2.6.12 y 2.6.13 PhEur 6

Farmacopea Europea 6.0 2.6.
12 Examen microbiolgico de productos no estriles
01/2008:20612
2.6.12 EXAMEN MICROBIOLGICO DE PRODUCTOS NO ESTRILES

(RECUENTO TOTAL DE AEROBIOS VIABLES)
En este captulo general se presentan dos conjuntos de pruebas. El primer conjunto presenta los
mtodos de referencia para determinar el cumplimiento con las monografas. Por tanto, la
referencia a este captulo en una monografa implica el cumplimiento con el primer conjunto de
pruebas, a menos que se haya autorizado el uso del segundo conjunto de pruebas. Las pruebas en
el segundo conjunto tambin constituyen mtodos oficiales de la Farmacopea Europea, y pueden
ser referidas como tales, especialmente en las solicitudes de autorizacin para venta. Se pretende
reemplazar el primer conjunto por el segundo conjunto una vez que las monografas concernientes
hayan sido revisadas. El segundo conjunto presenta las pruebas desarrolladas en cooperacin con
la Farmacopea Japonesa y con la Farmacopea de los Estados Unidos para lograr los requisitos
armonizados.
A. MTODO DE LA FARMACOPEA EUROPEA
Las pruebas descritas a continuacin permitirn la enumeracin cuantitativa de bacterias

mesoflicas y hongos que pueden crecer en condiciones aerobias.
Las pruebas estn diseadas principalmente para determinar si una sustancia mencionada en la
monografa en la Farmacopea cumple o no con los requisitos microbiolgicos especificados en la
monografa en cuestin. Cuando se usa para dichos propsitos, seguir las instrucciones que se
indican a continuacin, incluyendo el nmero de muestras que deben tomarse, e interpretar los
resultados como se establece a continuacin. Las pruebas pueden usarse tambin para la prueba de
Eficacia de los conservadores antimicrobianos (5.1.3) que se describe en la Farmacopea. Estas
pruebas pueden adems utilizarse para monitorear la calidad de la materia prima y pueden usarse en
asociacin con los lineamientos sobre Calidad microbiolgica de preparaciones farmacuticas
(5.1.4). Cuando se usan para dichos propsitos, por ejemplo por un fabricante de materias primas
y/o monitoreo de producto terminado o para validacin de procesos, la realizacin de las pruebas,
incluyendo el nmero de muestras que deben tomarse y la interpretacin de los resultados, son
asuntos de acuerdos entre el fabricante y la autoridad competente.
Realizar la determinacin en las condiciones diseadas para evitar la contaminacin accidental del
producto que va a ser examinado. Las precauciones tomadas para evitar la contaminacin deben ser
tales que no afecten a ningn microorganismo que se revele en la prueba. Si el producto que va a
ser examinado tiene actividad antimicrobiana, sta debe ser neutralizada adecuadamente. Si se usan
inactivadores para este propsito, debe demostrarse su eficacia y su no toxicidad contra los
microorganismos.
Determinar el recuento total de aerobios viables mediante el mtodo de filtracin por membrana o
mediante el mtodo de recuento en placa, segn se indique en la monografa.
El Mtodo del Nmero Ms Probable (NMP) se reserva para recuentos bacterianos cuando no se
dispone de otro mtodo. La seleccin de un mtodo puede basarse en factores como la naturaleza
del producto y el nmero esperado de microorganismos. Cualquiera de los mtodos que se
seleccione debe ser validado apropiadamente.
1
Farmacopea Europea 6.0 2.6.12 Examen microbiolgico de productos no estriles
Cuando se usa junto con el captulo 5.1.3 o 5.1.4, puede usarse el mtodo de vertido en placa, el
mtodo de dispersin en superficie y el mtodo de filtracin por membrana.
PREPARACIN DE LA MUESTRA
Plan de muestreo. El muestreo del producto debe seguir un plan de muestreo bien definido. El plan
de muestreo depender de factores como el tamao del lote, los riesgos para la salud asociados con
productos inaceptable y elevadamente contaminados, las caractersticas del producto y el nivel de
contaminacin esperado. A menos que se indique de otra manera, utilizar muestras de 10 g o 10 mL
de la sustancia o preparacin que va a ser examinada, tomadas con las precauciones mencionadas
anteriormente. Seleccionar la(s) muestra(s) al azar del material en granel o de los contenedores
disponibles de la preparacin. Si es necesario, para obtener la cantidad requerida, mezclar el
contenido de un nmero suficiente de contenedores para obtener cada muestra, dependiendo de la
naturaleza de la sustancia o de la preparacin que va a ser examinada.
Un ejemplo de un plan de muestreo aplicable a productos en que la homogeneidad con respecto a la

distribucin de los microorganismos puede ser un problema, es el plan de muestreo clase tres. En
este caso, se toman cinco muestras de cada lote y se investigan por separado. Las tres clases
reconocidas son:
(i) muestras aceptables, es decir, muestras que contienen menos de m UFC (unidades formadoras de
colonias) por gramo o mililitro, donde m es el lmite especificado en la monografa relevante;
(ii) muestras marginales, es decir, con ms de m UFC, pero menos de 10 m UFC por gramo o
mililitro;
(iii) muestras defectuosas, es decir, que contienen ms de 10m UFC por gramo o mililitro.
Productos solubles en agua. Disolver o diluir 10 g o 10 mL del producto que va a ser examinado
en solucin amortiguada de cloruro de sodio-peptona pH 7.0 o en otro lquido adecuado. En
general, se prepara una dilucin uno en diez. Sin embargo, las caractersticas del producto, o la
sensibilidad requerida pueden necesitar el uso de otras proporciones. Si se sabe que el producto
tiene actividad antimicrobiana, puede agregarse un agente inactivador al diluyente. Si es necesario,
ajustar el pH en aproximadamente 7 y preparar diluciones decimales en serie utilizando el mismo
diluyente.
Productos no grasos insolubles en agua. Suspender 10 g o 10 mL del producto que va a ser

examinado en solucin amortiguada de cloruro de sodio-peptona pH 7.0 o en otro lquido adecuado.
En general, se prepara una dilucin uno en diez. Sin embargo, las caractersticas de algunos
productos pueden necesitar el uso de volmenes mayores. Puede agregarse un agente tensoactivo
adecuado, como 1 g/L de polisorbato 80, para ayudar a la suspensin de las sustancias que no se
mojan bien. Si se sabe que el producto tiene actividad antimicrobiana, puede agregarse un agente
inactivador al diluyente. Si es necesario, ajustar el pH en aproximadamente 7 y preparar diluciones
decimales en serie utilizando el mismo diluyente.
Productos grasos. Homogeneizar 10 g o 10 mL del producto que va a ser examinado con no ms

de la mitad de su peso de polisorbato 80 estril u otro agente tensoactivo adecuado, calentando, si es
necesario, a no ms de 40C, en casos excepcionales a no ms de 45C. Mezclar cuidadosamente y,
si es necesario, mantener la temperatura en un bao de agua o en una incubadora. Agregar suficiente
solucin amortiguada, precalentada de cloruro de sodio-peptona pH 7.0 para preparar una dilucin
uno en diez del producto original. Mezclar cuidadosamente mientras se mantiene la temperatura
durante el tiempo ms corto necesario para la formacin de una emulsin y en ningn caso durante
no ms de 30 min. Pueden preparase diluciones decimales en serie utilizando solucin amortiguada
2
de cloruro de sodio-peptona pH 7.0 que contenga una concentracin adecuada de polisorbato 80

estril u otro agente tensoactivo adecuado.
Parches transdrmicos. Retirar las cubiertas protectoras (quitar el forro) de diez parches de la
preparacin transdrmica, utilizando pinzas estriles y colocarlos, con el lado adhesivo hacia arriba,
sobre charolas de vidrio o plstico estriles. Si es necesario, cubrir la superficie adhesiva con gasa
estril (o malla de polmero monofilamento tipo filtro tejido), y transferir los diez parches a un
volumen mnimo de 500 mL de solucin amortiguada de cloruro de sodio-peptona pH 7.0 que
contenga inactivadores adecuados, como polisorbato 80 y/o lecitina. Agitar vigorosamente la
preparacin durante al menos 30 minutos (preparacin A). Preparar otros diez parches de la misma
manera, colocarlos en un volumen mnimo de 500 mL de caldo de medio D y agitar vigorosamente
durante al menos 30 minutos (preparacin B).
EXAMEN DE LA MUESTRA
Filtracin por membrana. Utilizar filtros de membrana que tengan un tamao de poro nominal no
mayor de 0.45 m y cuya efectividad para retener bacterias haya sido establecida. El tipo de
material del filtro se selecciona de tal manera que la eficiencia de retencin de bacterias no se afecte
por los componentes de la muestra que va a ser investigada. Los filtros de nitrato de celulosa, por
ejemplo, pueden usarse para soluciones acuosas, oleosas y dbilmente alcohlicas y los filtros de
acetato de celulosa, por ejemplo, para soluciones fuertemente alcohlicas. El aparato de filtracin
est diseado para permitir la transferencia del filtro al medio de cultivo.
Transferir una cantidad adecuada de la muestra preparada como se describe en la seccin

Preparacin de la muestra (de preferencia representando 1 g del producto o menos, si se esperan
grandes nmeros de unidades formadoras de colonias) a cada uno de dos filtros de membrana, y
filtrar inmediatamente. Lavar cada filtro con tres cantidades, cada una de alrededor de 100 mL de
un lquido adecuado, como una solucin amortiguada de cloruro de sodio-peptona pH 7.0. A esta
solucin, pueden agregarse agentes tensoactivos como polisorbato 80 o inactivadores de agentes
antimicrobianos. Si est validado, pueden aplicarse menos de tres lavados. Transferir uno de los
filtros de membrana, destinados principalmente para la enumeracin de las bacterias, a la superficie
de un medio de agar adecuado, como el medio B y el otro, destinado principalmente para la
enumeracin de hongos, a la superficie de un medio de agar adecuado, como el medio C. Incubar la
placa de medio B de agar de 30C a 35C y la placa de medio C de agar de 20C a 25C durante
cinco das, a menos que se obtenga un recuento confiable en un tiempo ms corto. Seleccionar las
placas con el nmero ms elevado menor de 100 colonias, y calcular el nmero de unidades
formadoras de colonias por gramo o mililitro del producto.
Cuando se examinan parches transdrmicos, filtrar 50 mL de la preparacin A por separado, a travs

de cada uno de dos filtros de membrana estriles. Colocar una membrana en el medio de agar B
para el recuento total de aerobios y la otra membrana en el medio de agar C para el recuento de
hongos.
Mtodos de recuento en placa
a. Mtodo de vertido en placa. Utilizando cajas Petri de 9 cm de dimetro, agregar a cada caja
1 mL de la muestra preparada como se describe en la seccin Preparacin de la muestra, y 15 mL
a 20 mL de un medio de agar licuado, adecuado para el cultivo de bacterias (como el medio B), o 15
a 20 mL de un medio de agar licuado adecuado para el cultivo de hongos (como el medio C) a no
ms de 45C. Si se usan cajas Petri ms grandes, se incrementa la cantidad de agar de manera
correspondiente. Preparar para cada medio al menos dos cajas Petri para cada nivel de dilucin.
3
Incubar las placas a 30-35C (20-25C para hongos) durante cinco das, a menos que en menos
tiempo se obtenga un recuento confiable. Seleccionar las placas que correspondan a una dilucin y
que muestren el mayor nmero de colonias menores de 300 (100 colonias para los hongos). Utilizar
la media aritmtica de los recuentos y calcular el nmero de unidades formadoras de colonias por
gramo o mililitro.
b. Mtodo de dispersin en superficie. Utilizando cajas Petri de 9 cm de dimetro, agregar 15-

