as wall
material for the formation of liposomes of Spirulina as the material obtained was
presented at the nanoscale and visually encapsulated. The results of evaluations in
vivo lead to the conclusion that the diet of spirulina as a substitute for casein did not
significantly affect the total food intake and weight gain, promoting values of feed
efficiency coefficient close to casein.So with to serum assessment groups did not differ
statistically.
Key words: microalgae, biological evaluation, encapsulation, liposomes and
nanotechnology.
xiii
1
1 Introduo
2 Objetivos
2.2 Especficos
Obter uma Spirulina em tamanho nanomtrico a partir da biomassa da spirulina
LEB-18/FURG
Analisar a composio centesimal da microspirulina e nanospirulina
Verificar atravs de testes in vivo o comportamento da microalga Spirulina LEB-
18 em tamanho nano e tamanho micro;
Determinar as respostas nutricionais da Spirulina nano mediante testes in vivo.
Analisar o efeito da nanospirulina nas respostas biolgicas, bioquimicas e
hematolgicas in vivo;
Avaliar o mtodo especfico de encapsulao da spirulina e caseina;
Determinar a eficincia da encapsulao;
4
3. Justificativa
lipossomas (SOZER e KOKINI, 2009), que podem ser utilizados para a encapsulao
de ingredientes alimentcios.
A encapsulao envolve a incorporao, absoro ou disperso de compostos
slidos, lquidos ou gasosos dentro, ou em vesculas pequenas, que podem chegar
escala nanomtrica. As combinaes de compostos incorporados podem ser
protegidas contra degradao, melhorar a estabilidade e solubilidade (e.x,
solubilizao de componentes hidroflicos em matrizes hidrofbicas e vice-versa)
(KLAYPRADIT E HUANG, 2008; JAFARI et al., 2008).O ncleo o local onde se
encontra o componente ativo, e este pode ser composto de um ou mais ingredientes.
A spirulina platensis foi utilizada neste processo de encapsulao como ncleo. As
vantagens de encapsular a Spirulina platensis visa mascarar compostos de sabor
indesejvel, retardando alteraes que podem resultar em perda de aroma, alterao
de cor ou perda do valor nutricional (AZEREDO,2005), quando da aplicao em
formulaes, assim como, tambm permitir a liberao diretamente no organismo.
Com isso um dos processos utilizados para encapsulao so os lipossomas.
Segundo Faceto (2006) e Santos (2002), os lipossomas so vesculas formadas por
bicamadas lipdicas unilamelares ou multilamelares, pequenas ou grandes. Os
tamanhos dos lipossomas podem variar dentro de uma faixa relativamente ampla de
dimenses: de algumas dezenas de nanmetros a algumas centenas de micrmetros.
Dentre os vrios mtodos de elaborao de lipossomas pode-se citar o mtodo de
hidratao do filme lipdico.
6
Capitulo II
Reviso Biobliogrfica
e Materiais e Mtodos
7
4 Reviso bibliogrfica
A B
De acordo com Derner (2006), para extrao dos compostos, as clulas microalgais
so rompidas, empregando-se mtodos de homogeneizao, ultra-som, choque
osmtico, solventes, enzimas, etc. As substncias de interesse so ento recuperadas
e, na maioria dos casos, sofrem algum processo de purificao como ultrafiltrao,
cromatografia ou fracionamento. Esses parmetros de produo no so fixos, eles
dependem no s do biorreator utilizado como tambm do objetivo da pesquisa.
4.3 Legislao
A Spirulina, em maio de 2009, passou a fazer parte da Lista de Novos
Ingredientes (enquadrada nos Alimentos com Alegaes de Propriedades Funcionais
e/ou de Sade, Novos Alimentos/Ingredientes, Substncias Bioativas e Probiticos)
aprovada pela Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria, a qual limita a sua ingesto
diria em 1,6g por indivduo (BRASIL, 2009).
4.4.2 Vitaminas
Esta cianobactria fonte de vitaminas lipossoluveis como a prvitamina A,
vitaminas E e K bem como as do complexos B e vitamina C. Conforme Janby(1988),
apenas 1,8g de Spirulina alcanaria o valor de RDA ( recommendied Dietary
Alowance) para vitamina B12, importante fator para as clulas vermelhas do sangue.
12
4.4.3 Pigmentos
Os carotenides so fotopigmentos lipossolveis podendo apresentar-se como -
caroteno, xantofilas, zeaxantina e lutena (OLAIZOLA E DUERR, 1990). As
quantidades de -caroteno encontradas na microalga podem chegar a concentraes
dez vezes maiores que as encontradas na cenoura. Conforme Herikson,(1994), em
10g da microalga seca, pode-se encontrar cerca de 23.000Ul (14mg) do composto,
cerca de 460% da dieta recomendada. Em valores percentuais , o contedo de
carotenides de 0,37% na microalga.
O consumo de -caroteno tem sido indicado por reduzir os riscos de contrao
de cncer, devido a capacidade de desativar os radicais livres, evitando que
reacionem no organismo. Tambm podem estimular populaes de lactobacilos
intestinais, aumentando a absoro de vitamina B1.
A ficocianina o principal pigmento da microalga, podendo chegar a 20% em
peso seco. Tem sido utilizada como pigmento alimentcio e de cosmticos
(RICHMOND, 1990). A ficocianina apresenta-se como estimulante ao sistema
imunolgico, aumentando a contagem de leuccitos, cuja funo principal manter a
sade dos rgos do corpo, proteger contra o cncer, lceras e hemorridas
(HENRIKSON,1994).
