INSULINA DE
Pesquisa
PLANTAS
Antonia Elenir Amncio de Oliveira
(Doutoranda, UENF)
Cassiana Rocha Azevedo
( Iniciao Cientfica, UENF)
Thiago Motta Venncio
(Iniciao Cientfica, UENF)
Luciana Belarmindo da Silva
(Mestranda, UENF)
Marco Antnio Lopes Cruz
(Mestrando, UENF)
Olga Lima Tavares Machado
(Professora Associada, UENF Olga@uenf.br)
Maura da Cunha
(Professora Associada, UENF maura@uenf.br)
Viviane de Oliveira Santos
(Iniciao Cientfica, UENF)
Cristiane Paulain Cavalcante
(Iniciao Cientfica, UA)
Adriana Ferreira Uchoa
(Doutoranda, UENF)
Ktia Valevski Sales Fernandes
(Professora Associada, UENF cowpkat@uenf.br)
Valdirene Moreira Gomes
(Professora Associada, UENF valmg@uenf.br)
Spartaco Astolfi Filho
(Professor Titular, UA sastolfi@fua.br)
Jos Xavier-Filho
(Professor Titular, UENF xavier@uenf.br)
Fotos cedidas pelos autores
36 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
Hormnio peptdico em plantas
Diabetes e Insulina betes. Os Gregos antigos no ti-
nham tratamento para a doena e,
O diabetes, caracterizado por em vrias partes do mundo, acredi-
elevados nveis de glicose no san- tava-se que ela fosse causada por
gue e excesso de urina com sabor calor excessivo nas vsceras, por
adocicado , atualmente, uma das variaes humorais ou pelo exces-
doenas mais importantes que afe- so de bebidas. No fim do sculo
tam a humanidade. Segundo a Or- XVIII, Matthew Dobson provou que
ganizao Mundial de Sade (OMS), o sabor da urina no diabetes era
devido presena de
acar e mostrou o
excesso de acar no
sangue; na mesma
poca, John Rollo ob-
servou o odor de ace-
tona nos pacientes
com diabetes (Pike,
1999).
Posteriormente,
foram feitas descober-
tas importantssimas
para o melhor enten-
Figura 1 Planta e sementes de Canavalia
dimento do diabetes.
ensiformis Entre elas a de Von
Mering e Oscar
Minkowski, em 1899,
existem 142 milhes de diabticos de que a retirada do pncreas do
no mundo. A estimativa que, at cachorro promovia o aparecimen-
2005, o nmero alcance 300 mi1hes to da doena naquele animal. Em
(O Globo, 1998). A doena co- 1921, uma equipe liderada por Fre-
nhecida desde a antiguidade. h derick Banting descobriu, no Cana-
mais de 1500 anos A.C. os antigos d, que um peptdeo, a insulina,
egpcios tinham alguns remdios secretado pelas ilhotas de Lan-
para combater o excesso de urina, gerhans do pncreas, causava o
e os hindus observaram que insetos abaixamento dos nveis de acar
e moscas eram atrados para a urina do sangue. Em 1926, esse peptdeo
de algumas pessoas e que isso foi cristalizado por J. J. Abel e, em
estava associado a certas doenas. 1955, Frederick Sanger determinou
Mil anos A.C. o pai da medicina na sua seqncia de aminocidos
ndia, Susruta, diagnosticou o dia- (Turkenburg-van Diepen, 1996).
 Sabe-se, atualmente, que a in-
sulina exerce seus efeitos quando
se liga ao seu receptor na parte
externa da membrana celular. Essa
ligao inicia uma cascata de fosfo-
rilao no interior da clula, que,
entre outras coisas, promove a fos-
forilao e conseqente ativao
de transportadores de glicose. Isso
faz com que essa molcula penetre
na clula e participe dos processos
metablicos em que est envolvi-
da. So conhecidos tambm outros
efeitos da ao de insulina sobre o
metabolismo e ativao de genes
na clula animal.
Tratamento do diabetes
Diabetes no tem cura. Seu tra-
tamento feito, principalmente,
base de injees de insulina, sendo
sua ingesto ineficaz. O hormnio
tem uma importncia enorme no
controle dessa afeco. Entretanto,
o sofrimento decorrente das mlti-
plas injees dirias a que so
submetidos os pacientes tem sido
um estmulo para a busca de subs-
titutivos, principalmente os que
exeram seus efeitos por via oral.