20 mL de un medio de agar licuado adecuado para el cultivo de bacterias (como el medio B), o 15-
20 mL de un medio de agar licuado adecuado para el cultivo de hongos (como el medio C) a no ms
de 45C a cada caja Petri y dejar solidificar. Si se usan cajas Petri ms grandes, incrementar el
volumen del agar de manera correspondiente. Secar las placas, por ejemplo en una campana de flujo
de aire laminar o en una incubadora. Dispersar un volumen medido de no menos de 0.1 mL de la
muestra preparada como se describe en la seccin Preparacin de la muestra sobre la superficie
del medio. Utilizar al menos dos cajas Petri para cada medio y nivel de dilucin. Para la incubacin
y el clculo del nmero de unidades formadoras de colonias, proceder como se describe para el
mtodo de vertido en placa.
Mtodo del nmero ms probable
La precisin y exactitud del mtodo del nmero ms probable (NMP) es menor que la del mtodo
de filtracin en membrana o de los mtodos de recuento en placa. Se obtienen resultados no
confiables, particularmente para la enumeracin de hongos. Por estas razones, el mtodo del NMP
se reserva para la enumeracin de bacterias en situaciones en que no se dispone de otro mtodo. Si
se justifica el uso del mtodo, proceder como sigue.
Preparar una serie de al menos tres diluciones decimales subsecuentes del producto, como se
describe en la seccin Preparacin de la muestra. De cada nivel de dilucin se usan tres alcuotas
de 1 g o 1 mL para inocular tres tubos con 9-10 mL de un medio lquido adecuado (como el caldo
de medio A). Si es necesario, puede agregarse en el medio un agente tensoactivo como el
polisorbato 80 o un inactivador de agentes antimicrobianos. De esta manera, si se preparan tres
niveles de dilucin, se inoculan nueve tubos. Incubar todos los tubos durante cinco das de 30-
35C. Registrar para cada nivel de dilucin el nmero de tubos que muestran crecimiento
microbiano. Si la lectura de los tubos es difcil o incierta debido a la naturaleza del producto
examinado, subcultivar en el mismo caldo o en un medio de agar adecuado (como el medio de agar
B), durante 18-24 h a la misma temperatura, y usar estos resultados. Utilizando la Tabla 2.6.12.-1,
determinar el nmero ms probable de bacterias por gramo o mililitro del producto examinado.
4
Tabla 2.6.12.-1. Valores de nmero ms probable de bacterias
Tres tubos en cada nivel de dilucin

Nmero de tubos positivos NMP por Categora* Lmites de confianza
0.1 g 0.01 g 0.001 g gramo 1 2 al 95 por ciento
0 0 0 <3 - -
0 1 0 3 x <1 17
1 0 0 3 x 1 21
1 0 1 7 x 2 27
1 1 0 7 x 2 28
1 2 0 11 x 4 35
2 0 0 9 x 2 38
2 0 1 14 x 5 48
2 1 0 15 x 5 50
2 1 1 20 x 8 61
2 2 0 21 x 8 63
3 0 0 23 x 7 129
3 0 1 38 x 10 180
3 1 0 43 x 20 210
3 1 1 75 x 20 280
3 2 0 93 x 30 390
3 2 1 150 x 50 510
3 2 2 210 x 80 640
3 3 0 240 x 100 1400
3 3 1 460 x 200 2400
3 3 2 1100 x 300 4800
3 3 3 > 1100 - -
* Categora 1: Resultados normales obtenidos en 95 por ciento de los casos.
* Categora 2: Resultados menos probables obtenidos en slo 4 por ciento de los casos. Estos no se
usan para decisiones importantes. Los resultados que son an menos probables que
los de la categora 2 no se mencionan y siempre son inaceptables.
5
EFECTIVIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y VALIDEZ DEL MTODO DE RECUENTO
Cultivar las cepas de prueba bacterianas por separado en contenedores que tengan un medio lquido
adecuado (como caldo de medio A) a 30-35C durante 18 h a 24 h. Cultivar las cepas de prueba de
hongos por separado en un medio de agar adecuado (como el medio C sin antibiticos) a 20-25C
durante 48 horas para Candida albicans, a 20-25C durante 7 das para Aspergillus niger.
Staphylococcus aureus tal como ATCC 6538 (NCIMB 9518, CIP 4.83)
Escherichia coli tal como ATCC 8739 (NCIMB 8545, CIP 53.126)
Bacillus subtilis tal como ATCC 6633 (NCIMB 8054, CIP 52.62)
Candida albicans tal como ATCC 10231 (NCPF 3179, IP 48.72)
Aspergillus niger tal como ATCC 16404 (IMI 149007, IP 1431.83)
Utilizar solucin amortiguada de cloruro de sodio-peptona pH 7.0 para preparar suspensiones de

referencia que contengan alrededor de 100 unidades formadoras de colonias por mililitro. Utilizar la
suspensin de cada uno de los microorganismos por separado como control de los mtodos de
conteo, en presencia y ausencia del producto que va a ser examinado. Cuando se analiza por el
mtodo de filtracin por membrana o por el mtodo de recuento en placa, debe obtenerse un
recuento de cualquiera de los organismos de prueba que difiera en no ms de un factor de cinco del
valor calculado del inculo. Cuando se analiza por el mtodo del nmero ms probable, el valor
calculado del inculo est dentro del 95 por ciento de los lmites de confianza de los resultados
obtenidos. Para probar la esterilidad del medio y del diluyente y el comportamiento asptico de la
prueba, llevar a cabo el mtodo utilizando solucin estril de cloruro de sodio-peptona pH 7.0 como
la preparacin de prueba. No debe haber crecimiento de microorganismos.
INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS
El recuento bacteriano se considerar igual al nmero promedio de unidades formadoras de colonias

encontradas en el medio de agar B. El recuento de hongos se considerar igual al nmero promedio
de unidades formadoras de colonias encontradas en el medio de agar C. El recuento total de
aerobios viables es la suma del recuento bacteriano y del recuento de hongos como se describi
anteriormente. Si hay evidencia de que los mismos tipos de microorganismos crecen en ambos
medios, esto puede corregirse. Si el recuento se realiza mediante el mtodo del nmero ms
probable, el valor calculado es el recuento bacteriano.
Cuando se indica un lmite en una monografa, ste se interpreta como sigue:
102 microorganismos: lmite mximo aceptable: 5 x 102,
103 microorganismos: lmite mximo aceptable: 5 x 103 y as, sucesivamente.
Si se usa un plan de muestreo como el plan de muestreo clase tres, proceder como sigue:
Calcular el recuento total de aerobios viables por separado para cada una de las cinco muestras. La
sustancia o preparacin pasa la prueba si se cumplen las siguientes condiciones:
6
(i) ninguno de los recuentos totales de aerobios viables individuales excede el lmite prescrito en un
factor de diez o ms (es decir, muestras inaceptables);
(ii) no ms de dos de los recuentos totales de aerobios viables individuales estn entre el lmite
prescrito y diez veces su lmite (es decir, no ms de dos muestras marginales).
Las soluciones y los medios de cultivo recomendados estn descritos en el captulo general 2.6.13.
B. MTODO ARMONIZADO: EXAMEN MICROBIOLGICO DE PRODUCTOS NO

ESTRILES: PRUEBAS DE ENUMERACIN MICROBIANA
1. INTRODUCCIN
Las pruebas descritas a continuacin permitirn la enumeracin cuantitativa de bacterias

mesoflicas y hongos que pueden crecer en condiciones aerobias.
Las pruebas estn diseadas principalmente para determinar si una sustancia o preparacin
mencionada cumple con una especificacin establecida para la calidad microbiolgica. Cuando se
usa para dichos propsitos, seguir las instrucciones que se indican a continuacin, incluyendo el
nmero de muestras que deben tomarse, e interpretar los resultados como se establece a
continuacin.
Los mtodos no se aplican para productos que contienen microorganismos viables como
ingredientes activos.
Pueden usarse procedimientos microbiolgicos alternativos, incluyendo mtodos automatizados,

siempre y cuando se haya demostrado su equivalencia con el mtodo de la Farmacopea.
2. PROCEDIMIENTOS GENERALES
Realizar la determinacin en las condiciones diseadas para evitar la contaminacin microbiana

extrnseca del producto que va a ser examinado. Las precauciones tomadas para evitar la
contaminacin deben ser tales que no afecten a ningn microorganismo que se revele en la prueba.
Si el producto que va a ser examinado tiene actividad antimicrobiana, sta debe ser removida o
neutralizada en la medida en que sea posible. Si se usan inactivadores para este propsito, debe
demostrarse su eficacia y su falta de toxicidad contra los microorganismos.
Si se usan sustancias tensoactivas para la preparacin de la muestra, debe demostrarse su ausencia

de toxicidad para los microorganismos y su compatibilidad con los inactivadores usados.
3. MTODOS DE ENUMERACIN
Usar el mtodo de filtracin por membrana o el mtodo de recuento en placa, segn se indique. El
mtodo del nmero ms probable (NMP) generalmente es el mtodo menos exacto para los
recuentos microbianos, sin embargo, para algunos grupos de productos con una biocarga muy baja,
ste puede ser el mtodo ms apropiado.
La seleccin del mtodo se basa en factores como la naturaleza del producto y el lmite requerido de
microorganismos. El mtodo seleccionado debe permitir la prueba de un tamao de muestra
7
suficiente para juzgar el cumplimiento con la especificacin. Debe establecerse la idoneidad del
mtodo seleccionado.
4. PRUEBA DE PROMOCIN DEL CRECIMIENTO E IDONEIDAD DEL MTODO DE

RECUENTO
4-1. CONSIDERACIONES GENERALES
Debe establecerse la habilidad de la prueba para detectar microorganismos en presencia del

producto que va a ser probado.
La idoneidad debe confirmarse cuando se introduce un cambio en la realizacin de la prueba o en el

producto, que pudiera afectar el resultado de la prueba.
4-2. PREPARACIN DE LAS CEPAS DE PRUEBA
Usar suspensiones estables estandarizadas de cepas de prueba o prepararlas como se indica a

continuacin. Se usan tcnicas de mantenimiento del cultivo del lote de siembra (sistemas del lote
de siembra), de forma tal que los microorganismos viables usados para la inoculacin provienen de
no ms de 5 pases tomados a partir del lote de siembra maestro original. Cultivar por separado cada
cepa de prueba de bacterias y hongos, como se describe en la Tabla 2.6.12:2.
Usar solucin amortiguada de cloruro de sodio-peptona pH 7.0 o solucin amortiguadora de fosfato

pH 7.2 para preparar las suspensiones de prueba; para suspender las esporas de A. niger, se puede
agregar 0.05 por ciento de polisorbato 80 en el buffer. Usar las suspensiones dentro de 2 horas o
dentro de 24 h si se almacenan a 2 - 8 C. Como una alternativa para preparar y luego diluir una
suspensin fresca de clulas vegetativas de A. niger o B. subtilis, se prepara una suspensin estable
de esporas y luego se usa un volumen apropiado de la suspensin de esporas para la inoculacin de
prueba. La suspensin estable de esporas puede mantenerse a 2 - 8 C durante un periodo de tiempo
validado.
4-3. CONTROL NEGATIVO
Para verificar las condiciones de prueba, se realiza un control negativo usando el diluyente
seleccionado en vez de la preparacin de prueba. No debe haber crecimiento de microorganismos.
4.4. PROMOCIN DEL CRECIMIENTO DEL MEDIO
Probar cada lote de medio listo para preparar y cada lote de medio preparado a partir de medio
deshidratado o de los ingredientes descritos.
Inocular porciones/placas de caldo digerido de casena de soya y agar digerido de casena de soya
con un pequeo nmero (no ms de 100 UFC) de los microorganismos indicados en la Tabla
2.6.12.-2, usando una porcin/placa de medio separada para cada microorganismo. Inocular las
placas de agar Sabouraud-dextrosa con un pequeo nmero (no ms de 100 UFC) de los
microorganismos indicados en la Tabla 2.6.12:2, usando una placa separada de medio para cada
uno. Incubar en las condiciones descritas en la Tabla 2.6.12:2.
Para los medios slidos, el crecimiento obtenido no debe diferir en un factor mayor que 2 a partir
del valor calculado para un inculo estandarizado. Para un medio recin preparado, el crecimiento
de los microorganismos ocurre de forma comparable con el crecimiento previamente obtenido con
8
un lote de medio previamente probado y aprobado. Los medios lquidos son adecuados si ocurre un
crecimiento de los microorganismos claramente visible comparable con el crecimiento previamente
obtenido con un lote de medio previamente probado y aprobado.
4-5. IDONEIDAD DEL MTODO DE RECUENTO EN PRESENCIA DE PRODUCTO
4-5-1. Preparacin de la muestra. El mtodo de preparacin de la muestra depende de las

caractersticas fsicas del producto que va a ser probado. Si no puede demostrarse que ninguno de
los procedimientos descritos a continuacin es satisfactorio, deber desarrollarse un procedimiento
alternativo.
Productos solubles en agua. Disolver o diluir (usualmente se prepara una dilucin 1 en 10) el
producto que va a ser examinado en solucin amortiguada de cloruro de sodio-peptona pH 7.0,
solucin amortiguadora de fosfato pH 7.2 o caldo de digerido de casena de soya. Si es necesario,
ajustar el pH 6-8. Cuando sea necesario, se preparan diluciones adicionales con el mismo diluyente.
Productos no grasos insolubles en agua. Suspender el producto que va a ser examinado

