Calculo de la Actividad enzimtica de la Ureasa

Oscar Javier Montiel1*, Dagoberto Ortiz Ome1*, Mateo Bolaos1*

1
*Estudiantes del programa de qumica, Facultad de Ciencias Bsicas, Universidad de la Amazonia.
Florencia (Caquet) 2017

Resumen
Se determin la actividad enzimtica de la ureasa, enzima principal de la Harina de Soya, a travs de
Espectrofotometra UV; Se realiz el anlisis de la dependencia de la velocidad de reaccin en funcin
de la cantidad enzimtica (composicin), de la temperatura y del pH. As mismo, se analiz la
especificidad de la accin enzimtica, empleando la presencia de ureasa en la harina de soya y
contrastar su accin en la tiourea.

Palabras claves:Actividad enzimtica, Soya, Determinacin, Temperatura, pH, Espectrofotometra UV.

Abstract:
The enzymatic activity of urease, the main enzyme of Soybean Meal, was determined through UV
spectrophotometry; Reaction rate dependence analysis was performed as a function of the enzymatic
amount (composition), temperature and pH. Likewise, the specificity of the enzymatic action was
analyzed, using the presence of urease in the soybean meal and contrasting its action in the thiourea.
Key words: Enzymatic activity, Soya, Determination, Temperature, pH, UV spectrophotometry.

