PREPARACION DE GELES DE AGAROSA Y ANALISIS DEL DNA

La electroforesis se ha convertido en la tcnica ms utilizada para la separacin y

caracterizacin de molculas de cidos nucleicos. Los soportes mas utilizados en este procedimiento son la
agarosa y la poliacrilamida, dependiendo su eleccin del tamao de las molculas a separar. Molculas por
debajo de los 500 pares de bases (pb) son generalmente resueltas con mayor claridad en geles de poliacrilamida.
En agarosa pueden separarse molculas DNA de miles de pb.

La agarosa es un polisacarido natural que se obtiene principalmente de algas marinas. Es capas

de formar geles con rigidez suficiente para ser manipulados a partir del 0,2 % la agarosa no polimeriza al
melificar si no que simplemente sufre un cambio de estado, por lo que la variabilidad de la polimerizacin de la
poliacrilamida desaparece. Para formar los geles, la agarosa slida es disuelta en tampn TB 0,5X por
calentamiento el punto de fusin de la agarosa ordinaria esta alrededor de los 80C . sin embargo, la agarosa no
gelifica por debajo de unos 45C.

La movilidad del DNA en los geles de agarosa puede considerarse dependiente del efecto
tamiz de las fibras del gel, ya que cada vez que una molcula choca con una fibra del gel es retenida. El tamao
de la malla depende de la concentracin de la agarosa . En trminos generales puede decirse que a mayor
concentracin mayor resistencia al avance de la muestra sin embargo la linearidad solo se mantiene en un
margen estrecho de concentraciones perdindoce en valores extremos, especialmente a concentraciones altas de
agarosa .

La electroforesis en gel puede ser usada para determinar el tamao de las molculas del DNA
debido a la variabilidad de experimento a experimento, es necesario introducir patrones de tamao conocido en
cada gel que luego nos permitir determinar el tamao del DNA problema. en general se consigue una buena
correlacin entre el logaritmo del tamao y el de la movilidad relativa, como se muestran la figura 1

Objetivos:
Preparar geles de agarosa
Visualizar el DNA separado en gel de agarosa

REACTIVOS:

BUFFER TAE 50X

- 242 g de Trizma BAse

- 100 ml EDTA 0.5M, pH 8
- 57.2 ml Acido Acetico Glacial
- Volumen final 1000ml de agua destilada pH 8,4
Solucin de trabajo
- Para gel = 1X
- Para electroforesis = 0.5X

- BUFFER SAMPLE
- Agua destilada + glicerol 30% + azul brillante de comassie 0,01%
- Mezclar un volumen de solucin que contenga 1g de DNA con otro volumen igual de buffer
sample
- Colorante fluorescente: Bromuro de etidio
PREPARACION DEL GEL DE AGAROSA AL 1.5 %

Pesar 750 mg de agarosa y disolverlos con 50 ml de buffer TAE 1X en un erlenmeyer de 200 ml de capacidad,
calentarlo hasta una ebullicin para lograr una disolucin completa. Enfriar hasta aproximadamente 45 C,
aadir 1 ul de Colorante fluorescente y vaciar en un molde ya preparado (como se muestra en la figura 2) y en
posicin horizontal. colocar luego una peineta para formar los pocillos y dejar enfriar durante 30 minutos.
Una vez frios, retirar el gel del molde y envolverlos en bolsas plsticas con 2 ml de TAE1X para su
conservacion, sellarlas y guardar a 4 C. hasta su uso.

ELECTROFORESIS Y VISUALISACION DEL DNA

- Retirar las cintas adhesivas del molde y colocar este dentro de la cubeta de electroforesis, y cubrir
con TBE- 0,5X ( gel submarino )
- Con mucho cuidado colocar en los pocillos 1 g de DNA mezclado previamente con tampn de
muestra (Buffer Sample)
- Conectar la cubeta a una fuente de poder y aplicar una potencia de 130 V durante 60 minutos.
- Lavar el gel con agua destilada y visualizar por transiluminacion