(usualmente se prepara una dilucin 1 en 10) en solucin amortiguada de cloruro de sodio-peptona
pH 7.0, solucin amortiguadora de fosfato pH 7.2 o caldo de digerido de casena de soya. Puede
agregarse un agente tensoactivo, por ejemplo 1 g/L de polisorbato 80, para ayudar a suspender las
sustancias que se mojan pobremente. Si es necesario, ajustar el pH en 6-8. Cuando sea necesario, se
preparan diluciones adicionales con el mismo diluyente.
Productos grasos. Disolver en miristato de isopropilo, esterilizado por filtracin, o mezclar el

producto que va a ser examinado con la cantidad mnima necesaria de polisorbato 80 estril u otro
agente tensoactivo estril no inhibidor, calentado si fuera necesario a no ms de 40C, o en casos
excepcionales a no ms de 45C. Mezclar cuidadosamente, y si es necesario mantener la
temperatura en un bao de agua. Agregar una cantidad suficiente del diluyente precalentado
seleccionado para preparar una dilucin 1 en 10 del producto original. Mezclar cuidadosamente
mientras se mantiene la temperatura durante el tiempo ms corto necesario para la formacin de una
emulsin. Se pueden preparar diluciones adicionales decimales en serie usando el diluyente
seleccionado que contenga una concentracin adecuada de polisorbato 80 u otro agente tensoactivo
estril no inhibidor.
Fluidos o slidos en forma de aerosol. Transferir aspticamente el producto a un aparato con filtro
de membrana o a un contenedor estril para realizar el muestreo subsiguiente. Usar el contenido
total de nmero definido de dosis medidas de cada contenedor probado.
Parches transdrmicos. Remover la cubierta protectora ('quitar el forro') de los parches

transdrmicos, y colocarlos con el lado adhesivo hacia arriba, sobre charolas estriles de vidrio o de
plstico. Cubrir la superficie adhesiva con un material poroso estril, por ejemplo una gasa, para
evitar que los parches se peguen entre si, y transferir los parches a un volumen adecuado del
diluyente seleccionado que contenga inactivadores como polisorbato 80 y/o lecitina. Agitar la
preparacin vigorosamente durante por lo menos 30 minutos.
9
Tabla 2.6.12.-2. Preparacin y uso de los microorganismos de prueba
Microorganismo Preparacin de Promocin del crecimiento Idoneidad del mtodo de contero en

la cepa de presencia del producto
prueba
Cuenta Cuenta total de Cuenta total de Cuenta total de
microbiana de levaduras y microorganismos levaduras y
aerobios totales hongos aerobios hongos
Slaphylacoccus Agar de Agar de Agar de digerido
aureus digerido de digerido de de casena de
como: casena de soya casena de soya soya/caldo de
ATCC 6538 o caldo de o caldo de digerido de
NCIMB 9518 digerido de digerido de - casena de -
CIP 4.83 casena de soya casena de soya soya/NMP
NBRC 13276 30-35 C 100 UFC 100 UFC
18.24 h 30-35 C 30-35 C
3 das 3 das
Pseudomronas Agar de Agar de Agar de digerido
aeruginosa digerido de digerido de de casena de
como: casena de soya casena de soya soya/caldo de
NBRC 13275 30-35 C 100 UFC 100 UFC
18.24 h 30-35 C 30-35 C
3 das 3 das
Bacillus Agar de Agar de Agar de digerido
subtilitis digerido de digerido de de casena de
como : casena de soya casena de soya soya/caldo de
NBRC 3134 30-35 C 100 UFC 100 UFC
18.24 h 30-35 C 30-35 C
3 das 3 das
Candida Agar Agar Agar Agar de digerido Agar Sabouraud-
albicans Sabouraud- Sabouraud- Sabouraud- de casena de dextrosa
como: dextrosa dextrosa dextrosa soya 100 UFC
ATCC 10231 o caldo 100 UFC 100 UFC 100 UFC 20-25 C
NCPF 3179 Sabouraud- 20-25 C 20-25 C 30-35C 5 das
IP 48.72 dextrosa 5 das 5 das 5 das
NBRC 1594 20-25C MPN: no se
2-3 das aplica
Aspergillus Agar Agar Agar Agar de digerido Agar Sabouraud-
niger como: Sabouraud- Sabouraud- Sabouraud- de casena de dextrosa
ATCC 16404 dextrosa o agar dextrosa dextrosa soya 100 UFC
IMI 149007 papa-dextrosa 100 UFC 100 UFC 100 UFC 20-25 C
IP 1431.83 20-25C 20-25 C 20-25 C 30-35C 5 das
NBRC 9455 5-7 das, o hasta 5 das 5 das 5 das
lograr una MPN: no se
buena aplica
esporulacin
10
4-5-2. Inoculacin y dilucin. Agregar en la muestra preparada como se describi anteriormente

(4-5-1) y en un control (sin el material de prueba incluido) un volumen suficiente de la suspensin
microbiana para obtener un inculo de no ms de 100 UFC. El volumen de la suspensin del
inculo no debe exceder el 1 por ciento del volumen del producto diluido.
Para demostrar el recobro microbiano aceptable a partir del producto, se debe usar el factor de
dilucin ms bajo posible de la muestra preparada para la prueba. Cuando esto no es posible debido
a la actividad antimicrobiana o a una solubilidad pobre, se deben desarrollar protocolos apropiados.
Si la inhibicin del crecimiento por la muestra no puede evitarse por otro medio, la alcuota de la
suspensin microbiana puede agregarse despus de la neutralizacin, dilucin o filtracin.
4.5.3. Neutralizacin/remocin de la actividad antimicrobiana. El nmero de microorganismos

recuperados a partir de la muestra preparada diluida como se describe en 4-5-2 e incubada de
acuerdo con el procedimiento descrito en 4 .5-4, se compara con el nmero de microorganismos
recuperados de la preparacin control.
Si el crecimiento es inhibido (reduccin en un factor mayor que 2), modificar el procedimiento para
la prueba de conteo particular, para asegurar la validez de los resultados. La modificacin del
procedimiento puede incluir, por ejemplo, (1) un aumento en el volumen del diluyente o del medio
de cultivo, (2) incorporacin de agentes neutralizantes especficos o generales en el diluyente, (3)
filtracin por membrana, o (4) una combinacin de las medidas anteriores.
Agentes neutralizantes. Los agentes neutralizantes pueden ser usados para neutralizar la actividad
de los agentes antimicrobianos (Tabla 2.6.12-3). stos pueden agregarse en el diluyente o en el
medio seleccionado, preferentemente antes de la esterilizacin. Si se usan, su eficacia y su ausencia
de toxicidad para los microorganismos deben demostrarse realizando un blanco con el neutralizante
y sin el producto.
Tabla 2.6.12:3. Agentes neutralizantes comunes parasustancias interferentes
Sustancia interferente Mtodo neutralizante potencial

Glutaraldehdo, mercuriales Sulfito hidrogenado de sodio
(bisulfito de sodio)
Fenlicos, alcohol, aldehdos, sorbato Dilucin
Aldehdos Glicina
Compuestos Cuaternarios Amonio Lecitina
(CCAs), parahidroxibenzoatos (parabenos),
bis-guanidinas
CCAs, yodo, parabenos Polisorbato
Mercuriales Tioglicolato
Mercuriales, halgenos, aldehdos Tiosulfato
EDTA (edetato) Iones Mg2+ o Ca2+
Sin no puede encontrarse un mtodo neutralizante adecuado, puede suponerse que la falla para
aislar el microorganismo inoculado es atribuible a la actividad microbicida del producto. Esta
informacin sirve para indicar que no es probable que producto se contamine con las especies dadas
de los microorganismos. Sin embargo, es posible que el producto solamente inhiba algunos de los
microorganismos aqu especificados, pero que no inhiba otros microorganismos no incluidos entre
11
las cepas de prueba o para el cual estas ltimas no son representativas. Entonces, realizar la prueba
con el factor de dilucin ms alto compatible con el crecimiento microbiano y el criterio de
aceptacin especfico.
4-5-4. Recobro de microorganismos en presencia del producto. Para cada microorganismo

listado, se realizan pruebas separadas. Solamente se cuentan los microorganismos de la cepa de
prueba agregada.
4-5-4-1. Filtracin por membrana. Usar filtros de membrana que tengan un tamao de poro
nominal no mayor que 0.45 m. El tipo del material del filtro se selecciona de forma tal que la
eficiencia para retener bacterias no sea afectada por los componentes de la muestra que va a ser
investigada. Para cada microorganismo listado, se usa un filtro de membrana.
Transferir una cantidad adecuada de la muestra preparada como se describe en 4-5-1 a 4-5-3
(preferiblemente que represente 1 g del producto, o menos si se esperan grandes nmeros de UFC)
al filtro de membrana, filtrar inmediatamente y enjuagar el filtro de membrana con un volumen
adecuado de diluyente.
Para la determinacin del recuento microbiano de aerobios totales (total aerobic microbial count,
TAMC), transferir el filtro de membrana a la superficie del agar digerido de casena de soya. Para la
determinacin del recuento total combinado de levaduras/hongos (total combined yeasts/moulds
count, TYMC), transferir la membrana a la superficie de agar Sabouraud-dextrosa. Incubar las
placas como se indica en la Tabla 2.6.12:2. Realizar el conteo.
4-5-4-2. Mtodos de recuento en placa. Realizar los mtodos de recuento en placa al menos por
duplicado para cada medio, y usar el recuento promedio del resultado.
4-5-4-2-1. Mtodo de vertido en placa

Para las cajas Petri de 9 cm de dimetro, agregar en la caja 1 mL de la muestra preparada como se
describe en 4-5-1 a 4-5-3 y 15-20 mL de agar de digerido de casena de soya o agar Sabouraud-
dextrosa, ambos medios a una temperatura no mayor de 45C. Si se usan cajas Petri ms grandes, la
cantidad de medio de agar se aumenta de manera correspondiente. Para cada microorganismo
listado en la Tabla 2.6.12.-2, se usan al menos 2 cajas Petri. Incubar las placas como se indica en la
Tabla 2.6.12.-2. Obtener el promedio aritmtico de los recuentos por medio de cultivo y calcular el
nmero de UFC en el inculo original.
4-5-4-2-2. Mtodo de dispersin en la superficie

Para las cajas Petri de 9 cm de dimetro, agregar 15-20 mL de agar de digerido de casena de soya o
agar Sabouraud-dextrosa aproximadamente a 45C en cada caja Petri, y dejar solidificar. Si se usan
cajas Petri ms grandes, el volumen del agar se aumenta de manera correspondiente.
Secar las placas, por ejemplo en una campana de flujo laminar o en una incubadora. Para cada
microorganismo listado en la Tabla 2.6.12.-2, se usan al menos 2 cajas Petri. Dispersar un volumen
medido de no menos de 0.1 mL de la muestra preparada como se describi en 4-5-1 a 4-5-3 sobre la
superficie del medio. Incubar y contar como se indica en 4-5-4-2-1.
4-5-4-3. Mtodo del nmero ms probable (NMP). La precisin y exactitud del mtodo NMP es
menor que la del mtodo de filtracin por membrana o el mtodo de recuento en placa. Se obtienen
resultados no confiables particularmente para el recuento de hongos. Por estas razones, el mtodo
NMP se reserva para la numeracin de TAMC en situaciones donde no se tiene disponible otro
mtodo. Si se justifica el uso del mtodo, proceder como sigue:
12
Preparar una serie de por lo menos 3 diluciones decimales en serie del producto, como se describe
en 4-5-1 a 4-5-3. De cada nivel de dilucin se usan 3 alcuotas de 1 g o 1 mL para inocular 3 tubos
con 9 - 10 mL de caldo de digerido de casena de soya. Si es necesario, se puede agregar en el
medio un agente tensoactivo como polisorbato 80, o un inactivador de agentes antimicrobianos. De
esta manera, si se preparan 3 niveles de dilucin, se inoculan 9 tubos.
Incubar todos los tubos a 30 35C durante no ms de 3 das. Si la lectura de los resultados es
difcil o incierta debido a la naturaleza del producto que va a ser examinado, subcultivar en el
mismo caldo, o en agar de digerido de casena de soya, durante 1 - 2 das a la misma temperatura, y
usar estos resultados. Utilizando la Tabla 2.6.12:4, determinar el nmero ms probable de
microorganismos por gramo o mililitro del producto examinado.
4-6. RESULTADOS E INTERPRETACIN
Cuando se verifica la idoneidad del mtodo de filtracin por membrana o el mtodo de recuento en
placa, debe obtenerse un recuento promedio de los microorganismos de prueba que no difiera en un
factor mayor que 2 con respecto al valor del control definido en 4-5-2 en ausencia del producto.
Cuando se verifica la idoneidad del mtodo NMP el valor calculado a partir del inculo debe estar
dentro de los lmites al 95 por ciento de confianza de los resultados obtenidos con el control.
Si no pueden cumplirse los criterios indicados anteriormente para uno o ms de los