A clorofila pode ser utilizada como corante alimentcio verde. encontrada em
pequenas quantidades na microalga quando comparada s quantidades de
ficocianina, sendo apenas 1,1 %, apresentando-se principalmente como clorofila-a
(HENRIKSON,1994).
4.6 Encapsulao
A encapsulao definida como a tecnologia de armazenamento de materiais
slidos, lquidos ou gasosos em cpsulas seladas que podem libertar o seu contedo
sob determinadas condies pr-estabelecidas (SPARKS, 1981). O encapsulamento
confere um meio de proteo a componentes sensveis dos alimentos, pode evitar
perdas nutricionais, aplica-se a ingredientes sensveis de sofrer alteraes, preserva
aromas e cheiros, transforma ingredientes lquidos em slidos fceis de manusear.
Uma tecnologia de encapsulamento tanto mais eficiente quanto menores as
perdas de aroma durante o processo, e quanto maior a concentrao e estabilidade do
aroma no produto final.
Um nmero elevado de fatores deve ser considerado para selecionar o mtodo mais
correto no encapsulamento de aromas, Tuley (1996). necessrio ter em
considerao:
- O tipo de material de transporte (matriz) a utilizar;
- O tipo de substncias auxiliares que sero incorporadas (solventes, ligantes,
protenas);
- A solubilidade do aroma (hidrossolvel ou lipossolvel);
- Os parmetros de processamento de aplicao especfica a que o aroma
encapsulado deve resistir (temperatura, pH, dissoluo) e o mecanismo de libertao
do composto;
- Especificaes, como o tamanho de partculas, densidades e condies de
armazenamento.
As principais nanoestruturas utilizadas para encapsulao de ativos so os
lipossomas, as ciclodextrinas, as nanopartculas polimricas e as nanopartculas
lipdicas.
As vantagens destes sistemas so a melhora da estabilidade qumica e fsica dos
ativos, melhora da biodisponibilidade, manuteno do ativo no tecido alvo, muitas
vezes, possibilitando a penetrao deste em zonas corpreas de difcil acesso,
solubilizao de ativos hidrofbicos, reduo de efeitos colaterais e da toxicidade,
assim como do nmero de doses e freqncia de administrao,proporcionando maior
conforto do paciente e, conseqentemente, a maior adeso ao tratamento (SANTANA,
et al.,2010). Umas das materias primas utilizadas para encapsulao a lecitina de
soja.
17
4.6.1Lecitina de soja
A lecitina (Figura 5) a designao dada a uma mistura de glicolpideos,
triglicerdeos e fosfolipdios (por exemplo: fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina e
fosfatidilinositol). Contudo, em bioqumica, o termo lecitina usualmente, utilizado
como sinnimo de fosfatidilcolina pura - um fosfolpido que constitui o principal
componente da fraco fosfatada que se obtm da gema de ovo (em grego: lekithos -
, de onde deriva o nome do composto) ou de gros de soja, de onde extrada
por meios mecnicos ou qumicos, utilizando hexano. A lecitina comercializada, em
elevado grau de pureza, como suplemento alimentar e para uso mdico (MERTINS,
2004).
A lecitina usada comercialmente tanto como emulsionante quanto como
lubrificante em diversas atividades econmicas, como na indstria farmacutica ou
alimentar. Por exemplo, utilizada como emulsionante em chocolates e na produo
de revestimento para alimentos. A lecitina considerada como um surfactante no-
txico, bem tolerado pelo organismo, at porque parte integral das membranas
celulares e pode ser totalmente metabolizada. Foi classificada nos Estados Unidos da
Amrica, pela Food and Drug Administration, como sendo geralmente reconhecida
como produto seguro para o consumo humano. A lecitina reconhecida como aditivo
alimentar pela Unio Europeia com o nmero E E322(ZAMBELLI E MOREIRA, 2009).
Outra vantagem da lecitina da soja que ela pode ser usada como ingrediente
alimentar, servindo como estabilizador vitamnico, protegendo as vitaminas A e E
contra oxidaes, e tambm servindo como fonte de colina, inositol e outros
componentes estimulantes do crescimento (MEYERS, 1990).