Introduccin
Las enzimas son molculas de naturaleza La liberacin de enzimas es un proceso
protenica producidas por los seres vivos, constante y, aunque las plantas y animales
desempean un papel esencial en el intervienen, son los microorganismos los que
metabolismo de todos los organismos, se contribuyen en mayor medida a este proceso,
encargan de acelerar reacciones qumicas o debido a su gran biomasa, su alta actividad
hacer posibles aquellas reacciones que de otra metablica y su corto ciclo de vida (Cern y
manera no se produciran. En pocas palabras, Melgarejo, 2005). .
son catalizadores biolgicos que, al reducir la
La ureasa es una exoenzima que cataliza la
energa de activacin necesaria para las
reaccin de hidrlisis de la urea, el principal
reacciones, transforman las sustancias
producto celular nitrogenado de la degradacin
involucradas en el metabolismo celular
de las protenas y los cidos nucleicos, el cual
(incluyendo el anabolismo o reacciones de
es ms fcil de eliminar que otras formas de
construccin, y el catabolismo o reacciones de
nitrgeno (como el amoniaco) porque es
destruccin). La velocidad de la reaccin
soluble en agua y menos txico (Science in
catalizada por una enzima depende del pH, de
School, 2008). En dicha reaccin, la urea se
la fuerza inica, de la temperatura y de la
rompe para formar dixido de carbono y
presencia o ausencia de inhibidores (Burns,
1982; Lorens, 2010).
amonio, como se describe en la siguiente
reaccin (Quintero-Lizaola et al., 2005):
CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2
La ureasa tambin es considerada una Amido
hidrolasa que acta sobre los enlaces no
peptdicos de amidas lineales tales como la
Urea y sus derivados (Bremner&Mulvaney,
1982)
La ureasa se encuentra principalmente en
semillas, microorganismos e invertebrados. En
las plantas, es un hexmero (consiste en seis
cadenas idnticas) y se encuentra en el
citoplasma. En las bacterias, consiste en dos o
tres subunidades diferentes. Para su activacin
necesita unir dos iones de nquel por subunidad
(Science in School, 2008). Su pH ptimo es
7.4, y su temperatura ptima 60 C (Kandeler y
Gerber, 1988).
Las tcnicas para obtener una determinacin
cuantitativa de ureasa en muestras se basan
en que la tasa inicial de la reaccin cataltica es
proporcional al nmero de moles presentes, el
cual se podra calcular a partir del nmero de
moles de sustrato que reaccionan por minuto y
mol de enzima bajo condiciones estndares.
(Casanova & Benavides, 1995). En nuestro
caso usaremos la determinacin por
espectrofotometra UV.
Materiales y metodologa
Se prepararon diferentes disoluciones que se
dejaron en reposo durante 8 das, las
disoluciones preparadas fueron:
Solucin de Ureasa: se Pes 14 g
de harina de soya, y se depositaron
en un vaso de precipitado, se
adicion 100 mL de glicerol al 75%,
y se agit la suspensin por 15
minutos, se taparla y se llev al
refrigerador por un da. Luego se
filtr el extracto glicerinado a
travs de una gasa.
Solucin de Ureasa. Se disolvi 0.1
g de Ureasa a 100 mL con solucin
de glicerol al 75% conservndola
en refrigerador.
Solucin Buffer de Fosfato de Sodio
1mM pH 7.00.
Solucin Urea 1% p/v en Buffer de
fosfato de sodio 1mM pH 7.00.
Solucin Tiourea 1% p/v en Buffer
de fosfato de sodio 1mM pH 7.00
Solucin Rojo fenol 0.1% p/v en
solucin de etanol-agua.
Solucin de NaOH 2 M.
Solucin de cido Fosfrico 2M.
Determinacin de la actividad
enzimtica del extracto de Ureasa
Con una pipeta de vidrio de 5 mL se
midieron 3 mL de la solucin de urea 1 %
p/v, y se introducen en una cubeta de
espectrofotmetro. Se adicionaron 100 L
de solucin buffer fosfato y 100 L de
solucin de rojo fenol, se tap la cubeta
con un pedazo de Parafilm y se agit.
Se limpiaron cuidadosamente con un
pao las caras lisas de la cubeta.
Se introduce la cubeta en el
compartimiento de muestra del
espectrofotmetro, procurando que el haz
de luz del mismo atraviese la cubeta por
las caras lisas.
Se ajust el espectrofotmetro a cero de
absorbancia o 100 % de transmitancia
con el mando correspondiente.
Se configur el espectrofotmetro en
modo de lectura continuo para que
registre medidas de absorbancias cada 15
seg durante 1 minuto.
En otra celda se puso con una pipeta 3
mL de la solucin de urea 1 % p/v, 100 L
de solucin de rojo y lo ms rpidamente
posible se realizaron las siguientes
operaciones: *se midi 100 L de la
solucin de la enzima y se introdujo en la
cubeta de sustrato (Momento de inicio de
la reaccin). * Se tap la cubeta con un
trozo de Parafilm, y se invierte 2 o 3
veces para mezclar bien el contenido de 0,373466
la cubeta. 6 2,2408 0,0578 67
Esta operacin se realiz para todos los 0,328171
experimentos. 7 2,2972 0,0564 43
Desnaturalizacin de la enzima por 8 2,3504 0,0532 0,2938
temperatura. 0,266955
En tres tubos de ensayo se puso 1 mL de 9 2,4026 0,0522 56
extracto de Ureasa y se calent a bao
10 2,4524 0,0498 0,24524
mara por 2 minutos a 60 y 90 C por 2
0,227563
minutos.
11 2,5032 0,0508 64
Desnaturalizacin de la enzima por
cambio de pH.
En un vaso de precipitado se tom 10 mL
de solucin de urea 1% lleve a pH 10
adicion NaOH, verificando el cambio de
pH con el pHmetro. Tabla 2: Concentracin y velocidad de reaccin
Se utiliz esta solucin para la Moles = 0.1666 mol/L
determinacin de la actividad de ureasa
segn el numeral 4. Epsilon rojo Fenol= 0,94 M-1cm-1

En un vaso de precipitado se 10 mL de
solucin de urea 1% y se llev a pH 4
adicionando cido fosfrico, verificando el
cambio de pH con el pHmetro.
Ensayo de especificidad de la
enzima.

Se realiz la medida de la actividad de

ureasa segn el numeral 4 pero utilizando
como sustrato la solucin de tiourea.

Resultados

Grafica 1: Absorbancia Vs tiempo, Velocidad

Tabla 1: Datos de absorbancia de la de reaccin Vs tiempo, Actividad enzimtica Vs
actividad enzimtica de la Ureasa 1. tiempo.