microorganismos probados con cualquiera de los mtodos descritos, para probar el producto se usa
el mtodo y las condiciones de prueba que ms se aproximen a los criterios.
5. PRUEBA DE LOS PRODUCTOS
5-1. CANTIDAD UTILIZADA PARA LA PRUEBA
A menos que se indique de otra manera, usar 10 g o 10 mL del producto que va a ser examinado,
tomados con las precauciones mencionadas anteriormente. Para los fluidos o slidos en aerosol,
muestrear 10 contenedores. Para los parches transdrmicos, muestrear 10 parches.
La cantidad que va a ser probada puede reducirse para sustancias activas que sern formuladas en
las siguientes condiciones: la cantidad por unidad de dosis (por ejemplo, tableta, cpsula, inyeccin)
es menor o igual a 1 mg, o la cantidad por gramo o mililitro (para preparaciones que no se presentan
en unidades de dosis) es menor que 1 mg. En estos casos, la cantidad que va ser probada es no
menor que la cantidad presente en 10 unidades de dosis o 10 g o 10 mL del producto.
Para los materiales usados como sustancias activas, donde la cantidad de muestra est limitada o el
tamao del lote es extremadamente pequeo (es decir, menos de 1000 mL o 1000 g), la cantidad
probada debe ser el 1 por ciento del lote, a menos que se prescriba o se justifique y se autorice una
cantidad menor.
Para los productos donde el nmero total de entidades en un lote es menor que 200 (por ejemplo,
muestras usadas en estudios clnicos), el tamao de la muestra puede reducirse a 2 unidades, o 1
unidad si el tamao es menor que 100.
Seleccionar la(s) muestra(s) al azar del material en granel o de los contenedores disponibles de la
preparacin. Para obtener la cantidad requerida, mezclar el contenido de un nmero suficiente de
contenedores para obtener la muestra.
13
Tabla 2.6.12.-4. Valores del nmero ms probable de microorganismos
Combinaciones observadas de nmeros de tubos que NMP por

Lmites de
muestran crecimiento en cada conjunto gramos o por
confianza al
Nmero de gramos o mililitros de producto pro tubo mililitro de
95%
0.1 0.01 0.001 producto
0 0 0 <3 0 9.4
0 0 1 3 0.1 9.5
0 1 0 3 0.1 10
0 1 1 6.1 1.2 17
0 2 0 6.2 1.2 17
0 3 0 9.4 3.5 3.5
1 0 0 3.6 0.2 17
1 0 1 7.2 1.2 17
1 0 2 11 4 35
1 1 0 7.4 1.3 20
1 1 1 11 4 35
1 2 0 11 4 35
1 2 1 15 5 38
1 3 0 16 5 38
2 0 0 9.2 1.5 35
2 0 1 14 4 35
2 0 2 20 5 38
2 1 0 15 4 38
2 1 1 20 5 38
2 1 2 27 9 94
2 2 0 21 5 40
2 2 1 28 9 94
2 2 2 35 9 94
2 3 0 29 9 94
2 3 1 36 9 94
3 0 0 23 5 94
3 0 1 38 9 104
3 0 2 64 16 181
3 1 0 43 9 181
3 1 1 75 17 199
3 1 2 120 30 360
3 1 3 160 30 380
3 2 0 93 18 360
3 2 1 150 30 380
3 2 2 210 30 400
3 2 3 290 90 990
3 3 0 240 40 990
3 3 1 460 90 1980
3 3 2 1100 200 4000
3 3 3 > 1100
14
5-2. EXAMEN DEL PRODUCTO
5-2-1. Filtracin por membrana
Usar un aparato de filtracin diseado para permitir la transferencia del filtro al medio. Preparar la
muestra usando un mtodo que ha demostrado ser adecuado como se describe en la seccin 4, y
transferir la cantidad apropiada a cada uno de 2 filtros de membrana, y filtrar inmediatamente.
Lavar cada filtro siguiendo el procedimiento que ha demostrado ser adecuado.
Para la determinacin de TAMC, transferir uno de los filtros de membrana a la superficie del agar
de digerido de casena de soya. Para la determinacin de TYMC, transferir la otra membrana a la
superficie de agar Sabouraud-dextrosa. Incubar la placa de agar de digerido de casena de soya a 30
35C durante 3 - 5 das, y la placa de agar Sabouraud-dextrosa a 20 25C durante 5 - 7 das.
Calcular el nmero de UFC por gramo o por mililitro de producto.
Cuando se examinan parches transdrmicos, filtrar el 10 por ciento del volumen de la preparacin
descrita en 4-5-1, separadamente a travs de cada uno de 2 filtros de membrana estriles. Transferir
una membrana al agar de digerido de casena de soya para TAMC, y la otra membrana al agar de
Sabouraud-dextrosa para TYMC.
5-2-2. Mtodos de recuento en placa
5-2-2-1. Mtodo de vertido en placa
Preparar la muestra usando el mtodo que ha demostrado ser adecuado, como se describe en la
seccin 4. Preparar apara cada medio al menos 2 cajas Petri para cada nivel de dilucin. Incubar las
placas de agar de digerido de casena de soya a 30-35C durante 3-5 das, y las placas de agar
Sabouraud-dextrosa a 20-25 C durante 5-7 das. Seleccionar las placas que correspondan a una
dilucin dada y que muestren el mayor nmero de colonias menor que 250 para TAMC y 50 para
TYMC. Obtener el promedio aritmtico de los recuentos por medio de cultivo, y calcular los
nmeros de UFC por gramo o por mililitro de producto.
5-2-2-2. Mtodo de dispersin en la superficie
Preparar la muestra usando un mtodo que ha demostrado ser adecuado, como se describe en la
seccin 4. Preparar al menos 2 cajas Petri para cada medio y cada nivel de dilucin. Para la
incubacin y clculo el nmero de UFC proceder como se describe para el mtodo de recuento en
placa.
5.2-3. Mtodo del nmero ms probable
Preparar y diluir la muestra usando un mtodo que ha demostrado ser adecuado, como se describe
en la seccin 4. Incubar todos los tubos a 30-35C durante 3-5 das. Si es necesario, realizar un
subcultivo usando el procedimiento que ha demostrado ser adecuado. Registrar para cada nivel de
dilucin el nmero de tubos que muestran crecimiento microbiano. Determinar el nmero ms
probable de microorganismos por gramo o mililitro de producto examinado, tomando como base la
Tabla 2.6.12.-4.
15
5-3. INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS
El recuento total de microbios aerobios (TAMC) se considera que es igual al nmero de UFC
encontradas usando agar de digerido de casena de soya; si se detectan colonias de hongos en este
medio, estas colonias son contadas como parte de la TAMC. El recuento total combinado de
levaduras/hongos (TYMC) se considera que es igual al nmero de UFC encontrado usando agar
Sabouraud-dextrosa; si se detectan colonias de bacterias en este medio, stas son contadas como
parte de la TYMC. Cuando se espera que la TYMC exceda el criterio de aceptacin debido al
crecimiento bacteriano, puede usarse agar Sabouraud-dextrosa que contenga antibiticos. Si el
recuento se realiza por el mtodo NMP, el valor calculado es la TAMC.
Cuando se prescribe un criterio de aceptacin para la calidad microbiana, ste se interpreta como
sigue:
- 101 UFC: recuento mximo aceptable = 20;
- 102 UFC: recuento mximo aceptable = 200;
- 103 UFC: recuento mximo aceptable = 2000, y as sucesivamente.
Las soluciones y medios recomendados estn descritos en el captulo general 2.6.13 (en la seccin
B, mtodo armonizado).
16
01/2008:20613
corregido 6.0
2.6.13. EXAMEN MICROBIOLGICO DE PRODUCTOS NO ESTRILES (PRUEBAS

PARA MICROORGANISMOS ESPECFICOS)
En este captulo general se presentan dos conjuntos de pruebas. El primer conjunto presenta los
mtodos de referencia para determinar el cumplimiento con las monografas. Por tanto, la
referencia a este captulo en una monografa implica el cumplimiento con el primer conjunto de
pruebas, a menos que se haya autorizado el uso del segundo conjunto de pruebas. Las pruebas en
el segundo conjunto tambin constituyen mtodos oficiales de la Farmacopea Europea, y pueden
ser referidas como tales, especialmente en las solicitudes de autorizacin para venta. Se pretende
reemplazar el primer conjunto por el segundo conjunto una vez que las monografas concernientes
hayan sido revisadas. El segundo conjunto presenta las pruebas desarrolladas en cooperacin con
la Farmacopea Japonesa y con la Farmacopea de los Estados Unidos para lograr los requisitos
armonizados.
A. MTODO DE LA FARMACOPEA EUROPEA
En este mtodo general se propone la utilizacin de determinados medios selectivos. Una

caracterstica comn a todos los medios selectivos es que no se detectan microorganismos daados
subletalmente. Como estos microorganismos daados subletalmente son importantes para la calidad
del producto, se debe incluir una revivificacin en los procedimientos de examen que se basan en
medios selectivos.
Si el producto a examinar tiene actividad antimicrobiana, debe ser neutralizado adecuadamente.
Enterobacterias y otras bacterias Gram negativas

Aunque la prueba ha sido diseada para detectar bacterias que pertenezcan a la familia
Enterobateriaceae, se reconoce que se pueden recuperar otros tipos de organismos (por ejemplo
Aeromonas y Pseudomonas).
Deteccin de bacterias. Preparar el producto a examinar de la forma descrita en el mtodo general
2.6.12, pero utilizando el medio lquido D en lugar de la solucin de peptona-cloruro de sodio
amortiguada a pH 7.0, homogeneizar e incubar a 35-37 C durante un tiempo suficiente para
revivificar las bacterias pero insuficiente para favorecer su multiplicacin (normalmente 2 h pero no
ms de 5 h). Agitar el envase, transferir un volumen del lquido (homogeneizado A),
correspondiente a 1 g o 1 mL del producto a examinar, a 100 mL del medio de enriquecimiento E, e
incubar a 35-37 C durante 1848 h. Realizar subcultivos en placas del medio de agar F. Incubar a
35-37 C durante 18-24 h. El producto a examinar pasa la prueba si no se desarrolla ninguna colonia
de bacterias Gram negativas en ninguna de las placas.
Evaluacin cuantitativa. Inocular cantidades apropiadas del medio lquido de enriquecimiento E

con el homogeneizado A y/o con diluciones del mismo que contengan respectivamente 0.1 g,
0.01 g y 0.001 g (o bien 0.1 mL, 0.01 mL y 0.001 mL) del producto a examinar. Incubar a 35-37 C
durante 24-48 h. A partir de cada cultivo, realizar subcultivos en un medio de agar F con el fin de
aislar selectivamente las colonias que se desarrollen. Incubar a 35-37 C durante 18-24 h. Un
crecimiento de colonias bien desarrolladas de bacterias Gram negativas, generalmente rojas o
rojizas, constituye un resultado positivo. Anotar la cantidad mnima del producto a examinar que d
resultado positivo y la cantidad mxima que d resultado negativo. A partir de la Tabla 2.6.13.-1,
determinar el nmero probable de bacterias.
1
Tabla 2.6.13.-1
Resultados para cada cantidad de producto
Nmero probable de bacterias
0.1 g o 0.01 g o 0.001 g o
por gramo de producto
0.1 mL 0.01 mL 0.001 mL
+ + + Ms de 103
+ + Menos de 103 y ms de 102
+ Menos de 102 y ms de 10
Menos de 10
Para la prueba de parches transdrmicos, filtrar 50 mL de la preparacin B como se describe en el