A fostatidilcolina (lecitina de soja) um fosfolipdio natural de massa molar
igual a 780 g/mol e =0,05 g/cm3 (REYS, 2010 apud WILLARD et al., 1998). Faz parte
da composio molecular das membranas biolgicas e tambm se encontra presente
no plasma sanguneo como constituinte de lipoprotenas. biocompatvel,
biodegradvel e tem ao detergente. Sua estrutura (Figura 6) formada por duas
longas cadeias hidrocarbnicas, uma saturada e outra insaturada, que constituem a
poro hidrofbica ou apolar da molcula. A poro hidroflica ou polar formada pelo
glicerol, o grupo fosfato e a colina (MERTINS, 2004). A fosfatidilcolina um slido
amarelado, higroscpico e pouco estvel. facilmente decomposta em altas
temperaturas e degradada pela ao do oxignio quando exposta ao ar e umidade
por longos perodos. Seu principal produto de degradao a lisofosfatidilcolina,
resultante da hidrlise da funo ster no carbono de posio 1 ou 2 do glicerol,
fornecendo uma molcula com apenas uma cadeia apolar (REYS, 2010 citando
18
4.6.2 Lipossomas
As nanoestruturas utilizadas para encapsulao so denominadas Lipossomas
(Figura 7), onde estes so vesculas microscpicas compostas de uma ou mais
bicamadas lipdicas concntricas, separadas por um meio aquoso, sendo amplamente
difundidas nas reas medica e farmacutica; na rea de alimentos, eles vm sendo
utilizados como encapsuladores de aromas, mascaradores de sabor e protetores de
nutrientes contra degradaes do trato gastro intestinal. Podem encapsular
substncias hidroflicas e/ou lipoflicas, sendo que as primeiras ficam no
compartimento aquoso e as lipoflicas inseridas ou adsorvidas na membrana. Por
serem biodegradveis, biocompatveis e no imunognicos so altamente versteis
para pesquisa, teraputica e aplicaes analticas (EDWARDS, BAEUMNER, 2006;
NEW, 1990; PUISIEUX et al., 1995). Estas vesculas so constitudas basicamente
por fosfolipdeos (podendo ser de natureza sinttica ou natural),esteris e um
antioxidante (VEMURI, RHODES, 1995). Os lipdios (Figura 8) mais utilizados nas
formulaes de lipossomas so os que apresentam uma forma cilndrica como as
fosfatidilcolinas, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol e esfingomielina, que tendem a formar
uma bicamada estvel em soluo aquosa. As fosfatidilcolinas so as mais
empregadas em estudos de formulao de lipossomas, pois apresentam grande
estabilidade frente a variaes de pH ou da concentrao de sal no meio. Os
fosfolipdios so caracterizados por uma temperatura de transio de fase (Tc), na
qual a membrana passa de uma fase gel, onde a cadeia hidrocarbonada do lipdio est
em estado ordenado, para uma fase de cristal-lquido, onde as molculas ficam com
movimentos mais livres e os radicais hidroflicos agrupados tornam-se completamente
hidratados. O comprimento e a saturao da cadeia lipdica influenciam o valor da Tc.
Portanto, diferentes membranas compostas por lipdios distintos podem exibir
diferentes nveis de fluidez na mesma temperatura (FRZARD, 2005; LASIC, 1998). A
permeabilidade dos lipossomas relativamente baixa quando a temperatura menor
que a Tc dos lipossomas, sendo a mesma medida pelo fluxo ou pela taxa em que o
soluto sai do compartimento aquoso, atravs da bicamada. Esta propriedade vai
depender, no entanto, da natureza do soluto e da fluidez da membrana (FRZARD,
1999).
20
5 MATERIAL E MTODOS
5.1 Material
5.2 Mtodos
contida no balo foi submetida temperatura excedente a fase de transio (60 C).
Aps os lipossomas foram submetidos a tratamentos distintos de sonicao, utilizando
banho ultrasnico (40 kHz, Unique USC 700) a 60 C durante 30 min ou
homogeneizao (Ultra-Turrax) a 10.000 rpm durante 15 min(Figura 10).
Spirulina e filme
sob Aquecimento
em Banho-Maria
Lipossoma sob
Agitao
Sonicao
ou
Homogeneizao
Figura 11: Processo de anlise de Espalhamento dinmico de luz.1 etapa: Filtragem dos
lipossomas;2 o laser incide sobre a amostra localizada no centro do gonimetro. A luz
espalhada em determinado ngulo e coletada e amplificada pela fotomultiplicadora que envia
dados ao computador.
Fonte:imagens do autor,2011.
A B C
Figura 12: Microscpio eletrnico de varredura.Etapa A:Preparo da amostra-;Etapa B: os substratos foram
presos ao porta-amostra do MEV utilizando-se uma fita de carbono e as amostras foram, ento,
metalizadas com ouro; Etapa C: Amostras acopladas no equipamento Sanyu Electron, modelo Quick
Coater SC-701 eDados copilados no computador. Fonte: imagens do autor, 2011.
27
Aquecimento
Banho-Maria
Agitao e
Homogeneizao
das particulas
Spirulina em tamanho
nanomtrico
controle denominada casena, uma aproteica (sem protena) e duas dietas estudo,
designadas Spirulina micro e Spirulina nano, de acordo com a Tabela 1 . Foram
adicionados ingredientes como leo de soja, sacarose, amido de milho entre outros
(REEVES, 1993), para confeco destas dietas.
5.2.9.1 Peletizao
Para administrao das dietas aos animais, as mesmas foram peletizadas. As
misturas dos ingredientes foi umedecida com gel de amido a 8%, ate atingir uma
textura ideal para peletizao manual, sendo os peletes secos em estufa com
circulao de ar a 50C por 24 horas (SOUZA-SOARES et al., 2009).
Spirulina nano - - 80 -
Caseina 160 _ 80 -
Oleo de soja 70 70 70 70
Mistura mineral 35 35 35 35
Mistura vitaminica 10 10 10 10
Fibra de trigo 50 50 50 50
5.2.9.2 Animais
No ensaio foram utilizados 24 ratos fmeas(Rattus norvegicus) (figura 14),
recm desmamados (21 dias), da cepa Wistar/ UFPEL, com peso inicial mdio 58,16g
divididos aleatoriamente em blocos de 6 ratos para cada dieta. Os animais foram
fornecidos pelo Biotrio Central da Universidade Federal de Pelotas.