tiempo
(s) Abs activity V de rxn
0 1,8849 0 Abs/t
1 1,9429 0,058 1,9429
2 2,0052 0,0622 1,0026
3 2,0652 0,06 0,6884
4 2,123 0,0578 0,53075
5 2,183 0,06 0,4366
 4,008 1,044
actividad enzimatica 1 5,01 1,0667
6,012 1,0922
3
7,014 1,1145
2.5
f(x) = 0.06x + 1.89 8,016 1,1386
2 R = 1 9,018 1,1651
Absorbancia 1.5 10,02 1,1911
1 11,022 1,2164
0.5 12,024 1,2412
0 13,026 1,2662
0 2 4 6 8 10 12
14,028 1,292
Tempo (sg) 15,03 1,3177
16,032 1,3435
datos lineales 17,034 1,3698
Linear (datos lineales) 18,036 1,396
velocidad de reaccion 19,038 1,4223
actividad enzima 20,04 1,4483
21,042 1,4746
22,044 1,5017
23,046 1,5286
24,048 1,5556
25,05 1,5831
26,052 1,6105
Tabla 3: Ajuste de mnimos cuadrados.
27,054 1,6379
pendien 28,056 1,6656
te 29,058 1,6932
0,056555 30,06 1,7206
94 0,02442626
31,062 1,7478
0,055489 -
51 0,01906707 32,064 1,7751
0,054296 33,066 1,8024
5 -0,0219746 34,068 1,8292
0,052933 - 35,07 1,8564
57 0,02559274 36,072 1,8831
37,074 1,9105
38,076 1,9376
39,078 1,9647
Tabla 4: Datos actividad enzimtica enzima
40,08 1,992
preparada. Absorbancia Vs Tiempo.
41,082 2,0188
Time Abs 42,084 2,0458
0 0,948 43,086 2,0721
1,002 0,9716 44,088 2,0989
2,004 1,0011 45,09 2,1249
3,006 1,0219 46,092 2,1516
 47,094 2,1767 1,3744680
48,096 2,2029 85 2939,409934
1,4018085
49,098 2,228
11 2798,020979
50,1 2,2528 1,4292553
51,102 2,2777 19 2674,504714
52,104 2,302 1,4572340
53,106 2,3262 43 2566,456574
54,108 2,3503 1,4851063
55,11 2,3729 83 2470,236831
1,5130851
56,112 2,3963
06 2384,313121
57,114 2,4192 1,5407446
58,116 2,4412 81 2306,504013
59,118 2,4635 1,5687234
04 2236,560314
1,5975531
Tabla 5: datos concentracin y velocidad de 91 2174,133358
reaccin enzima preparada. 1,6261702
13 2116,857866
1,6548936
concentra velocidad de 17 2064,488045
cin reaccin 1,6841489
0 0 36 2016,944834
1,0336170 1,7132978
21 30946,6174 72 1972,936288
1,065 15943,11377 1,7424468
1,0871276 09 1932,187634
6 10849,57744 1,7719148
1,1106382 94 1894,690861
98 8313,160912 1,8012765
1,1347872 96 1859,670241
34 6795,133138 1,8304255
1,1619148 32 1826,771988
94 5797,978511 1,8593617
1,1856382 02 1795,790711
98 5071,164662 1,8884042
1,2112765 55 1766,845299
96 4533,220792 1,9174468
1,2394680 09 1739,654154
85 4123,313656 1,9459574
1,2671276 47 1713,594088
6 3793,795388 1,9748936
1,2940425 17 1689,387183
53 3522,162638 2,0032978
1,3204255 72 1666,082728
32 3294,47488 2,0324468
1,3470212 09 1644,640564
77 3102,306026 2,0612765 1624,075477
 96
2,0901063 enzima preparada actividad
83 1604,565011
2,1191489
36 1586,189323 3
2,1476595 2 f(x) = 0.03x + 0.93
74 1568,321582 R = 1
absorbancia
2,1763829 1
79 1551,456358 0
2,2043617 0 10 20 30 40 50 60 70
02 1534,857055
tiempo
2,2328723
4 1519,374211
2,2605319
15 1504,01325
2,2889361
7 1489,804849
Tabla 6: Datos de la Influencia de la
2,3156382
98 1475,116765 temperatura (60 C) en la enzima.
2,3435106 Time Abs
38 1461,770608
0 0,6717
2,3702127
66 1448,254165 1,002 0,6987
2,3965957 2,004 0,7246
45 1435,087272 3,006 0,7529
2,4230851 4,008 0,7799