mtodo general 2.6.12 a travs de un filtro de membrana estril, colocar la membrana en 100 mL
del medio lquido de enriquecimiento E, e incubar a 35-37 C durante 18-24 h. Despus de la
incubacin, extender sobre el medio de agar F para la deteccin de enterobacterias y otros
microorganismos Gram negativos.
Escherichia coli
Preparar el producto a examinar de la forma descrita en el mtodo general 2.6.12 y utilizar 10 mL o
la cantidad correspondiente a 1 g o 1 mL para inocular 100 mL del medio lquido A, homogeneizar
e incubar a 35-37 C durante 18-48 h. Agitar el envase, transferir 1 mL a 100 mL del medio lquido
G e incubar a 43-45 C durante 18-24 h. Realizar subcultivos en placas de medio de agar H a 35-
37 C durante 18-72 h. El crecimiento de colonias rojas, no mucoides, de bacilos Gram negativos,
indica la posible presencia de E. coli. Esto puede confirmarse por reacciones bioqumicas adecuadas
como la produccin de indol. El producto pasa la prueba si no se observan dichas colonias o si las
reacciones bioqumicas de confirmacin resultan negativas.
Salmonella
Preparar el producto a examinar de la forma descrita en el mtodo general 2.6.12, pero utilizando
medio lquido A en lugar de la solucin de peptona-cloruro de sodio amortiguada a pH 7.0,
homogeneizar e incubar a 35-37 C durante 18-24 h. Transferir 1 mL del medio de enriquecimiento
a 10 mL del medio lquido I e incubar a 41-43 C durante 18-24 h. Realizar subcultivos en al menos
2 medios slidos diferentes, elegidos entre los siguientes: medio de agar J, medio de agar K y medio
de agar L. Incubar a 35-37 C durante 18-72 h. La aparicin de cultivos con las siguientes
caractersticas indica la posible presencia de bacterias del gnero Salmonella:
en medio de agar J: colonias bien desarrolladas, incoloras,
en medio de agar K: colonias bien desarrolladas, rojas, que pueden presentar o no centros
negros,
en medio de agar L: colonias pequeas, transparentes, incoloras o de una coloracin que puede
variar desde rosa hasta blanca opaca, a menudo rodeadas de una zona rosa
o roja.
Transferir por separado unas cuantas colonias sospechosas al medio de agar M en tubos, mediante
inoculacin en la superficie y en la profundidad. La presencia de salmonellas queda confirmada
provisionalmente si en la inoculacin en la profundidad, pero no en la realizada en superficie, se
produce un cambio de color del rojo al amarillo, acompaado generalmente de formacin de gas,
con o sin produccin de sulfuro de hidrgeno en el agar. Puede efectuarse una confirmacin
definitiva mediante reacciones bioqumicas y serolgicas apropiadas. El producto a examinar pasa
la prueba si no se observan colonias del tipo descrito o si las reacciones bioqumicas y serolgicas
de confirmacin son negativas.
2
Pseudomonas aeruginosa
e incubar a 35-37 C durante 18-48 h. Realizar subcultivos en una placa del medio de agar N e
incubarlos a 35-37 C durante 18-72 h. La sustancia a examinar pasa la prueba si no se detecta
crecimiento de microorganismos. Si aparecen colonias formadas por bacilos Gram negativos,
transferir parte de las colonias aisladas morfolgicamente diferentes al medio lquido A e incubar a
41-43 C durante 18-24 h. La muestra pasa la prueba si no se produce crecimiento a 41-43 C.
Para la prueba de parches transdrmicos, filtrar 50 mL de la preparacin A como se describe en el
del medio lquido A e incubar a 35-37 C durante 18-48 h. Despus de la incubacin, extender sobre
el medio de agar N.
Staphylococcus aureus
e incubar a 35-37 C durante 18-48 h. Realizar subcultivos en una placa de medio de agar O e
incubarlos a 35-37 C durante 18-72 h. La aparicin de colonias negras de cocos Gram positivos, a
menudo rodeadas de una zona transparente, constituye un indicio de la presencia de S. aureus. La
confirmacin puede efectuarse mediante reacciones bioqumicas adecuadas como las pruebas de la
coagulasa y de la desoxirribonucleasa. El producto a examinar pasa la prueba si no se observan
colonias del tipo descrito en el medio de agar O, o si las reacciones bioqumicas de confirmacin
son negativas.
Para la prueba de parches transdrmicos, filtrar 50 mL de la preparacin A como se describe en el
del medio lquido A e incubar a 35-37 C durante 18-48 h. Despus de la incubacin, extender sobre
el medio de agar O.
Propiedades nutritivas y selectivas de los medios y validez de la prueba
Las pruebas descritos a continuacin deben realizarse al menos en cada lote de medio deshidratado.
Proceder como sigue: Cultivar por separado cada una de las siguientes cepas de referencia, en tubos
que contengan medios adecuados como los indicados, a 30-35 C durante 18-24 h:
Staphylococcus aureus por ejemplo ATCC 6538 (NCIMB 9518, CIP 4.83):
medio lquido A,
Pseudomonas aeruginosa por ejemplo ATCC 9027 (NCIMB 8626, CIP 82.118):
medio lquido A,
Escherichia coli por ejemplo ATCC 8739 (NCIMB 8545, CIP 53.126):
medio lquido A,
Salmonella typhimurium no se recomienda ninguna cepa de referencia (se puede emplear
tambin una salmonella no patgena para el hombre, como
Salmonella abony (NCTC 6017, CIP 80.39)): medio lquido A.
Realizar diluciones de cada cultivo utilizando solucin de peptona-cloruro de sodio amortiguada a

pH 7.0, con el fin de obtener suspensiones que contengan unos 1000 microorganismos viables por
mililitro. Mezclar volmenes iguales de cada suspensin y utilizar 0.4 mL (que corresponden
aproximadamente a 100 microorganismos de cada cepa) como inculo en las pruebas para la
3
deteccin de S. aureus, P. aeruginosa, E. coli y Salmonella, en presencia y en ausencia del producto

a examinar. Debe obtenerse un resultado positivo para los respectivos microorganismos.
Clostridios
Las pruebas que se describen a continuacin tienen diversas finalidades. El primer mtodo se utiliza
para productos de los que resulta esencial excluir la contaminacin por clostridios, lo que hace
necesario demostrar su ausencia. Generalmente en dichos productos el recuento total de
microorganismos es bajo. El segundo mtodo es una prueba semicuantitativa para Clostridium
perfringens y se destina a productos en los que el nivel de contaminacin con esta especie
constituye un criterios de calidad.
1. Prueba para de Clostridios
Preparar el producto a examinar de la forma descrita en el mtodo general 2.6.12. Tomar 2
porciones iguales de la preparacin, correspondientes a 1 g o 1 mL del producto a examinar.
Calentar 1 porcin a 80 C durante 10 min y enfriarla rpidamente. No calentar la otra porcin.
Transferir 10 mL de cada una de las porciones homogeneizadas a 2 envases (38 mm 200 mm) o a
otros envases adecuados, que contengan 100 mL del medio P. Incubar en condiciones anaerobias a
35-37 C durante 48 h. Despus de esta incubacin, realizar subcultivos de cada tubo en medio Q
con gentamicina, incubando en condiciones anaerobias a 35-37 C durante 48 h. Si no se detecta
crecimiento de microorganismos, el producto pasa la prueba.
Si hubiera crecimiento, volver a realizar subcultivos de cada uno de los tipos de colonias formadas
en el medio Q, sin gentamicina, e incubar tanto en condiciones aerobias como anaerobias. La
observacin de crecimiento solamente anaerobio de bacilos Gram positivos (con formacin o no de
endosporas), que dan negativa la reaccin de la catalasa, indica que se trata de Clostridium spp. Si
fuera necesario, comparar el aspecto de las colonias que crecen en ambas placas, empleando la
prueba de la catalasa para eliminar Bacillus spp, aerobios o facultativamente anaerobios, que dan
positiva dicha reaccin. Esta prueba se puede aplicar a colonias aisladas en agar, o bien
indirectamente previa transferencia de las bacterias a portaobjetos de vidrio, depositando sobre las
clulas una gota de solucin diluida de perxido de hidrgeno R. La formacin de burbujas de gas
indica que la reaccin de la catalasa es positiva.
2. Recuento de Clostridium perfringens
Preparar el producto a examinar como se describe en el mtodo general 2.6.12 y preparar diluciones
1:100 y 1:1000 en solucin de peptona-cloruro de sodio amortiguada a pH 7.0. Determinar el
nmero ms probable de bacterias como se describe para el recuento de microorganismos aerobios
viables totales en 2.6.12, utilizando medio de cultivo R en tubos o en otros envases adecuados que
tengan una pequea campana Durham. Mezclar con la mnima agitacin posible e incubar a
45.5-46.5 C durante 24-48 h. Los envases que presenten ennegrecimiento, debido a la formacin
de sulfuro de hierro(II), as como abundante gas en la campana de Durham (al menos 1/10 del
volumen) indican la presencia de Cl. perfringens. Estimar el nmero ms probable de Cl.
perfringens utilizando la Tabla 2.6.13.-2.
Controles
Utilizar las cepas siguientes:
Para el mtodo 1: Clostridium sporogenes, por ejemplo ATCC 19404 (NCTC 532) o CIP 79.3,
Para el mtodo 2: Clostridium perfringens, por ejemplo ATCC 13124 (NCIMB 6125,
NCTC 8237, CIP 103 409).
Si fuera necesario, combinar con Cl. sporogenes para verificar la selectividad y las condiciones
anaerobias.
4
Tabla 2.6.13.-2. Valores del nmero ms probable (NMP) de bacterias
Tres tubos en cada nivel de dilucin

Nmero de tubos positivos NMP por Categora* Lmites de confianza
0.1 g 0.01 g 0.001 g gramo 1 2 al 95 por ciento
0 0 0 <3 - -
0 1 0 3 x <1 17
1 0 0 3 x 1 21
1 0 1 7 x 2 27
1 1 0 7 x 2 28
1 2 0 11 x 4 35
2 0 0 9 x 2 38
2 0 1 14 x 5 48
2 1 0 15 x 5 50
2 1 1 20 x 8 61
2 2 0 21 x 8 63
3 0 0 23 x 7 129
3 0 1 38 x 10 180
3 1 0 43 x 20 210
3 1 1 75 x 20 280
3 2 0 93 x 30 390
3 2 1 150 x 50 510
3 2 2 210 x 80 640
3 3 0 240 x 100 1400
3 3 1 460 x 200 2400
3 3 2 1100 x 300 4800
3 3 3 > 1100 - -
* Categora 1: Resultados normales obtenidos en 95 por ciento de los casos.
* Categora 2: Resultados menos probables obtenidos en slo 4 por ciento de los casos. Estos no se
usan para decisiones importantes. Los resultados que son an menos probables que
los de la categora 2 no se mencionan y siempre son inaceptables.
La seccin siguiente se incluye para informacin.
SOLUCIONES Y MEDIOS DE CULTIVO RECOMENDADOS

Las soluciones y medios de cultivo siguientes han resultado satisfactorios para aplicarlos en las
pruebas de contaminacin microbiana indicados en la Farmacopea. Es posible utilizar otros medios,
siempre que tengan propiedades nutritivas y selectivas semejantes para los microorganismos para
los que se realiza la prueba.
5
Solucin de peptona-cloruro de sodio amortiguada a pH 7.0

Fostato dihidrogenado de potasio 3.6 g
Fosfato hidrogenado disdico dihidrato 7.2 g, equivalente a fosfato 0.067 M
Cloruro de sodio 4,3 g
Peptona (de carne o de casena) 1,0 g
Agua purificada 1000 mL
A esta solucin pueden aadirse agentes tensioactivos o inactivadores de
agentes antimicrobianos como:
Polisorbato 80 1 a 10 g/L.
Esterilizar mediante calentamiento en autoclave a 121 C durante 15 min.
Medio lquido A (caldo con hidrolizado de casena y soya)

Hidrolizado pancretico de casena 17.0 g
Hidrolizado papanico de soya 3.0 g
Cloruro de sodio 5.0 g
Fosfato hidrogenado dipotsico 2.5 g
Glucosa monohidrato 2.5 g
Ajustar el pH de forma que despus de la esterilizacin sea 7.3 0.2.
Esterilizar por calentamiento en autoclave a 121 C durante 15 min.
Medio de agar B (agar con hidrolizado de casena y soya)

Hidrolizado papanico de soya 5.0 g
Agar 15.0 g
Medio de agar C (agar Sabouraud-glucosa con antibiticos)
Peptonas (de carne y de casena) 10.0 g

