Recuento Microbiano

Recuento Microscpico en Cmara de Neubauer

Mtodos y Tcnicas del Conteo de Microorganismos
LA CMARA DE NEUBAUER
Es un portaobjetos especial con una graduacin en superficie y unas
medidas muy concretas.
Superficie: 9 mm.
Consta de 9 recuadros de 1 mm por lado.
Recuadro central: dividido en 25.
La muestra se distribuye en 400 celdillas.
Profundidad: 0.1 mm (excavacin).
Volumen: 0.1 mm.
Se coloca la muestra entre el portaobjetos y el cubreobjetos.
Se deja reposar sobre la plataforma del microscopio unos minutos.
Se cuenta el nmero de clulas en varias celdillas.
Se obtiene un promedio, producto del conteo de 5 cuadrculas.
Se multiplica por 25.
VENTAJAS
INCONVENIENTES
Es un mtodo muy rpido.

Es muy eficaz para clulas relativamente grandes.

Slo sirve para suspensiones celulares relativamente concentradas.

No hace distincin entre clulas vivas y clulas muertas.

Con respecto a bacterias mviles, se debe inmovilizarlas previamente.

Es impreciso.
PROCEDIMIENTO
Recuento en Placa
FINALIDAD
Verificar la eficacia de los sistemas de limpieza y desinfeccin.
Tener una idea sobre la alteracin incipiente de los alimentos.
Poner de manifiesto las fuentes de contaminacin durante el proceso de
elaboracin de los alimentos.
Indicar la calidad de microbios de una determinada muestra.
Controlar el crecimiento microbiano o determinar la biomasa de lo
organismos viables.
USOS
Cuando se deba efectuar soluciones , se efectuar el conteo final tomando
como criterio microbiolgico el escoger aquella placa que presente entre 30
- 300 colonias, a partir de la cual se har la estimacin respectiva.
Se basa en la presuncin de que cada clula bacteriana pueda crecer en un
medio de cultivo slido formando colonias.
El Nmero Ms Problable
Se fundamenta en la conjuncin de clculos estadsticos y pruebas
bioqumicas que dependen del organismo que se evala.
Se debe tener en cuenta los lmites de confianza para las diferentes
combinaciones de los resultados positivos y negativos; as como el volumen
usado en los tubos al realizar la prueba y las diluciones respectivas.
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Peso Seco
Es la tcnica ms directa para la estimacin cuantitativa de una masa de
clulas y probablemente la ms segura y reproducible.
Solo puede utilizarse con suspensiones muy densas de clulas.
No diferencia clulas vivas y muertas.
Su sensibilidad es limitada.
Consiste en la separacin, secado y peso de las clulas del medio.
Turbidimetra
Sistema Nefelomtrica de McFarland
RECUENTO MICROBIANO
Estima la turbidez de una suspensin bacteriana mediante:
Fotmetro o Espectrofotmetro
Mide la luz transmitida:
"La disminucin de esta luz es proporcional a la concentracin de
microoganismos".
Nefelmetro
Se sustenta en contar con una batera de tubos de ensayo con diferentes
concentraciones de cloruro de Bario, la que produce turbidez en cada uno
de ellos.
INCONVENIENTES
Es un mtodo poco preciso.
Slo se emplea cuando no hace falta exactitud.
Ha sido desplazado por los mtodos espectrofotomtricos.
Estndares de Mcfarland:
Son tubos etiquetados del 1 al 10 que son llenados con una suspensin de
sales de Bario.
Cada tubo aproxima la turbidez de la solucin de bacterias correspondiente
al nmero de la escala de McFarland.
La escala de Mcfarland:
Escala enumerada del 1 al 10 que representa la concentracin especfica de
bacterias por mililitro.
Est diseada para estimar las concentraciones de bacterias Gram-.
Mide la luz dispersa:
"A mayor dispersin, mayor concentracin microbiana".
FUNDAMENTO BSICO
La luz interacta con el sistema electrnico molecular dipolo de la
suspensin, an cuando la luz no sea absorbida. La interaccin es tal que la
luz es disipada al igual que la longitud de onda.
LEY DE LAMBERT-BEER:
La absorbancia es proporcional a la concentracin y la aplica a la medida de
turbidez .
La intensidad de la luz disipada depende inversamente a la cuarta parte de
la potencia de la longitud de onda.
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Ventajas
Inconvenientes
Es ms exacta y precisa.
Es un mtodo de recuento automatizado que da resultados con clculos
matemticos.
La presencia de precipitados o sustancias producidas por las bacterias
puede aumentar turbidez.
No puede medir bacterias mviles.
No distingue clulas vivas de muertas.
Es impreciso si el nmero de microorganismos es escaso.
Es lento y subjetivo.
La forma de luz disipada depende del tamao, la forma, y el ndice de
refraccin del objeto.
VENTAJAS
INCONVENIENTES
Se deben emplear balanzas muy exactas.
VENTAJAS
DESVENTAJAS
No mide el nmero total de clulas sino nicamente las viables.
Es lento y tedioso.
No es preciso, pues la precisin depende del recuento de un nmero
elevado de colonia.
Tiene una gran sensibilidad. En condiciones y medio adecuados, se puede
detectar hasta una sola clula viva.
No requiere de equipo complicado.
VENTAJAS
DESVENTAJAS
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Tcnica fcil.
Proporciona un 95% de posibilidades de que la poblacin bacteriana est
dentro de un determinado margen.
Idea general de la poblacin bacteriana.
Permite determinar el nmero de clulas de un cultivo mixto que pueden
crecer en un medio lquido.
El mtodo es popular aunque poco exacto.
El mtodo del nmero ms probable nos proporciona un recuento de clulas
viables. Se basa en el principio de que una nica clula viva puede
desarrollarse y producir un cultivo turbio.
Se realizan diluciones seriadas al dcimo de la muestra de cultivo, en un
medio lquido.
Se incuban las muestras de dichos tubos problema.
Se examinan los tubos: los que fueron inoculados con clulas microbianas se
pondrn turbios, mientras que los que no permanecern transparentes.
A medida que se aumenta el factor de dilucin, se alcanzar un punto en el
cual algunos tubos contendrn tan slo un organismo y otros, ninguno.
La precisin del nmero ms probable aumenta con el nmero de tubos que
se usan, aunque cinco tubos por dilucin se considera como una relacin
apropiada entre la precisin y la economa.
Al determinar la probabilidad de que los tubos no recibieran ninguna clula,
se puede determinar el numero ms probable de microorganismos en la
muestra original, utilizando una tabla estadstica.
Consiste en el plaqueo de un volumen precedente de la muestra que se
analiza.
El resultado es en funcin de una serie de factores y los cultivos pueden
hacerse tanto en superficie como en profundidad.
Se emplea placas Petri que contengan el medio de cultivo idneo para el
crecimiento bacteriano.
Se siembra un volumen conocido de muestra.
Se procede a contar el nmero de colonias.
Se preparan diluciones, si la cantidad de bacterias es elevada.
Se siembra un determinado volumen en la placa Petri, para luego calcular el
nmero de bacterias por mililitro.
PROCEDIMIENTO
PROCEDIMIENTO
Mtodo de Filtracin
Se basa en el hecho de que la suspensin microbiana fluye a travs de un
papel filtro, donde las formas celulares quedan retenidas.
Con la ayuda de pinzas estriles, se retira el papel filtro y se deposita en la
superficie de agar nutritivo.
Se incuba la placa, y se contabiliza el nmero de colonias que aparecen en
ella, deducindo el nmero de microorganismos por mililitro de suspensin.
PROCEDIMIENTO
Es utilizado cuando el nmero de bacterias es bajo.
En la placa del medio de culivo, crecern tantas colonias como bacterias
hayan quedado adheridas al filtro.
Cuando la concentracin es baja y el volumen de la muesta es grande , la
muestra se hace pasar por un filtro cuyo poro retenga la bacteria. stas
sern transferidas a un medio de cultivo donde sern contadas las
bacterias.
VENTAJAS
DESVENTAJAS
Nos permite separar las bacterias del medio acuso.
Hay la posibilidad de que no todas las bacterias se queden en el filtro o sean
transferidas.
Los mtodos de recuento microbiano se clasifican en:

Mtodos Directos:

Mtodos Indirectos:
Permiten el recuento de todas las clulas.
Se basan en la medida de la evolucin del nmero de clulas vivas o del
nmero de partculas.
Requieren de preparaciones limpias, sin partculas extraas.
Miden el total de bacterias viables.
Se basan en la medida de algn parmetro de cultivo que nos permite
deducir informacin sobre la evolucin del nmero de microorganismos.
Miden la propiedad de la masa de las clulas
Ejemplos: Recuento en Cmara, Recuento en Placa, Nmero Ms Probable,
Filtracin, Sistema Nefelomtrico de McFarland.
Ejemplos: Peso seco y Turbidimetra.
POR: FABIOLA LUCA PANTIGOZO MORN
UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO
FACULTAD DE MEDICINA HUMANA
ESCUELA PROFESIONAL DE ESTOMATOLOGA
SEMESTRE 2014-20
MICROBIOLOGA E INMUNOLOGA BUCAL
SEMINARIO I
GRACIAS!
Procedimiento
Se tara un tubo de centrfuga.
Se centrigufa el cultivo y se elimina el sobrenadante.
Se seca el sedimento (105C, toda la hoche), hasta un peso constante.
Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de
peso hmedo.
R.M EN CAMARA DE NEUBAUER
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