06 1422,499182 5,01 0,8079
2,4489361
6,012 0,8361
7 1410,027735
2,4746808 7,014 0,8642
51 1397,966812 8,016 0,8925
2,5003191 9,018 0,9205
49 1386,293607 10,02 0,9487
2,5243617 11,022 0,9767
02 1374,176212 12,024 1,0043
2,5492553
13,026 1,0318
19 1362,946599
2,5736170 14,028 1,0589
21 1351,831611 15,03 1,0859
2,5970212 16,032 1,1124
77 1340,605656 17,034 1,1388
2,6207446 18,036 1,1643
81 1329,922197 19,038 1,19
20,04 1,2149
21,042 1,2396
22,044 1,2639
Grafica 2: Absorbancia Vs tiempo
23,046 1,2878
24,048 1,3113
 25,05 1,3341 0,7432978
26,052 1,3567 72 22254,42732
0,7708510
27,054 1,379
64 11539,68658
28,056 1,4011 0,8009574
29,058 1,4227 47 7993,587293
30,06 1,4438 0,8296808
31,062 1,4645 51 6210,186011
32,064 1,4853 0,8594680
33,066 1,5054 85 5146,51548
0,8894680
34,068 1,5253
85 4438,463499
35,07 1,5447 0,9193617
36,072 1,564 02 3932,257066
37,074 1,5826 0,9494680
38,076 1,6016 85 3553,398522
39,078 1,6201 0,9792553
40,08 1,6379 19 3257,669059
1,0092553
41,082 1,6558
19 3021,722512
42,084 1,6735 1,0390425
43,086 1,691 53 2828,096225
44,088 1,7082 1,0684042
45,09 1,7256 55 2665,67928
46,092 1,7421 1,0976595
74 2528,004547
47,094 1,7591
1,1264893
48,096 1,7755 62 2409,0876
49,098 1,792 1,1552127
50,1 1,8081 66 2305,813904
51,102 1,8243 1,1834042
52,104 1,8397 55 2214,454071
53,106 1,856 1,2114893
62 2133,655093
54,108 1,8716
1,2386170
55,11 1,887 21 2060,24122
56,112 1,9024 1,2659574
57,114 1,9167 47 1994,890398
58,116 1,9324 1,2924468
59,118 1,9474 09 1934,800612
1,3187234
04 1880,130317
Tabla 7: datos concentracin y velocidad de 1,3445744
reaccin de la influencia de la temperatura 68 1829,850936
(60C) en la enzima. 1,37 1783,389742
Concentra Velocidad de 1,395 1740,269461
cin reaccin 1,4192553
19 1699,706969
1,4432978 1662,01966
 72 1,9407446
1,4670212 81 1139,335846
77 1626,7701 1,9571276
1,4905319 6 1126,858395
15 1593,810859 1,9744680
1,5135106 85 1115,392659
38 1562,575509 1,9910638
1,5359574 3 1103,938695
47 1532,891663 2,0074468
1,5579787 09 1092,785416
23 1504,711921 2,0238297
1,5801063 87 1082,030468
83 1478,392948 2,0390425
1,6014893 53 1071,038215
62 1452,993433 2,0557446
1,6226595 81 1061,193827
74 1428,900647 2,0717021
1,6432978 28 1051,305251
72 1405,729574
1,6638297
87 1383,757308
1,6836170 Grafica 3: Influencia de la temperatura sobre la
21 1362,370142 actividad enzimtica. Absorbancia Vs Tiempo.
1,7038297
87 1342,443892
1,7235106 enzima a 60C 1 ensayo
38 1323,131152
2.5
1,7424468
09 1304,226653 2
f(x) = 0.02x + 0.75
1,7614893 1.5 R = 0.99
62 1286,322011 absorbancia 1
1,7803191
49 1269,118298 0.5
1,7989361 0
7 1252,566613 0 10 20 30 40 50 60 70
1,8172340 tiempo
43 1236,550111
1,8357446
81 1221,387013
1,8532978
72 1206,260005
Tabla 8: influencia del pH 4 sobre la enzima.
1,8713829
79 1192,115543 Time Abs
1,8888297
0 0,112
87 1178,162292
1,9063829 1,002 0,113
79 1164,843565 2,004 0,1136
1,9235106 3,006 0,1139
38 1151,802777 4,008 0,1142
 5,01 0,1145 48,096 0,1152
6,012 0,1147 49,098 0,1152
7,014 0,1148 50,1 0,1152
8,016 0,1148 51,102 0,1152