Agar 15.0 g
Esterilizar por calentamiento en autoclave a 121 C durante 15 min. Inmediatamente antes de su
uso, aadir 0.10 g de bencilpenicilina sdica y 0.10 g de tetraciclina por litro de medio, en forma de
soluciones estriles. Alternativamente, es posible aadir 50 mg de cloranfenicol por litro de medio,
antes de la esterilizacin.
Medio lquido D (caldo de lactosa monohidrato)

Extracto de carne de vaca 3.0 g
Hidrolizado pancretico de gelatina 5.0 g
Lactosa monohidrato 5.0 g
Esterilizar por calentamiento en autoclave a 121 C durante 15 min
y enfriar inmediatamente.
6
Medio lquido enriquecido E (caldo Mossel para enriquecimiento de Enterobacterias)

Bilis de buey deshidratada 20.0 g
Fosfato hidrogenado de sodio dihidrato 8.0 g
Verde brillante 15 mg
Ajustar el pH de forma que despus del calentamiento sea 7.2 0.2.
Calentar a 100 C durante 30 min y enfriar inmediatamente.
Medio de agar F (agar con violeta cristal, rojo neutro y bilis, con glucosa)
Extracto de levadura 3.0 g
Sales biliares 1.5 g
Agar 15.0 g
Rojo neutro 30 mg
Violeta cristal 2 mg
Calentar a ebullicin; no debe emplearse un autoclave.
Medio lquido G (caldo MacConkey)

Prpura de bromocresol 10 mg
Medio de agar H (agar MacConkey)

Agar 13.5 g
Rojo neutro 30.0 mg
Violeta cristal 1 mg
Calentar a ebullicin durante 1 min con agitacin constante;
luego esterilizar por calentamiento en autoclave a 121 C durante 15 min.
7
Medio lquido I (caldo con tetrationato, bilis y verde brillante)

Peptona 8.6 g
Bilis de buey desecada 8.0 g
Carbonato de calcio 20.0 g
Tetrationato de potasio 20.0 g
Calentar hasta inicio de la ebullicin. No repetir el calentamiento.
Medio de agar J (agar con desoxicolato y citrato)

Peptona de carne 10.0 g
Citrato de sodio 20.0 g
Citrato de hierro(III) 1.0 g
Desoxicolato de sodio 5.0 g
Agar 13.5 g
Rojo neutro 20 mg
Calentar suavemente hasta ebullicin, hervir durante 1 min,
enfriar hasta 50 C y transferir a placas de Petri. No calentar en autoclave.
Medio de agar K (agar con desoxicolato, lisina y xilosa)

Xilosa 3.5 g
L-Lisina 5.0 g
Sacarosa 7.5 g
Rojo de fenol 80 mg
Agar 13.5 g
Tiosulfato de sodio 6.8 g
Citrato de amonio y hierro(III) 0.8 g
Calentar hasta el inicio de la ebullicin, enfriar hasta 50 C
y transferir a placas de Petri. No calentar en autoclave.
8
Medio de agar L (agar con sacarosa, lactosa monohidrato, rojo de fenol y verde brillante)
Sacarosa 10.0 g
Agar 20.0 g
Rojo de fenol 80 mg
Verde brillante 12.5 mg
Calentar a ebullicin durante 1 min.
Inmediatamente antes de su uso, esterilizar por calentamiento
en autoclave a 121 C durante 15 min, enfriar hasta 50 C
y transferir a placas de Petri.
Medio de agar M (agar con triple azcar y hierro)

Peptonas (de casena y de carne) 20.0 g
Sacarosa 10.0 g
Citrato de amonio y hierro(III) 0.3 g
Rojo de fenol 25 mg
Agar 12.0 g
Calentar a ebullicin durante 1 min, con agitacin.
Llenar tubos hasta una tercera parte de su altura, esterilizar por calentamiento
en autoclave a 121 C durante 15 min y dejar que se enfre en
posicin inclinada, de modo que se obtenga una parte profunda
y una superficie en pendiente.
Medio de agar N (agar con cetrimida)

Cloruro de magnesio 1.4 g
Sulfato de potasio 10.0 g
Cetrimida 0.3 g
Agar 13.6 g
Glicerol 10.0 mL
Calentar a ebullicin durante 1 min con agitacin.
9
Medio de agar O (agar Baird-Parker)

Cloruro de litio 5.0 g
Agar 20.0 g
Glicina 12.0 g
Piruvato de sodio 10.0 g
Calentar a ebullicin durante 1 min con agitacin. Ajustar el pH de forma que despus de la
esterilizacin sea 6,8 0,2. Esterilizar por calentamiento en autoclave a 121 C durante 15 min,
enfriar a 45-50 C y aadir 10 mL de una solucin estril de 10 g/L de telurito de potasio y 50 mL
de emulsin de yema de huevo.
Medio P (medio reforzado para clostridios)

Peptona 10.0 g
Almidn soluble 1.0 g
Hidrocloruro de cistena 0.5 g
Acetato de sodio 3.0 g
Agar 0.5 g
Hidratar el agar y disolver por calentamiento hasta ebullicin bajo
agitacin continua. Si es preciso, ajustar el pH de forma que
despus de la esterilizacin sea aproximadamente 6.8.
Medio Q (agar Columbia)

Hidrolizado pptico de carne 5.0 g
Hidrolizado pancretico de corazn 3.0 g
Almidn de maz 1.0 g
Agar. segn su capacidad de 10.0 g a 15.0 g
gelificante
Hidratar el agar y disolver por calentamiento a ebullicin bajo
agitacin continua. Si es preciso, ajustar el pH de forma que
despus de la esterilizacin sea 7.3 0.2.
Dejar que se enfre hasta 45-50 C; aadir, cuando proceda,
sulfato de gentamicina hasta una concentracin de 20 mg de
gentamicina base y verter en placas de Petri.
10
Medio R (medio con lactosa monohidrato y sulfito)

Hidrocloruro de cistena 0.3 g
Disolver, ajustar a pH 7.1 0.1 y envasar en cantidades de hasta
8 mL, en tubos de 16 mm 160 mm que contengan una pequea
campana de Durham. Esterilizar por calentamiento en autoclave
a 121 C durante 15 min y conservar a 4 C.
Antes de su uso, calentar el medio en un bao de agua durante 5 min y enfriar. Aadir a cada tubo
0.5 mL de una solucin de 12 g/L de metabisulfito de sodio R y 0.5 mL de una solucin de 10 g/L
de citrato de amonio y hierro(III), ambas recin preparadas y filtradas a travs de membranas
(tamao de poro: 0.45 m).
Medio de agar S (R2A)

Peptona de proteosa 0.5 g
Hidrolizado de casena 0.5 g
Glucosa 0.5 g
Almidn 0.5 g
Fosfato hidrogenado de potasio 0.3 g
Sulfato de magnesio. anhidro 0.024 g
Piruvato de sodio 0.3 g
Agar 15.0 g
AGENTES NEUTRALIZANTES
Se pueden utilizar agentes neutralizantes para neutralizar la actividad de los agentes
antimicrobianos. Se pueden aadir a la solucin de peptona-cloruro de sodio amortiguada a pH 7.0,
preferentemente antes de la esterilizacin. Si se utilizan, se debe demostrar su eficacia y su ausencia
de toxicidad frente a los microorganismos.
Un lquido neutralizante tpico tiene la siguiente composicin:
Polisorbato 80 30 g
Lecitina (huevo) 3g
Hidrocloruro de histidina 1g
Peptona (de carne o de casena) 1g
Fosfato hidrogenado de sodio dihidrato 7.2 g
Esterilizar mediante calentamiento en autoclave a 121 C durante 15 min.
Si la solucin no tiene suficiente capacidad de neutralizacin,
puede incrementarse la concentracin de polisorbato 80 o de lecitina.
Alternativamente, se pueden aadir los agentes neutralizantes mencionados en la Tabla 2.6.13.-3.
11
Tabla 2.6.13.-3. Inactivadores de agentes antimicrobianos para aadir a la solucin de peptona

cloruro de sodio amortiguada a pH 7.0
Tipo de agente
Inactivador Concentracin Comentario
antimicrobiano
Fenlicos Laurilsulfato de 4 g/L Aadir despus de la
sodio esterilizacin de la
30 g/L y 3 g/L
solucin de
Polisorbato 80 y
5 mL/l-50 mL/L peptona-cloruro
lecitina
de sodio amortiguada
Yema de huevo a pH 7.0
Organo-mercuriales Tioglicolato de sodio 0.5 g/L-5 g/L
Tiosulfato
Halgenos 5 g/L
de sodio
Compuestos de Yema de huevo 5 mL/L - 50 mL/L Aadir despus de la
amonio cuaternario esterilizacin de la
solucin de peptona-
cloruro de sodio
amortiguada a pH 7.0
B. MTODO ARMONIZADO
1. INTRODUCCIN
Las pruebas que aqu se describen permitirn determinar la ausencia, o la presencia limitada, de
microorganismos especficos que puedan ser detectados en las condiciones descritas.
Las pruebas han sido diseadas principalmente para determinar si una sustancia o preparacin
cumple con una especificacin establecida para la calidad microbiolgica. Si se emplean para tales
propsitos, seguir las instrucciones que se indican a continuacin, incluyendo el nmero de
muestras a tomar, e interpretar los resultados como se indica ms adelante.
Pueden utilizarse procedimientos microbiolgicos alternativos, incluyendo mtodos automatizados,

siempre que se haya demostrado su equivalencia con el mtodo farmacopeico.
2. PROCEDIMIENTOS GENERALES
La preparacin de las muestras se realiza como se describe en el captulo general 2.6.12 (en la
seccin B, Mtodo armonizado).
Si el producto por examinar posee actividad antimicrobiana, sta debe removerse o neutralizarse en
la medida de lo posible como se describe en el captulo general 2.6.12 (en la seccin B, Mtodo
armonizado).
Si en la preparacin de la muestra se emplean sustancias tensoactivas, se debe demostrar su

ausencia de toxicidad para los microorganismos y compatibilidad con los inactivadores usados,
como se describe en el captulo general 2.6.12 (en la seccin B, Mtodo armonizado).
12
3. PROPIEDADES DE PROMOCIN DEL CRECIMIENTO E INHIBITORIAS DE LOS

MEDIOS, IDONEIDAD DE LA PRUEBA Y CONTROLES NEGATIVOS
Se debe establecer la capacidad de la prueba para detectar microorganismos en presencia del

producto por examinar. Se debe confirmar la idoneidad de la prueba si se introdujera un cambio en
la ejecucin de la prueba o en el producto, el cual pudiera afectar los resultados.
3-1. PREPARACIN DE LAS CEPAS DE PRUEBA
Usar suspensiones estables estandarizadas de cepas de prueba, o prepararlas como se indica ms