Os animais foram mantidos, em gaiolas metablicas individuais, comedouro
embutido em V. A pesquisa teve durao de 15 dias, sendo 4 dias de adaptao as
condies ambientais, manteve-se o ambiente com temperatura de 252C e ciclo de
iluminao claro-escuro de 12 horas, aps realizou-se a verificao do Quociente de
eficiencia liquida de proteina (NPR). Durante todo o experimento os animais
receberam gua ad libitum. O consumo de dieta e o peso dos animais foram
monitorados duas vezes por semana. Ao final do perodo de adaptao, os animais
foram pesados e distribudos em quatro grupos de 6, mantendo-se o peso mdio dos
grupos aproximadamente 56 g de maneira que a diferena entre os mesmos fosse a
mnima possvel.
No decorrer do experimento foram realizadas, diariamente, pesagens das
dietas remanescentes, com o objetivo de se determinar a quantidade diria de ingesta
por animal. O peso corporal dos animais foi registrado a cada 3 dias para avaliao do
ganho de peso semanal dos mesmos. Estes dados, alm de expressarem o ganho de
peso e a ingesto de dieta por animal, foram utilizados para determinar o coeficiente
de eficincia alimentar (CEA), calculado pela razo entre o ganho de peso e a
quantidade total de dieta ingerida durante o experimento.
Foi realizado um corte ventral longitudinal nos animais para inspeo dos
rgos e posteriormente retirado dos fgados.
Os fgados foram lavados em soluo fisiolgica gelada, enxutos em papel
filtro, pesados em balana analtica (capacidade de 200g e preciso de 0,01g) e
acondicionados em funo das anlises subseqentes. Parte do fgado foi
acondicionada em congelamento a 18C para anlise de lipdios e o lbulo direito
colocado, em soluo de formol tamponada, para posteriores anlises
histopatolgicas.
As carcaas e o restante do material biolgico foram acondicionados em
embalagens especias e destinados pelo biotrio a firma especializada .
LIPOSSOMAS
Eliana BADIALE-FURLONG*
adriana.rodriguesmachado@yahoo.com.br
RESUMO
onde devido poro hidroflica e lipoflica dos seus constituintes, podem encapsular
homogeneizao
35
INTRODUO
escala de produo e custo. Existem vrios mtodos que podem ser utilizados para
36
Uma poro do meio aquoso torna-se fechada na membrana lipdica que serve ento
como uma partcula de liberao controlada para o material ativo disperso na fase
disperso das molculas dos lipdios em um meio aquoso, e o objetivo principal desse
A Spirulina LEB-18 uma cianobactria utilizada como alimento pelo homem devido
apresentando toxicidade, sendo permitida como suplemento alimentar pela FDA (Food
and Drug Administration) o que garante seu uso como alimento sem riscos
alteraes que podem resultar em perda de aroma, alterao de cor ou perda do valor
MATERIAL E MTODOS
sobrenadante foi separado da fase inferior e descartado. A fase inferior, com aspecto
de gel, foi dispersa em 150 mL de acetona (Synth ), formando aglomerados que foram
Encapsulao da Spirulina
filme lipdico depositado nas paredes do balo. Os traos de solvente orgnico foram
lipdico resultante foi disperso pela adio de 20 ml de tampo fosfato pH 7,0, 0,2M
submetidos a tratamentos distintos, utilizando banho ultrasnico (40 kHz, Unique USC
Eficincia de encapsulao
do teor protico fora da cpsula. A umidade da amostra foi determinada pelo mtodo
anlises.
C por 48 h.
utilizando-se uma fita de carbono, sendo ento metalizadas com ouro por 3 min e
Anlise estatstica
RESULTADOS E DISCUSSO
teor protico total dos lipossomas de Spirulina, assim como dos sobrenadantes
tamanho mdio menor (279,53nm) comparado aos lipossomas que foram submetidos
42
lipossomas ocorreu em funo deste ser um mtodo simples e de baixo custo, que
de 3,8 m.
CONCLUSES
ABSTRACT
additives (core) are coated with an edible capsule. Among the forms of encapsulation
vesicles, where due to the lipophilic and hydrophilic portion of its constituents, can
encapsulate substances of various natures, and the hydrophilic substances stay in the
compartment aqueous and lipophilic inserted or adsorbed on the membrane. The aim
of the work was to apply two different treatments, sonication and homogenization, in
formed out by the thin-film hydration method. Liposomes were prepared using purified
10.000 rpm for 15 min. It was determined the average size, encapsulation efficiency
and particle morphology. The type of process applied did not differ for obtaining particle
REFERNCIAS
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29. Morais, H.A.; Barbosa, C.M.S.; Delvivo, F.M.; Silva, V.D.M.; Mansur, H.S.; Oliveira,
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47
33. Marsanasco, M.; Mrquez, A.L.; Wagner, J.R.; Alonso, S.V.; Chiaramoni, N.S.
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41. Barbosa, C. M. S.; Morais, H. A.; Lopes, D. C. F.; Mansur, H. S.; Oliveira, M. C.;
Amostra Determinaes
(Ultra-turrax)**
(Ultra-Som)*
Letras iguais na mesma coluna indicam que no h diferena significativa pelo teste de Tukey
Ultra-turrax.
B C
sonicao (C).