Alguns desses so pequenas mol-
culas que, de uma forma ou de
outra, mimetizam a ao da insuli-
na em pacientes diabticos. Exem-
plo de composto anti-hiperglic-
mico do tipo acima o metformin
(N, N-dimetil guanidina) original-
mente detectado em uma planta,
Galega officinalis, da famlia das
leguminosas.
Extratos de partes de plantas,
como folhas, razes ou sementes,
tm sido utilizados, atravs dos
tempos, pela medicina popular de,
praticamente, todas as populaes
humanas no tratamento do diabe-
tes. Entretanto, aps a descoberta
da insulina e com sua extensa co-
mercializao, estudos sobre a uti-
lizao de remdios populares ori-
ginados de plantas diminuram seja
por no serem considerados de
valor comercial seja por estarem,
aparentemente, associados a uma
cincia de segunda categoria. Vale
ressaltar que muito poucos remdi-
Figura 2 Seqncias de aminocidos de insulinas bovinas e de plantas
os ditos naturais para o tratamento protenas de folhas de espinafre e
do diabetes tiveram seu valor tera- de centeio e de plantas de Lemna
putico comprovado. gibba G3, que apresentaram pesos
moleculares semelhantes aos das
Insulina de Plantas insulinas animais, reagiram com
anticorpo antiinsulina suna e exi-
Logo aps a realizao dos estu- biam a propriedade de ligao ao
dos que levaram descoberta da receptor de insulina humana. Ne-
insulina no pncreas de ces, dois nhuma informao estrutural foi
dos cientistas envolvidos (Collip, fornecida na ocasio ou posterior-
1923; Best et al., 1924) com a des- mente.
coberta apresentaram resultados nos No h registros posteriores a
quais sugeriam a presena de subs- esses relatos na literatura cientfica
tncias possivelmente similares sobre a presena de insulina em
insulina em extratos das mais diver- plantas. Mas h, no entanto, um
sas plantas. Collip chegou a dar ao registro contnuo na literatura, dos
seu produto o nome de glucocini- efeitos benficos de uma enorme
na, pois imaginou que um produto quantidade de extratos de folhas e
derivado de plantas no poderia ter de sementes das mais variadas plan-
o nome de insulina (originado da tas sobre o diabetes, e cujas propri-
palavra latina que significa ilhota, edades sugerem a presena de pro-
referncia s ilhotas de Langerhans tenas ativas.
do pncreas). Em 1976, Khann et al. A despeito dessa grande quanti-
forneceram indcios mais concretos dade de informao, que sugere a
sobre a presena de insulina em presena de insulina em plantas,
plantas. Eles isolaram de frutos e de parece haver um paradigma que
sementes de Momordica charantia estabelece que as plantas no se
(melo-de-So Caetano) uma fra- valem de hormnios peptdicos,
o protica com massa molecular como insulina, para seus processos
de, aproximadamente, 6,0 kDa, que metablicos. H, conseqentemen-
reagia com anticorpo contra a insu- te, descrena de que os vegetais
lina humana. Os estudos desse gru- possam se valer de insulina, por
po foram baseados nas experinci- exemplo, para o controle da meta-
as da medicina popular indiana, bolizao de acar em suas clu-
que indica serem os frutos e semen- las.
tes dessa cucurbitcea de grande Como exemplo dessa descren-
valor no tratamento do diabetes. a, h afirmaes facilmente en-
Posteriormente, Collier et al. contradas, como a que se segue
(1987) relataram o isolamento de (Brach, 2000):
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 37
 Uma vez que insulina
um hormnio em ani-
mais, as plantas certamen-
te no teriam um uso para
ela; assim ela pode no ter
qualquer efeito sobre as
mesmas (......) .
H um enorme interes-
se em se utilizarem plantas
como produtoras de pro-
tenas animais de difcil pre-
parao ou daquelas re-
queridas em grandes quan-
tidades, a preos acess-
veis. Como exemplo dis-
so, h tentativas de produ-
o de hormnio do crescimento
em plantas transformadas adequa-
damente (Staub et al, 2000). As
famosas plantas produtoras de va-
cinas esto freqentemente anun-
ciadas na literatura (Yu & Langrid-
ge, 2000). No caso da insulina, sua
produo utilizando-se a chamada
tecnologia do DNA recombinante
j uma indstria importante. A
indstria brasileira BIOBRS, de
Montes Claros, Minas Gerais, pro-
duz insulina humana, no propria-
mente utilizando clulas de vege-
tais, mas a partir de clulas de
Escherichia coli transformadas com
um gene da proinsulina humana
(BIOBRS, 1998). H uma iniciativa
do Professor Adilson Leite, da Uni-
versidade de Campinas, que procu-
ra transformar plantas de fumo com
um gene de insulina humana para
produo do hormnio em semen-
tes (FAPESP, 2000), alm de regis-
tro sobre transformao de batata
com um gene de insulina humana
(Arakawa et al, 1998).