9,018 0,115 52,104 0,1153
10,02 0,115 53,106 0,1152
11,022 0,1151 54,108 0,1152
12,024 0,1152 55,11 0,1152
13,026 0,1152 56,112 0,1152
14,028 0,1152 57,114 0,1152
15,03 0,1154 58,116 0,1152
16,032 0,1155 59,118 0,1152
17,034 0,1156
18,036 0,1157 Tabla 9: datos de concentracin y velocidad de
19,038 0,1158 reaccin
20,04 0,1157
21,042 0,1157 concentra velocidad de
cin reaccin
22,044 0,1157
0,1191489
23,046 0,1156 36 0
24,048 0,1156 0,1202127
25,05 0,1156 66 3599,18461
26,052 0,1156 0,1208510
27,054 0,1156 64 1809,147662
28,056 0,1156 0,1211702
13 1209,283561
29,058 0,1156
0,1214893
30,06 0,1155 62 909,3515097
31,062 0,1155 0,1218085
32,064 0,1155 11 729,3922793
33,066 0,1155 0,1220212
34,068 0,1154 77 608,8886058
0,1221276
35,07 0,1154
6 522,3595362
36,072 0,1154 0,1221276
37,074 0,1152 6 457,0645942
38,076 0,1153 0,1223404
39,078 0,1154 26 406,9874436
40,08 0,1153 0,1223404
41,082 0,1153 26 366,2886992
0,1224468
42,084 0,1153
09 333,2792828
43,086 0,1152 0,1225531
44,088 0,1153 91 305,7714359
45,09 0,1152 0,1225531
46,092 0,1152 91 282,2505562
47,094 0,1152 0,1225531 262,0898022
 91 0,1227659
0,1227659 57 94,24685817
57 245,0418312 0,1226595
0,1228723 74 91,81105873
4 229,9257867 0,1226595
0,1229787 74 89,57176462
23 216,5881004 0,1226595
0,1230851 74 87,43910356
06 204,7323792 0,1225531
0,1231914 91 85,33156349
89 194,1246287 0,1226595
0,1230851 74 83,46459885
06 184,2591413 0,1225531
0,1230851 91 81,53904956
06 175,4848965 0,1225531
0,1230851 91 79,76646153
06 167,5083103 0,1225531
0,1229787 91 78,06930277
23 160,0868568 0,1225531
0,1229787 91 76,44285896
23 153,4165711 0,1225531
0,1229787 91 74,88280062
23 147,2799083 0,1225531
0,1229787 91 73,3851446
23 141,6152964 0,1225531
0,1229787 91 71,9462202
23 136,3702854 0,1226595
0,1229787 74 70,62389133
23 131,4999181 0,1225531
0,1229787 91 69,23126849
23 126,9654382 0,1225531
0,1228723 91 67,94920797
4 122,6270863 0,1225531
0,1228723 91 66,71376782
4 118,6713738 0,1225531
0,1228723 91 65,52245054
4 114,9628934 0,1225531
0,1228723 91 64,37293386
4 111,4791693 0,1225531
0,1227659 91 63,26305569
57 108,1066902 0,1225531
0,1227659 91 62,19080051
57 105,0179277
0,1227659
Grafica 4: Absorbancia Vs tiempo. Datos de la
57 102,100763
influencia del ph 4 sobre la enzima.
0,1225531
91 99,16911433
0,1226595
74 96,64321972
 25,05 0,8237
tiempo vs absorvancia 26,052 0,8236
0.12 27,054 0,8236
28,056 0,8235
0.12
29,058 0,8235
f(x) = - 0x^2 + 0x + 0.11
absorbancia 0.11 R = 0.66 30,06 0,8234
0.11
31,062 0,8232
32,064 0,8231
0.11
0 10 20 30 40 50 60 70 33,066 0,8232
34,068 0,8231
tiempo
35,07 0,8231
36,072 0,8231
37,074 0,823
38,076 0,823
Tabla 10: influencia del pH 12 sobre la 39,078 0,8229
actividad de la enzima. 40,08 0,8229
41,082 0,8228
Time Abs
42,084 0,8228
0 0,825
43,086 0,8228
1,002 0,825
44,088 0,8228
2,004 0,8254
45,09 0,8227
3,006 0,8253
46,092 0,8227
4,008 0,825
47,094 0,8227
5,01 0,8249
48,096 0,8226
6,012 0,8249
49,098 0,8225
7,014 0,8247
50,1 0,8226
8,016 0,8246
51,102 0,8226
9,018 0,8244