51
Adriana Rodrigues Machado, Maira Peres Mendes, Bruna Del Sacramento Behling,
Rosane da Silva Rodrigues, Mirian Ribeiro Galvo Machado, Leonor de Almeida
Souza-Soares
Resumo
A Spirulina tem sido utilizada para diversos fins dentre eles o enriquecimento protico
de alimentos. O objetivo do estudo foi avaliar as respostas biolgicas (bioqumicas e
nutricionais) em ratas cepa wistar/UFPEL alimentadas com dietas contendo Spirulina
em tamanhos micromtrico e nanomtricos, provenientes da biomassa da micoalga
Spirulina (LEB cepa-18). Foram elaboradas 4 dietas, sendo dieta controle (caseina
C), aprotica (A) Spirulina nano (Sp nano) e Spirulina micro (Sp micro). Realizaram-se
avaliaes biolgicas, nutricionas e bioqumicas quanto aos ndices de glicemia no
sangue e minerais no soro. A composio das dietas contendo Spirulina diferiram
estatisticamente das dietas casena e aprotica, com relao aos teores de umidade e
cinzas. Em relao dieta contendo a Spirulina nano seu teor protico diferiu,
significativamente, das demais dietas. J o teor lipdico das dietas avaliadas no
diferiram significativamente. Com relao ao peso crporeo no houve diferena
significativa atravs da ingesto de dieta spirulina.O coeficiente de eficincia alimentar
para todos os grupos avaliados no obteve diferena estatistica. As dietas spirulina
nos tamanho micro e nanomtrico no interferiram nas medidas antopomtricas de
ratas wistar, e glicemia do sangue. Nem os teores de Ca e Fe no soro com ligeira
reduo de Mg e P, mas dentro de valores considerados normais para espcie.
Abstract
Spirulina has been used for several purposes amongst them the protein erichment of
foods. The aim of this study was to evaluate the biological( biochemical and nutritional)
in wistar strain rats/UFPEL fed diets containing Spirulina in micrometer and nanometer
Sizes from the biomass of spirulina microalga (strain LEB 18). Four diets were
prepared , and control diet( casein(C)), aproteic(A), spirulina nano(nano Sp) and micro
Spirulina(micro Sp).Evaluations were performed biological and
biochemical nutricionasand index of blood glucose and minerals in the serum. The
composition of the diets containing Spirulina diets differedsignificantly from the casein
and aproteic with respect to moisture and ash. Regarding
diet containing Spirulina nano its protein content differed significantly from the
other diets. Since the lipid content of the diets were not affected significantly. With
respect to body weight did not differ by intake of dietary spirulina.The food efficiency
ratio for all groups did not achieve statistical difference. Diets spirulina in micro
and nano size did not affect the measurements of anthropometric variables Wistar rats,
and blood glucose. Neither the Ca and Fe with a slight decrease in serum Mg
and P, but within normal limits for the species.
Introduo
Spirulina LEB-18 uma microalga com composio apropriada para uso como
complemento alimentar, podendo ser empregada no combate desnutrio (FOX,
1996). Em sua composio destacam-se os altos teores de protenas (64 - 74%),
cidos graxos poliinsaturados e vitaminas (COHEN, 1997), alm de compostos
antioxidantes (COLLA et. al., 2007). Esta microalga classificada como GRAS
(Generally Recognized as Safe) pelo FDA (Food and Drug Administration), o que
garante seu uso como alimento sem riscos sade. No Brasil, a Spirulina tem sido
empregada, basicamente, na produo de cpsulas destinada dieta de
emagrecimento. De acordo com os fabricantes, o efeito de controlar o apetite ocorre
se ingerida uma ou duas horas antes das refeies, devido presena dos
aminocidos essenciais em quantidades balanceadas, bem como a sua composio
rica em protenas (HENRIKSON, 1994). Tem sido utilizada para diversos fins como: o
enriquecimento protico de alimentos e a elaborao de produto liquidos e secos
base de Spirulina LEB-18, com o propsito de servir de alimento para viagens
espaciais, levando em considerao seu potencial nutricional, visto que rica em
protenas e no possui substncias txicas (HENRIKSON, 1994). Muitos estudos
comprovam estas propriedades, como ensaios biolgicos em ratos. Na literatura,
observa-se que a espcie Rattus norvegicus a mais utilizada em pesquisas de novas
fontes alimentares (HARKNESS E WAGNER, 1993). Alm disso, os ratos apresentam
gentica e caractersticas endcrinas semelhantes aos humanos; alta prolificidade;
tempo de vida curto, propiciando ao pesquisador a obteno de respostas rpidas em
curto tempo; fcil manipulao; controle da sade; padronizao e controle rigoroso
das condies ambientais nas quais os animais esto inseridos, alm da convenincia
de disponibilidade de local e exemplares para realizao do experimento (HARKNESS
E WAGNER, 1993).
A biomassa de Spirulina indicada como auxiliar em dietas que requerem
diminuio da ingesto calrica, por conter substncias que parecem prolongar o
tempo de trnsito gstrico e produzir sensao de saciedade. (ARAJO,
FACCHINETTI e SANTOS.,2003 citando GUGLIELMI, RIPPKA, TANDEAU ,1993).O
trabalho de Becker et al. (1986) descreve um experimento com humanos com o
objetivo de estabelecer uma relao entre o consumo desta biomassa e a diminuio
do peso corporal. Atualmente, cerca de vinte e duas companhias no mundo produzem
biomassa de spirulina, e seu principal destino so lojas de produtos naturais e
farmcias, onde a biomassa seca vendida como suplemento alimentar, alm da
54
Material e Mtodos
Material
A biomassa da microalga Spirulina foi fornecida pelo Laboratrio de Engenharia
Bioqumica (LEB cepa-18),isolada da lagoa Mangueira,RS, Brasil (MORAIS et al ,
2008) e suplementada com 20% do meio Zarrouk (COSTA,COLLA, DUARTE- FILHO,
2004).