Nossos resultados
Acaso
A descoberta de uma protena
com caractersticas da insulina bo-
vina foi feita no Laboratrio de
Qumica e Funo de Protenas e
Peptdeos, Centro de Biocincias e
Biotecnologia, Universidade Esta-
dual do Norte Fluminense, em Cam-
pos dos Goytacazes, Rio de Janeiro,
por acaso, durante investigaes
sobre o efeito de protenas do tegu-
mento de sementes de feijo-de-
38 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
Figura 3 Efeitos de insulinas
sobre os nveis de glicose no
sangue
porco (Canavalia ensiformis) (Fi-
gura 1) na sobrevivncia do carun-
cho ou gorgulho (Callosobruchus
maculatus) de feijo-de-corda (Vig-
na unguiculata). Resultados j
publicados (Oliveira et al., 1999)
mostram que a protena tem massa
molecular idntica e seqncia pri-
mria exatamente igual da insu-
lina bovina (Figura 2). Alm disso,
a protena isolada reage com anti-
corpos antiinsulina (humana e
bovina) da mesma maneira que
insulina bovina. Mostramos tam-
bm que a insulina isolada tem os
mesmos efeitos que a ani-
mal no abaixamento dos
nveis de glicose em ani-
mais diabticos (Figura 3).
Demonstramos, poste-
riormente, que a insulina
de sementes de feijo-de-
porco localiza-se exclusi-
vamente no tegumento e,
neste, em uma camada de
clulas que delimita o es-
pao entre esse tecido e os
cotildones (Figura 4).
Sabe-se que essa camada
de clulas est envolvida
no transporte de acar
das partes areas da planta para a
semente durante a formao desta
ltima. Juntamente com a molcula
de insulina, detectamos um frag-
mento de protena que apresentou
homologia de seqncia com o
receptor de insulina humana.
Em experimentos feitos com a
utilizao de anticorpos antiinsuli-
na e anti-receptor de insulina, mos-
tramos que essas duas protenas
exercem um efeito marcante du-
rante as primeiras etapas da germi-
nao, quando se d a embebio
de gua pela semente. A presena
de insulina estimula a emerso da
radcula que bloqueada quando
se adiciona anticorpo antiinsulina
ao meio (Figura 5). Os experimen-
tos sugerem fortemente que a insu-
lina possa estar exercendo papel
de sinalizador para a entrada de
glicose nas clulas.
Posteriormente, mas ainda no
publicados, resultados obtidos mos-
tram que as sementes de Canava-
lia braziliensis (feijo-de-boi), uma
espcie relacionada a C. ensifor-
mis, tambm contm insulina e seu
receptor.
A idia de que o papel da insu-
lina em plantas possa estar ligado a
processos de sinalizao necessri-
os para a metabolizao de glicose
semelhantes aos existentes em ani-
mais nos levou procura da mol-
cula em diferentes plantas.
Plantas antidiabticas
As vagens verdes de feijes so
recomendadas como sendo teis
no tratamento do dia-
betes. As vagens so
utilizadas para a prepa-
rao de chs ou con-
sumidas como saladas.
Folhas de diversas plan-
tas so tambm bastan-
te utilizadas para o tra-
tamento dessa afeco.
Diante dos resultados
obtidos com as semen-
tes de feijo-de-porco,
passamos a investigar
as vagens de feijo-de-
corda (Vigna unguicu-
lata) e as folhas de pata-
de-vaca (Bauhinia for-
ficata), duas plantas
bastante utilizadas no
Brasil (Panizza, 1997).
Alm de evidencia-
da a presena de insu-
lina em vagens e tegu-
mentos de sementes de
feijo-de-corda em for-
mao, mostramos sua
presena tambm nas folhas dessa
leguminosa (Venncio et al, 2000).
A presena do hormnio tambm
foi comprovada nas folhas de pata-
de-vaca. Neste ltimo caso, conse-
guimos mostrar que a insulina se
encontra predominantemente as-
sociada aos cloroplastos que so as
organelas responsveis pelos pro-
cessos fotossintticos que se do
nas folhas verdes (Azevedo, 2000).