adelante. Se usan tcnicas de mantenimiento de cultivos del lote de siembra (sistemas de lote de
siembra), de forma tal que los microorganismos viables empleados para inoculacin correspondan
a no ms de cinco pases a partir del lote de siembra maestro original.
3-1-1. Microorganismos aerobios. Cultivar por separado cada cepa bacteriana de prueba en caldo
digerido de casena y soya o en agar digerido de casena y soya a una temperatura de 30-35C
durante un perodo de 18 a 24 horas. Cultivar por separado la cepa de prueba de Candida albicans
en agar Sabouraud dextrosa o en Caldo Sabouraud Dextrosa a una temperatura de 20-25C durante
un perodo de 2 a 3 das.
- Staphylococcus aureus, por ejemplo ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83 o NBRC 13276;
- Pseudomonas aeruginosa, por ejemplo ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118 o NBRC
13275;
- Escherichia coli, por ejemplo ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126 o NBRC 3972;
- Salmonella enterica subsp. enterica serotipo typhimurium, por ejemplo ATCC 14028 o, como
una alternativa, Salmonella enterica subsp. enterica serotipo abony, por ejemplo NBRC
100797, NCTC 6017 o CIP 80.39;
- Candida albicans, por ejemplo ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72 o NBRC 1594.
Para preparar las suspensiones de prueba, usar solucin amortiguada de cloruro de sodio-peptona de
pH 7.0 o solucin amortiguadora de fosfato de pH 7.2. Utilizar las suspensiones dentro de 2 horas o
dentro de 24 horas si se almacenan a una temperatura de 2-8C.
3-1-2. Clostridios. Emplear Clostridium sporogenes, como por ejemplo ATCC 11437 (NBRC
14293, NCIMB 12343, CIP 100651) o ATCC 19404 (NCTC 532 o CIP 79.3) o NBRC 14293.
Cultivar la cepa clostridios de prueba en condiciones anaerbicas en medio reforzado para
clostridios a una temperatura de 30-35C durante un perodo de 24 a 48 horas. Como alternativa
para la preparacin y posterior dilucin de una suspensin fresca de las clulas vegetativas de Cl.
sporogenes, se emplea una suspensin estable de esporas para la inoculacin de prueba. La
suspensin estable de esporas puede mantenerse a una temperatura de 2-8C durante un perodo
validado.
3-2. CONTROL NEGATIVO
Para verificar las condiciones de prueba, realizar un control negativo utilizando el diluyente
seleccionado en lugar de la preparacin de prueba. No debe haber crecimiento de microorganismos.
13
3-3. PROPIEDADES DE PROMOCIN DEL CRECIMIENTO E INHIBITORIAS DE LOS MEDIOS
Probar cada lote de medio listo para usar y cada lote de medio preparado a partir de medio
deshidratado o de los ingredientes.
Verificar las propiedades adecuadas de los medios pertinentes como se indica en la Tabla 2.6.13.-1.
Prueba de las propiedades de promocin del crecimiento, medios lquidos: Inocular una porcin del
medio apropiado con un nmero pequeo (no ms de 100 UFC) del microorganismo adecuado.
Incubar a la temperatura especificada durante un tiempo no mayor que el perodo menor indicado
en la prueba. Se produce un crecimiento claramente visible de microorganismos comparable al
obtenido anteriormente con un lote de medio analizado y aprobado previamente.
Prueba de las propiedades de promocin del crecimiento, medios slidos: realizar el mtodo de
extensin en superficie, inoculando cada una de las placas con un nmero pequeo (no ms de 100
UFC) del microorganismo adecuado. Incubar a la temperatura especificada durante un tiempo no
mayor que el perodo menor indicado en la prueba. Se produce un crecimiento de microorganismos
comparable al obtenido anteriormente con un lote de medio analizado y aprobado previamente.
Prueba de las propiedades inhibitorias, medios lquidos o slidos: Inocular el medio apropiado con
al menos 100 UFC del microorganismo adecuado. Incubar a la temperatura especificada durante un
tiempo no menor del perodo mayor indicado en la prueba. No se produce crecimiento del
microorganismo de prueba.
Prueba de las propiedades indicadoras: emplear el mtodo de extensin en superficie, inoculando

cada una de las placas con un nmero pequeo (no ms de 100 UFC) del microorganismo adecuado.
Incubar a la temperatura especificada durante un perodo que se encuentre en el intervalo indicado
en la prueba. Las colonias son comparables, en apariencia y reacciones indicadoras, a las
anteriormente obtenidas con un lote de medio analizado y aprobado previamente.
3-4. IDONEIDAD DEL MTODO DE PRUEBA
Para cada producto que va a ser analizado, realizar la preparacin de la muestra como se describe en
el prrafo pertinente en la seccin 4. Al momento de la mezcla, agregar cada cepa de prueba en el
medio de crecimiento indicado. Inocular individualmente las cepas de prueba. Usar un nmero de
microorganismos equivalente a no ms de 100 UFC en la preparacin de prueba inoculada.
Realizar la prueba como se indica en el prrafo pertinente en la seccin 4, empleando el perodo de
incubacin ms corto indicado.
Se deben detectar los microorganismos especficos con las reacciones indicadoras como se describe
en la seccin 4.
Cualquier actividad antimicrobiana del producto requiere de una modificacin del procedimiento de
la prueba (ver 4-5-3 del captulo general 2.6.12) (en la seccin B, Mtodo armonizado)).
Para un producto determinado, si la actividad antimicrobiana con respecto al microorganismo para

el cual se indica la prueba no puede neutralizarse, se asume que el microorganismo inhibido no
estar presente en el producto.
14
Tabla 2.6.13.-1 Propiedades indicadoras de promocin del crecimiento e inhibitorias de los medios
Medio Propiedad Cepas de prueba
Prueba para bacterias Gram Caldo Mossel para Promocin del crecimiento E. coli
negativas tolerantes a la bilis enriquecimiento de P. aeruginosa
enterobacterias Inhibitoria S. aureus
Agar violeta rojo bilis glucosa Promocin del crecimiento + E. coli
indicadora P. aeruginosa
Prueba para Escherichia coli Caldo MacConkey Promocin del crecimiento E. coli
Inhibitoria S. aureus
Agar MacConkey Promocin del crecimiento + E. coli
indicadora
Prueba para Salmonella Caldo Rappaport Vassiliadis Promocin del crecimiento Salmonella enterica subsp.
para enriquecimiento de enterica serotipo Typhimurium o
Salmonella Salmonella enterica subsp.
enterica serotipo Abony
Inhibitoria S. aureus
Agar xilosa, lisina, desoxicolato Promocin del crecimiento + Salmonella enterica subsp.
indicadora enterica serotipo typhimurium o
Salmonella enterica subsp.
enterica serotipo abony
Indicadora E.coli
Prueba para Agar cetrimida Promocin del crecimiento P. aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa Inhibitoria E. coli
Prueba para Agar manitol sal Promocin del crecimiento + S. aureus
Staphylococcus aureus indicadora
Inhibitoria E. coli
Prueba para clostridios Medio reforzado Promocin del crecimiento Cl. sporogenes
para clostridios
Agar Columbia Promocin del crecimiento Cl. sporogenes
Prueba para Caldo Sabouraud dextrosa Promocin del crecimiento C. albicans
Candida albicans Agar Sabouraud dextrosa Promocin del crecimiento + C. albicans
indicadora
4. PRUEBAS DE PRODUCTOS
4-1. BACTERIAS GRAM NEGATIVAS TOLERANTES A LA BILIS
4-1-1. Preparacin de la muestra e incubacin previa. Preparar una muestra empleando una
dilucin 1 en 10 de no menos de 1 g del producto por analizar, como se describe en el captulo
general 2.6.12 (en la seccin B, Mtodo armonizado), excepto que se debe usar caldo digerido de
casena y soya como diluyente de eleccin, mezclar e incubar a una temperatura de 20-25C durante
un perodo suficiente para resucitar las bacterias pero que no estimule la multiplicacin de los
organismos (usualmente 2 horas pero no ms de 5 horas).
15
4-1-2. Prueba de la ausencia. A menos que se indique de otra manera, usar el volumen
correspondiente a 1 g del producto, preparado como se indica en 4-1-1, para inocular Caldo Mossel
para enriquecimiento de enterobacterias. Incubar a una temperatura de 30-35C durante un perodo
de 24 a 48 horas. Subcultivar en placas de Agar violeta rojo bilis glucosa. Incubar a una temperatura
de 30-35C durante un perodo de 18 a 24 horas.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias.
4-1-3. Prueba cuantitativa

4-1-3-1. Seleccin y subcultivo. Inocular cantidades adecuadas de caldo Mossel para
enriquecimiento de enterobacterias con la preparacin como se indica en 4-1-1 y/o diluciones de la
misma que contengan respectivamente 0.1 g; 0.01 g y 0.001 g ( 0.1 mL; 0.01 mL y 0.001 mL) del
producto por examinar. Incubar a una temperatura de 30-35C durante un perodo de 24 a 48 horas.
Subcultivar cada uno de los cultivos en una placa de agar violeta rojo bilis glucosa. Incubar a una
temperatura de 30-35C durante un perodo de 18 a 24 horas.
4-1-3-2. Interpretacin. El crecimiento de colonias constituye un resultado positivo. Indicar la

menor cantidad del producto que produce un resultado positivo y la mayor cantidad que produce un
resultado negativo. A partir de la Tabla 2.6.13.-2, determinar el nmero probable de bacterias.
Tabla 2.6.13.-2 Interpretacin de los resultados
Resultados para cada cantidad de producto Nmero probable de

0.1 g o 0.01 g o 0.001 g o bacterias por gramo o
0.1 mL 0.01 mL 0.001 mL mililitro de producto
+ + + > 103
+ + < 103 y > 102
+ < 102 y > 10
< 10
4-2. ESCHERICHIA COLI
4-2-1. Preparacin de la muestra e incubacin previa. Preparar una muestra usando una dilucin
1 en 10 de no menos de 1 g del producto por examinar como se describe en el captulo general
2.6.12 (en la seccin B, Mtodo armonizado), y usar 10 mL o la cantidad correspondiente a 1 g o
1 mL para inocular una cantidad adecuada (determinada como se describi en 3-4) de caldo
digerido de casena y soya, mezclar e incubar a 30-35C durante 18-24 h.
4-2-2. Seleccin y subcultivo. Agitar el envase, transferir 1 mL de caldo digerido de casena y soya
a 100 mL de Caldo MacConkey e incubar a 42 - 44C durante 24 - 48 h. Subcultivar en una placa de
Agar MacConkey a 30-35C durante 18 - 72 h.
4-2-3. Interpretacin. El crecimiento de colonias indica la posible presencia de E. coli. Esto se

confirma mediante pruebas de identificacin.
El producto cumple con la prueba si no hay colonias presentes o si las pruebas de identificacin son
negativas.
16
4-3. SALMONELLA
4-3-1. Preparacin de la muestra e incubacin previa. Preparar el producto por examinar como
se describe en el captulo general 2.6.12 (en la seccin B, Mtodo armonizado), y usar la cantidad
correspondiente a no menos de 10 g o 10 mL para inocular una cantidad adecuada (determinada
como se describi en 3-4) de caldo digerido de casena y soya, mezclar e incubar a 30-35C durante
18-24 h.
4-3-2. Seleccin y subcultivo. Transferir 0.1 mL de caldo digerido de casena y soya a 10 mL de

Caldo Rappaport Vassiliadis para enriquecimiento de Salmonella, e incubar a 30-35C durante 18-
24 h. Subcultivar en placas de agar xilosa, lisina, desoxicolato. Incubar a 30-35C durante 18-48 h.
4-3-3. Interpretacin. La posible presencia de Salmonella est indicada por el crecimiento de

colonias bien desarrolladas de color rojo, con o sin centros negros. Esto se confirma mediante
pruebas de identificacin.
El producto cumple con las pruebas si no estn presentes colonias de los tipos descritos, o si las
pruebas de identificacin confirmatorias son negativas.
4-4. PSEUDOMONAS AERUGINOSA
digerido de casena y soya y mezclar. Cando se analizan parches transdrmicos, filtrar el volumen
de muestra correspondiente a un parche de la preparacin descrita en 4-5-1 en el captulo general
2.6.12 a travs de un filtro de membrana estril, y colocar en 100 mL de caldo digerido de casena y
soya. Incubar a una temperatura de 30-35C durante un perodo de 18 a 24 horas.
4-4-2. Seleccin y subcultivo. Subcultivar en una placa de agar cetrimida e incubar a 30-35C
durante 18-72 h.
4-4-3. Interpretacin. El crecimiento de colonias indica la posible presencia de P. aeruginosa. Esto

se confirma mediante pruebas de identificacin.
El producto cumple con la prueba si no hay colonias presentes o si las pruebas confirmatorias de
identificacin son negativas.
4-5. STAPHYLOCOCCUS AUREUS
digerido de casena y soya y mezclar. Cuando se prueban parches transdrmicos, filtrar el volumen
de muestra correspondiente a 1 parche de la preparacin descrita en 4-5-1 en el captulo general
2.6.12 a travs de un filtro de membrana estril, y colocar en 100 mL de caldo digerido de casena y
soya. Incubar a 30-35C durante 18-24 h.
17
4-5-2. Seleccin y subcultivo. Subcultivar en una placa de agar manitol sal e incubar a 30-35C
durante 18-72 h.
4-5-3. Interpretacin. La posible presencia de S. aureus est indicada por el crecimiento de

colonias de color amarillo/blanco rodeadas por una zona amarilla. Esto se confirma mediante
pruebas de identificacin.
4-6. CLOSTRIDIOS
4-6-1. Preparacin de la muestra y tratamiento con calor. Preparar el producto a examinar

usando como se describe en el captulo general 2.6.12 (en la seccin B, Mtodo armonizado).
Tomar 2 porciones iguales que correspondan a no menos de 1 g o 1 mL del producto a examinar.
Calentar una porcin at 80C durante 10 minutos, y enfriar rpidamente. No calentar la otra porcin.
4-6-2. Seleccin y subcultivo. Transferir 10 mL de cada porcin mezclada a 2 contendores (38 mm