Mtodos
Preparo da Spirulina em tamanho nanomtrico
A Spirulina LEB-18 com dimetro 200 micrometros foi dissolvida em soluo
tampo fosfato pH 7,0, 0,2M, de acordo com Malheiros (2010) com modificaes,
sendo aquecida em banho-maria, agitada e homogeneizada em Ultra-turrax a
10000rpm por 20 minutos, at uniformizao das partculas em tamanho nanomtrico
(Figura1).
Composio centesimal
Foram realizadas determinaes, em triplicata, de umidade, cinzas e protenas da
Spirulina cepa LEB-18 das dietas, segundo metodologia do Instituto Adolfo Lutz
(2008), e para os lipdios pelo mtodo Bligh and Dyer, (1959) e carboidratos por
diferena.
Ensaio biolgico
O ensaio foi conduzido no Laboratrio de Experimentao Animal da rea de
alimentos, do Centro de Cincias Qumicas, Farmacuticas e de Alimentos, da
Universidade Federal de Pelotas (UFPel) ( Figura 3).
O protocolo nmero:23110.000978/2010-91 , foi aprovado pela Comisso de
tica e Experimentao Animal (CEEA) da Universidade Federal de Pelotas.
56
Animais
Foram utilizados 24 fmeas de rattus norvegicus, recm desmamadas (21
dias), da cepa Wistar/ UFPEL provenientes do Biotrio Central da Universidade
Federal de Pelotas. Foram pesadas e colocadas aleatoriamente em gaiolas
metablicas individuais, sob condies ambientais, manteve-se o ambiente com
temperatura de 252C e ciclo de iluminao claro-escuro de 12 horas, recebendo
dieta controle (C) durante 4 dias, como perodo de adaptao s condies
ambientais. Ao final deste perodo, os animais foram pesados e redistribudos em
quatro grupos (n = 6), atravs de sorteio randmico, obtendo-se o peso mdio dos
grupos de aproximadamente 56 g, de maneira que a diferena entre os mesmos fosse
mnima possvel. A pesquisa teve durao de 15 dias. Durante todo o experimento
as ratas receberam gua ad libitum, e 15 g da dieta por dia.
No decorrer do experimento foi realizada, diariamente, pesagem da oferta de
dieta e da sobra. O peso corporal individual foi registrado a cada 3 dias, havendo,
nesta ocasio, rodzio da posio das gaiolas nas diferentes prateleiras. Estes dados,
alm de expressarem o ganho de peso e a ingesto de dieta por animal, foram
utilizados para determinar o coeficiente de eficincia alimentar (CEA), calculado pela
razo entre o ganho de peso e a quantidade total de dieta ingerida durante o
experimento.
Medidas antropomtricas
Posteriormente a eutansia, antes da abertura do abdmen, foram realizadas
as medidas do comprimento entre os membros torcicos, e da circunferncia do
abdmem com o auxlio de fita mtrica.
57
Anlise estatstica
Os resultados foram analisados com o auxilio do programa Statistica, verso
7.0 (STATISTICA, 2004). Foi realizada a anlise de varincia (ANOVA), teste de
Tukey (p < 0,05) para a comparao das mdias dos resultados das amostras.
Resultados e discusso
Concluso
Agradecimentos : CAPES,UFPEL.
61
REFERNCIAS
BELAY, A. Mass culture of spirulina in outdoors The earthrise farms experience. In:
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Figura 1.
Homogeneizador Ultra-
turrax10000 rpm /20 minutos
67
micro
(200micrometros)
Spirulina em 80 -
tamanho nano
- -
Casena 160 _ 80 -
leo de soja 70 70 70 70
Mistura mineral 35 35 35 35
Mistura 10 10 10 10
vitamnica
Fibra de trigo 50 50 50 50
Letras diferentes na mesma linha indicam diferena significativa pelo teste de Tukey (p<0,05).
Mdia de 3 repeties.
70
Resumo
1 Introduo
2 Material e Mtodos
2.1 Material
A biomassa da microalga Spirulina LEB 18 foi fornecida pelo Laboratrio de
Engenharia Bioqumica (LEB cepa-18),isolada da lagoa Mangueira,RS, Brasil (Morais
et al , 2008) e suplementada com 20% do meio Zarrouk (Costa,Colla, Duarte- Filho,
2004). Aps, a Spirulina LEB-18 foi triturada em moinho de bolas (Modelo Q298-2) e
peneirada em agitador de peneiras, alcanando uma granulometria de 200m.
posteriormente foi acondicionada a vcuo em embalagens de polietileno de alta
densidade (PEAD), com capacidade para 500g, e armazenada sob refrigerao
temperatura de 5C.
Spirulina nano - - 80 -
Caseina 160 _ 80 -
leo de soja 70 70 70 70
Mistura mineral 35 35 35 35
Mistura vitaminica 10 10 10 10
Fibra de trigo 50 50 50 50
2.2 Mtodos
2.2.1 Preparo da Spirulina em tamanho nanomtrico
A Spirulina LEB-18 com dimetro 200 micrmetros, de acordo com Malheiros
(2010) com modificaes, foi dissolvida em soluo tampo fosfato pH 7,0, 0,2M,
posteriormente foi realizado aquecimento em banho-maria, com agitao em vortex e
homogeneizao em Ultra-turrax a 10000rpm por 20 minutos, at uniformizao das
partculas em tamanho nanomtrico (Fig.1).