Preparao de
insulinas de plantas
A descoberta de insulina em
tegumentos de feijo-de-porco foi
feita utilizando-se preparaes ob-
tidas a partir de extratos feitos com
tampes fosfato de potssio (50
mM, pH 7,6). Essas preparaes
eram cromatografadas em colunas
de troca inica e de filtrao mole-
cular e a sua pureza verificada por
eletroforese em gel de poliacrila-
mida. Aps a constatao de que
nossa preparao continha insuli-
na, feita inicialmente pelo seqen-
ciamento de amino cidos, passa-
mos a utilizar tcnicas de imuno-
qumica para a deteco da prote-
na. Utilizamos um anticorpo poli-
Figura 4 Imunolocalizao
de insulina no tegumento de
Canavalia ensiformis
clonal contra insulina humana e
empregamos tcnicas de ELISA e
de Western blot.
As insulinas de folhas das diver-
sas plantas estudadas foram detec-
tadas seja por extrao com tam-
pes alcalinos (fosfato ou borato)
seja por uma metodologia de extra-
o que emprega uma mistura de
etanol e gua e acidificao com
cido forte. Essa metodologia
semelhante que se emprega para
preparao de insulina a partir de
tecido pancretico (bovino ou de
outro animal). Em alguns casos,
lana-se mo do mtodo desenvol-
vido por Khann et al. (1976), que
utiliza extraes com misturas de
lcool e clorofrmio, nas etapas
iniciais. As etapas posteriores de
purificao, quando foram neces-
srias, foram feitas por meio de
tcnicas comuns de qumica de
protenas, como cromatografia em
troca inica e filtrao molecular. A formao dos cloroplastos das plan-
identidade da insulina foi sempre
mostrada por ELISA ou
por eletroforese em gel
de poliacrilamida, segui-
da de Western blot.
Conservao evoluci-
onria
Diante dos resultados
obtidos no LQFPP com
plantas da famlia das le-
guminosas, e tendo em
vista os resultados de
outros, com plantas de
outras famlias (ver Colli-
er et al., 1987, e Khann et
al., 1976), passamos a
examinar, utilizando tc-
nicas de imunoqumica
(ELISA, Western blot),
folhas de plantas de um
maior nmero de espci-
es. Essas foram selecio-
nadas no somente por
sua conhecida ao anti-
hiperglicmica relatada
na medicina popular, mas para co-
brir um grande nmero de espcies
dos diferentes grupos de vegetais.
Foram tambm includas plantas
tpicas da Regio Amaznica, co-
nhecida por sua grande biodiversi-
dade.
Os resultados obtidos mostram
que a maioria dos extratos de folhas
examinados contm molculas imu-
noreativas, seja em um ensaio em
meio lquido (ELISA) seja sobre
membranas (Western blot). Neste
ltimo caso, os resultados apontam
para a presena de molculas de
insulina que apresentam a mesma
massa molecular das insulinas ani-
mais. Grande parte dos resultados
aponta tambm para a complexa-
o da molcula de insulina de
plantas com compostos de nature-
za glicdica.
A fim de tentar estabelecer a
presena de insulina (ou antgenos
que se associam a anticorpos an-
tiinsulina) em grupos mais primiti-
vos, mostramos que essa molcula
est presente em uma cianobact-
ria (Spirulina sp). Esses organismos
tiveram origem em poca anterior
tas verdes (Cavalier-Smith, 2000).
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 39
 O conhecimento que se tem da
extenso da presena de insulina
em animais (Chan & Steiner, 2000)
associado aos resultados obtidos
por ns sobre a presena de insu-
lina em plantas e cianobactrias e
queles resultados dos que relatam
a presena desse hormnio em
bactrias (LeRoith et al., 1985) e
fungos (LeRoith et al., 1980), nos
levam a crer que essa molcula foi
conservada durante a evoluo,
sugerindo que ela esteja associada
aos processos de metabolizao de
glicose em todos os seres vivos.
As investigaes realizadas por
ns, alm de sugerirem que a insu-
lina est presente em plantas e
uma molcula evolucionariamente
conservada, tambm apontam para
a validao de produtos da medici-
na popular utilizados no tratamen-
to do diabetes. Esforos esto sen-
do dirigidos para compreender por-
que as insulinas de folhas de plan-
tas so eficazes mesmo quando
administradas oralmente.

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