x 20 mmm o a otros contenedores adecuados) que contengan 100 mL de medio reforzado para
clostridios. Incubar en condiciones anaerbicas a una temperatura de 30-35C durante 48 horas.
Luego de la incubacin, realizar subcultivos de cada tubo en Agar Columbia, e incubar en
condiciones anaerbicas a una temperatura de 30-35C durante 48 horas.
4-6-3. Interpretacin. El crecimiento de bacilos anaerbico (con o sin endoesporas) que dan una
reaccin de catalasa negativa indica la presencia de clostridios. Esto se confirma mediante pruebas
de identificacin.
4-7. CANDIDA ALBICANS
4-7-1. Preparacin de la muestra e incubacin previa. Preparar el producto por examinar como
se describe en el captulo general 2.6.12 (en la seccin B, Mtodo armonizado), y usar 10 mL o la
cantidad correspondiente a no menos de 1 g o 1 mL para inocular 100 mL de caldo Sabouraud
dextrosa, y mezclar. Incubar a 30-35C durante 3 - 5 das.
4-7-2. Seleccin y subcultivo. Subcultivar en una placa de agar Sabouraud dextrosa e incubar a
30-35C durante 24 - 48 h.
4-7-3. Interpretacin. El crecimiento de colonias puede indicar la presencia de C. albicans. Esto se

confirma mediante pruebas de identificacin.
El producto cumple con las pruebas si tales colonias no estn presentes o si las pruebas
confirmatorias de identificacin son negativas.
La siguiente seccin se presenta para informacin.
18
5. SOLUCIONES Y MEDIOS DE CULTIVO RECOMENDADOS
Se ha encontrado que Las siguientes soluciones y medios de cultivo son satisfactorios para los
propsitos para los que estn prescritos en la prueba de contaminacin microbiana en la
Farmacopea. Se pueden usar otros medios si stos tienen propiedades promotoras del crecimiento e
inhibidoras similares.
Solucin amortiguadora stock. Colocar 34 g de fosfato monobsico de potasio en un matraz

volumtrico de 1000 mL, disolver en 500 mL de agua purificada, ajustar el pH en 7.2 0.2 con
hidrxido de sodio, diluir a 1000.0 mL con agua purificada, y mezclar. Distribuir en contenedores, y
esterilizar. Almacenar a 2-8C.
Solucin amortiguadora de fosfato pH 7.2. Preparar una mezcla de solucin amortiguadora stock y
agua purificada (1:800 V/V), y esterilizar.
Solucin amortiguada de cloruro de sodio-peptona pH 7.0
Fosfato monobsico de potasio 3.6 g

Fosfato dibsico de sodio dihidrato 7.2 g, equivalente a fosfato 0.067 M
Peptona (de carne o casena) 1.0 g
Esterilizar en un autoclave usando un ciclo validado.
Caldo digerido de casena y soya

Digerido pancretico de casena 17.0 g
Digerido papanico de soya 3.0 g
Fosfato dibsico de potasio 2.5 g
Ajustar el pH para que despus de la esterilizacin sea de 7.3 0.2 a 25C.
Agar digerido de casena y soya

Digerido papanico de soya 5.0 g
Agar 15.0 g
19
Agar Sabouraud dextrosa

Dextrosa 40.0 g
Mezcla de digerido pptico de tejido animal y 10.0 g
digerido pancretico de casena (1:1)
Agar 15.0 g
Ajustar el pH para que despus de la esterilizacin sea de 5.6 0.2 a 25C. Esterilizar en un
autoclave usando un ciclo validado.
Agar para dextrosa

Infusin de papas 200 g
Dextrosa 20.0 g
Agar 15.0 g
Caldo Sabouraud dextrosa

Dextrosa 20.0 g
Mezcla de digerido pptico de tejido animal y 10.0 g
digerido pancretico de casena (1:1)
Ajustar el pH para que despus de la esterilizacin sea de 5.6 0.2 at 25 C.
Caldo Mossel para enriquecimiento de enterobacterias

Digerido pancretico de gelatina 10.0 g
Fosfato dibsico de sodio dihidrato 8.0 g
Ajustar el pH para que despus del calentamiento sea de 7.2 0.2 a 25C.
Calentar a 100C durante 30 min y enfriar inmediatamente.
20
Agar violeta rojo bilis glucosa

Agar 15.0 g
Rojo neutro 30 mg
Cristal violeta 2 mg
Ajustar el pH para que despus del calentamiento sea de 7.4 0.2 a 25C.
Calentar a ebullicin; no calentar en un autoclave.
Caldo MacConkey
Prpura de bromocresol 10 mg
Agar MacConkey
Peptonas (de carne y casena) 3.0 g
Agar 13.5 g
Rojo neutro 30.0 mg
Cristal violeta 1 mg
Hervir durante 1 minuto con agitacin constante, y esterilizar en un autoclave usando un ciclo validado.
21
Caldo Rappaport Vassiliadis para enriquecimiento de Salmonella

Peptona de soya 4.5 g
Cloruro de magnesio hexahidrato 29.0 g
Fosfato dibsico de potasio 0.4 g
Verde de malaquita 0.036 g
Disolver, calentado ligeramente. Esterilizar en un autoclave usando un ciclo validado, a una
temperatura que no exceda de 115C. El pH debe ser de 5.2 0.2 a 25C luego del calentamiento y
esterilizacin en autoclave.
Agar xilosa, lisina, desoxicolato

Xilosa 3.5 g
L-Lisina 5.0 g
Sacarosa 7.5 g
Rojo de fenol 80 mg
Agar 13.5 g
Citrato frrico de amonio 0.8 g
Ajustar el pH para que despus del calentamiento sea de 7.4 0.2 a 25C. Calentar a ebullicin,
enfriar a 50C y verter en cajas Petri. No calentar en un autoclave.
Agar cetrimida
Cloruro de magnesio 1.4 g
Sulfato de potasio 10.0 g
Cetrimida 0.3 g
Agar 13.6 g
Glicerol 10.0 mL
Calentar a ebullicin durante 1 min con agitacin. Ajustar el pH para que despus de la
esterilizacin sea de 7.2 0.2 a 25C. Esterilizar en un autoclave usando un ciclo validado.
22
Agar manitol sal

Digerido pptico de tejido animal 5.0 g
Extracto de carne 1.0 g
D-Manitol 10.0 g
Agar 15.0 g
Rojo de fenol 0.025 g
Calentar a ebullicin durante 1 min con agitacin. Ajustar el pH para que despus de la
esterilizacin sea de 7.4 0.2 a 25C. Esterilizar en un autoclave usando un ciclo validado.
Medio reforzado para clostridios

Extracto de carne 10.0 g
Peptona 10.0 g
Almidn soluble 1.0 g
Clorhidrato de cistena 0.5 g
Acetato de sodio 3.0 g
Agar 0.5 g
Hidratar el agar y disolver calentando hasta ebullicin, revolviendo constantemente. Si fuera
necesario, ajustar el pH para que despus de la esterilizacin sea de 6.8 0.2 a 25C. Esterilizar en
un autoclave usando un ciclo validado.
Agar Columbia
Digerido pptico de carne 5.0 g
Digerido pancretico de corazn 3.0 g
Almidn de maz 1.0 g
Agar, de acuerdo con la capacidad de gelacin 10.0 - 15.0 g
Hidratar el agar y disolver calentando hasta ebullicin y revolviendo constantemente. Si fuera

necesario, ajustar el pH para que despus de la esterilizacin sea de 7.3 0.2 a 25C. Esterilizar en
un autoclave usando un ciclo validado. Dejar enfriar a 45-50C; agregar, si fuera necesario, sulfato
de gentamicina correspondiente a 20 mg de gentamicina base, y verter en cajas Petri.
23

2.6.12 y 2.6.13 PhEur 6

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Farmacopea Europea 6.0 2.6.

12 Examen microbiolgico de productos no estriles

2.6.12 EXAMEN MICROBIOLGICO DE PRODUCTOS NO ESTRILES

A. MTODO DE LA FARMACOPEA EUROPEA

Las pruebas descritas a continuacin permitirn la enumeracin cuantitativa de bacterias

Un ejemplo de un plan de muestreo aplicable a productos en que la homogeneidad con respecto a la

Productos no grasos insolubles en agua. Suspender 10 g o 10 mL del producto que va a ser

Productos grasos. Homogeneizar 10 g o 10 mL del producto que va a ser examinado con no ms

de cloruro de sodio-peptona pH 7.0 que contenga una concentracin adecuada de polisorbato 80

Transferir una cantidad adecuada de la muestra preparada como se describe en la seccin

Cuando se examinan parches transdrmicos, filtrar 50 mL de la preparacin A por separado, a travs

Mtodos de recuento en placa

b. Mtodo de dispersin en superficie. Utilizando cajas Petri de 9 cm de dimetro, agregar 15-

Mtodo del nmero ms probable

Tabla 2.6.12.-1. Valores de nmero ms probable de bacterias

Tres tubos en cada nivel de dilucin

EFECTIVIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y VALIDEZ DEL MTODO DE RECUENTO

Candida albicans tal como ATCC 10231 (NCPF 3179, IP 48.72)

Aspergillus niger tal como ATCC 16404 (IMI 149007, IP 1431.83)

Utilizar solucin amortiguada de cloruro de sodio-peptona pH 7.0 para preparar suspensiones de

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS

El recuento bacteriano se considerar igual al nmero promedio de unidades formadoras de colonias

Cuando se indica un lmite en una monografa, ste se interpreta como sigue:

102 microorganismos: lmite mximo aceptable: 5 x 102,

103 microorganismos: lmite mximo aceptable: 5 x 103 y as, sucesivamente.

B. MTODO ARMONIZADO: EXAMEN MICROBIOLGICO DE PRODUCTOS NO

Las pruebas descritas a continuacin permitirn la enumeracin cuantitativa de bacterias

Pueden usarse procedimientos microbiolgicos alternativos, incluyendo mtodos automatizados,

Realizar la determinacin en las condiciones diseadas para evitar la contaminacin microbiana

Si se usan sustancias tensoactivas para la preparacin de la muestra, debe demostrarse su ausencia

4. PRUEBA DE PROMOCIN DEL CRECIMIENTO E IDONEIDAD DEL MTODO DE

4-1. CONSIDERACIONES GENERALES

Debe establecerse la habilidad de la prueba para detectar microorganismos en presencia del

La idoneidad debe confirmarse cuando se introduce un cambio en la realizacin de la prueba o en el

4-2. PREPARACIN DE LAS CEPAS DE PRUEBA

Usar suspensiones estables estandarizadas de cepas de prueba o prepararlas como se indica a

Usar solucin amortiguada de cloruro de sodio-peptona pH 7.0 o solucin amortiguadora de fosfato

4-3. CONTROL NEGATIVO

4.4. PROMOCIN DEL CRECIMIENTO DEL MEDIO

4-5. IDONEIDAD DEL MTODO DE RECUENTO EN PRESENCIA DE PRODUCTO

4-5-1. Preparacin de la muestra. El mtodo de preparacin de la muestra depende de las

Productos no grasos insolubles en agua. Suspender el producto que va a ser examinado

Productos grasos. Disolver en miristato de isopropilo, esterilizado por filtracin, o mezclar el

Parches transdrmicos. Remover la cubierta protectora ('quitar el forro') de los parches

Tabla 2.6.12.-2. Preparacin y uso de los microorganismos de prueba

Microorganismo Preparacin de Promocin del crecimiento Idoneidad del mtodo de contero en

4-5-2. Inoculacin y dilucin. Agregar en la muestra preparada como se describi anteriormente

4.5.3. Neutralizacin/remocin de la actividad antimicrobiana. El nmero de microorganismos

Tabla 2.6.12:3. Agentes neutralizantes comunes parasustancias interferentes

Sustancia interferente Mtodo neutralizante potencial

4-5-4. Recobro de microorganismos en presencia del producto. Para cada microorganismo

4-5-4-2-1. Mtodo de vertido en placa

4-5-4-2-2. Mtodo de dispersin en la superficie

4-6. RESULTADOS E INTERPRETACIN

Si no pueden cumplirse los criterios indicados anteriormente para uno o ms de los

5. PRUEBA DE LOS PRODUCTOS

5-1. CANTIDAD UTILIZADA PARA LA PRUEBA

Tabla 2.6.12.-4. Valores del nmero ms probable de microorganismos

Combinaciones observadas de nmeros de tubos que NMP por

5-2. EXAMEN DEL PRODUCTO

5-2-1. Filtracin por membrana

5-2-2. Mtodos de recuento en placa

5-2-2-1. Mtodo de vertido en placa