74
Spirulina LEB-18
Dissoluo em Tampo
fosfato pH7,0
a
Aquecimento a 60C BanhoM.
Homogeneizador Ultra-
turrax10000 rpm /20 minutos
Figura 1:Fluxograma da Preparao da Spirulina em tamanho nano
lipdios ingeridos
3 Anlise estatstica
Os resultados foram analisados pelo programa Statistica, verso 7.0
(STATISTICA, 2004). Foi realizada a anlise de varincia (ANOVA), teste de Tukey (p
< 0,05) para a comparao das mdias dos resultados das amostras.
78
4 Resultados e discusso
Avaliaes DIETAS
micromtrica
Letras diferentes na mesma linha indicam diferena significativa pelo teste de Tukey (p<0,05).
a a a b
Caseina 5,60 13,89 0,77 13,02 1,01 0,13 2,95 83,1
a a a b
Spirulina 5,58 14,04 0,78 11,56 2,53 0,29 3,62 62,8
a a b b
Spirulina 5,63 15,63 0,80 8,94 1,35 0,11 3,73 87,0
nano
a b a a
Aprotica 5,33 6,96 0,37 13,13 0,52 0,07 8,34 81,1
1 2
3 4
A B
C D
1 2
3 4
difusa moderada.
83
1 2
3 4
coalescente acentuada.
Nas figuras anteriores (1,2,3 e 4) das lminas histolgicas dos lbulos direito dos
fgados, onde pode ser observado que praticamente todos os animais demonstraram
algum grau de leso heptica. Contudo, na figura 1 a verificao do fgado dos ratos
que recebiam dietas com spirulina as leses obtiveram 80% leve a 20% moderada.
Para as ratas fmeas que receberam dietas a base de casena os fgados
apresentaram leses com 50% de leve a moderada (Figura 2). O grupo que recebia
dieta de spirulina nanomtrica foram verificados os percentuais de 20% leve a 80%
moderada de acordo com a figura 3. J para os animais, onde eram fornecidas as
dietas aproticas, figura 4, apresentou leses hepticas muito acentuadas (100%). As
leses hepticas foram bastante heterogneas quanto ao padro e intensidade. Estas
podem ser decorrentes de estresse ou diminuio/restrio de ingesta/jejum. Alm
disso, em graus discretos so achados casuais nos fgados de roedores de laboratrio
(Jubb; Kennedy; Palmer, 2007).
Nos fgados no foram observados leses de significado patolgico. Uma das
alteraes metablicas nas clulas o acmulo intracelular de substncias, tais como:
84
5 Concluso
6 REFERENCIAS
BERTOLIN,T.E.;PILATTI,D.;GIACOMINI,A.C.V.V.;BAVARESCO,C.S.COLLA,L.M.;CO
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TAYLOR GO, ZIBOH VA. Liver lipid changes in experimental protein malnutrition. Am.
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Resumo
1. INTRODUO
2. MATERIAL E MTODOS
2.1 Obteno das fontes proteicas e material de parede
A biomassa da microalga Spirulina LEB-18 foi fornecida pelo Laboratrio de
Engenharia Bioqumica, FURG, isolada da lagoa Mangueira, RS, Brasil, (MORAIS et al
, 2008) e suplementada com 20% do meio Zarrouk (COSTA et . al., 2004).A casena e
a lecitina de soja foram adquiridas em forma de p no comrcio local da cidade de
Pelotas-RS.
2.2Ensaio biolgico
Foram utilizados 12 ratos fmeas, recm desmamados ( 21 dias), da cepa Wistar/
UFPEL, com peso inicial entre 42,66 e 68g, que foram divididos aleatoriamente em
blocos de 6 ratos para cada dieta. Os animais foram fornecidos pelo Biotrio Central
da Universidade Federal de Pelotas,aps encaminhamento de projeto especfico para
a Comisso de tica da UFPEL. A pesquisa foi desenvolvida no Laboratrio de
Experimentao Animal do Centro de Cincias Qumicas, Farmacuticas e de
Alimentos, UFPel, e teve durao de 15 dias, sendo 4 dias de adaptao s condies
ambientais, e 11 dias de experimento. Neste trabalho utilizaram-se 2 dietas: casena
(C) e spirulina (S).
As ratas foram mantidas individualmente em gaiolas metablicas , recebendo
diariamente dieta e gua ad libitum. O ensaio biolgico foi desenvolvido com
temperatura e umidade relativa nas faixas de 22-24C e 65-75%, respectivamente, e
ciclo claro/escuro de 12 horas.
No 15 dia as ratas, aps jejum de 12h, foram submetidas eutansia por
decapitao (guilhotina). Os animais foram pesados no perodo de adaptao, no
incio, na metade e no final do experimento, para determinao do ganho de peso. Os
dados de consumo de dieta, pesos e outros foram anotados em planilhas.
92
formao do filme.
93
3. RESULTADOS E DISCUSSO
Fontes proticas; Letras diferentes na mesma coluna indicam diferena significativa pelo teste de
Tukey (p<0,05). Carboidratos=100-(Umidade%+Cinzas%+Proteinas%+Lipidios%)
Com relao ao peso final dos animais que receberam as dieta a base de casena,
e de spirulina, no diferirem estatisticamente. J o ganho de peso total entre os grupos
estudados apresentou diferena significativa (p<0,05) entre eles. Segundo Nagaoka et
al.(2005), em sua pesquisa, onde tambm comparavam animais que receberam dietas
casena e spirulina, verificaram que no houve diferena significativa entre os grupos
experimentais com rela ao ganho de peso.
Rogatto et al. (2004)obteve CEA de 0,21, no seu estudo com uma dieta com 17%
de Spirulina em substituio total protena da dieta controle (casena) em ratos
machos jovens Wistar durante cinco semanas. Os resultados encontrados para o CEA,
neste estudo, demonstraram que a protena da dieta com spirulina foi to bem
aproveitada biologicamente quanto protena padro de casena (recomendada para
o grupo em estudo), e que a dieta estava bem equilibrada nutricionalmente, apesar da
diferena observada no consumo e no ganho de peso.
Estas fontes proteicas verificadas in vivo, aps foram encapsuladas em
lipossomas, posteriormente sendo analisados o tamanho mdio e a polidisperso e
microscopia eletrnica de varredura.
Para o preparo dos lipossomas, a escolha pelo mtodo de hidratao do filme
lipdico ocorreu em funo deste ser um mtodo simples e de baixo custo, que no
96
Obs:Controle-Lipossomas.C.P.-Caseinapura;C.Enc.Caseinaencapsulada;S.P.-Spirulina pura;
S.Enc-Spirulina Encapsulada;Letras diferentes na mesma linha indicam diferena estatstica pelo
teste de Tukey( <0,05).
Pode ser observado nos lipossomas de spirulina que estes apresentaram com
formato cilndrico e aparentemente encapsulado. Segundo Morais (2003), uma das
vantagens associadas ao emprego de lipossomas refere-se preservao da
qualidade nutricional dos hidrolisados de casena. Pesquisas revelam que a
encapsulao aumenta a estabilidade de carotenoides, antocianinas e betalainas
(AZEREDO, 2005).
4 CONCLUSES
5. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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100
Agradecimentos:CNPQ,CAPES,UFPEL e FURG
101
Resumo
1 INTRODUO
2 MATERIAIS E MTODOS
Spirulina em tamanho - - 80 -
nano
Caseina 200 _ 80 -
Oleo de soja 70 70 70 70
Mistura mineral 35 35 35 35
Mistura vitaminica 10 10 10 10
Fibra de trigo 50 50 50 50
2.7Anlise estatstica
Os resultados foram analisados pelo programa Statistica, verso 7.0
(STATISTICA, 2004). Foi realizada a anlise de varincia (ANOVA), teste de Tukey (p
< 0,05) para a comparao das mdias dos resultados das amostras.
3 RESULTADOS E DISCUSSES
encontram-se abaixo dos resultados obtidos por Vieira e Bion (1998) de 0,36, no seu
estudo com valor biolgico de dieta base de soja (Glycine hispide) e algaroba
(Prosopis juliflora) contudo, acima dos encontrados por Melo et al. (2007) de 0,18 e
por Chaud, Sgarbieri e Vicente (2008), de 0,30.
Silva,(2009) em seu trabalho com leite caprino em ratos fmeas wistar, encontrou
CEA em mdia de 0,13, estando abaixo do encontrado neste estudo.
A ingesto alimentar e o ganho de peso foram determinantes para os valores de
CEA observados no presente estudo para todas as dietas, uma vez que os maiores
coeficientes encontrados por outros autores relacionam-se tambm com valores
maiores para o ganho de peso com o mesmo ou menor consumo alimentar confirmado
por Machado (2007) e Pacheco et al (2007).
Conforme Chaud, Sgarbieri & Vicente (2008) a reduo da eficincia alimentar
ocorre devido diminuio metablica do organismo frente determinada dieta,
causando estagnao ou reduo do peso corporal.
O NPR a tcnica utilizada para avaliar a qualidade da protena de um alimento
em relao ao padro de casena. Com isso, conforme a tabela 2 verificou-se que a
spirulina nano diferiu estatisticamento das demais dietas, possivelmente pela
complementao com casena. Gomes et al. (2000) em seu trabalho com ratos
encontraram valores de NPR a 4,70 para casena, 2,70 para farelo de soja no tratado
com bipiridilios, 2,60 para o tratado e 3,70 para o mesmo produto peletizado e tratado.
J Souza et al.(2000) em seu estudo sobre sintese e caracterizao nutricional de
plasteina obtida da proteina da folha de mandioca , da soja, e do soro de queijo obteve
para caseina 4,03 e sobrenadante plasteina 3,80 e plasteina precipitada 3,75, sendo
que estes dados esto abaixo do encontrado neste estudo com spirulina. Outro
estudo com Avaliao protica de uma nova multimistura com base no milho QPM BR
473 (GLRIA et al, 2004), constatou que as multimisturas lacteas+QPM e
Multimistura. Proposta apresentaram respectivamente 2,44 e 2,61, assim verificando
que no houve diferena significativa com a caseina que apresentou 2,74 em suas
avaliaes.
As tabelas 3, 4, respectivamente, demonstram os dados das avaliaes
bioquimicas, colesterol total de ratas fmeas wistar submetidos as diferentes dietas.
107
Indicadores
de Tukey (p<0,05).
4 CONCLUSO
Abstract
REFERNCIAS
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Captulo IV
117
Concluses Gerais
Captulo V
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