52,104 0,8225
10,02 0,8243
53,106 0,8226
11,022 0,8242
54,108 0,8224
12,024 0,8242
55,11 0,8225
13,026 0,8241
56,112 0,8223
14,028 0,824
57,114 0,8224
15,03 0,8239
58,116 0,8224
16,032 0,824
59,118 0,8223
17,034 0,8239
18,036 0,8239
19,038 0,8238 Tabla 11: Concentracin y velocidad de
20,04 0,8238 reaccin.
21,042 0,8238 concentra velocidad de
22,044 0,8237 cin reaccin
23,046 0,8238 0,8776595
24,048 0,8237 74 0
0,8776595 96
74 26277,23277 0,8761702
0,8780851 13 1008,947735
06 13144,98662 0,8761702
0,8779787 13 971,5793
23 8762,262709 0,8760638
0,8776595 3 936,7662851
74 6569,308192 0,8760638
0,8775531 3 904,4639994
91 5254,80953 0,8759574
0,8775531 47 874,2090288
91 4379,007942 0,8757446
0,8773404 81 845,8032459
26 3752,525344 0,8756382
0,8772340 98 819,2723595
43 3283,061537 0,8757446
0,8770212 81 794,5424432
77 2917,569117 0,8756382
0,8769148 98 771,0798678
94 2625,493693 0,8756382
0,8768085 98 749,0490144
11 2386,522892 0,8756382
0,8768085 98 728,2420974
11 2187,645985 0,8755319
0,8767021 15 708,4737942
28 2019,120515 0,8755319
0,8765957 15 689,829747
45 1874,670113 0,8754255
0,8764893 32 672,060135
62 1749,479764 0,8754255
0,8765957 32 655,2586317
45 1640,336349 0,8753191
0,8764893 49 639,199028
62 1543,658615 0,8753191
0,8764893 49 623,9800035
62 1457,899803 0,8753191
0,8763829 49 609,4688406
79 1381,000597 0,8753191
0,8763829 49 595,6172761
79 1311,950567 0,8752127
0,8763829 66 582,3105562
79 1249,47673 0,8752127
0,8762765 66 569,6516311
96 1192,537555 0,8752127
0,8763829 66 557,5313836
79 1140,82658 0,8751063
0,8762765 83 545,8497898
96 1093,159426 0,875 534,6449957
0,8762765 1049,433049 0,8751063 524,0157982
 83 4 0,6221
0,8751063 5 0,6224
83 513,7409786 6 0,6225
0,875 503,8000921 7 0,6222
0,8751063
8 0,6221
83 494,3545266
9 0,622
0,8748936
17 485,0818458 10 0,6221
0,875 476,3200871 11 0,6232
0,8747872 12 0,6238
34 467,700617 13 0,6239
0,8748936 14 0,6239
17 459,5512223 15 0,6237
0,8748936
16 0,6228
17 451,6279254
0,8747872 17 0,6221
34 443,9192297 18 0,6227
19 0,6238
20 0,6243
21 0,6242
Grafica 5: influencia del pH 12 en la actividad 22 0,6237
de la enzima. 23 0,6233
24 0,6225
tiempo vs absorbancia 25 0,6225
26 0,6219
0.83
27 0,6215
0.83
f(x) = - 0x + 0.82
28 0,6206
0.82
R = 0.95 29 0,6206
absorbancia 0.82 30 0,6202
0.82
31 0,6203
0.82
32 0,6203
0.82
0 10 20 30 40 50 60 70 33 0,6203
tiempo
34 0,6201
35 0,6201
36 0,62
37 0,6198
38 0,6197
Tabla 12: Datos de la especificidad de la 39 0,62
enzima con Tiourea. 40 0,6204
Time Abs 41 0,6205
0 0,6197 42 0,6211
1 0,6192 43 0,6215
2 0,6197 44 0,6216
3 0,6212 45 0,621
46 0,6209
 47 0,6197 0,6637234
48 0,618 04 1422,264438
0,6635106
49 0,6176
38 1327,021277
50 0,6172 0,6625531
51 0,6172 91 1242,287234
52 0,6173 0,6618085
53 0,6171 11 1167,897372
54 0,617 0,6624468
55 0,617 09 1104,078014
0,6636170
56 0,6168
21 1047,816349
57 0,6168 0,6641489
58 0,6166 36 996,2234043
59 0,6166 0,6640425
53 948,6322188
0,6635106
Tabla 13: concentracin y velocidad de 38 904,787234
reaccin de la tiourea. 0,6630851
concentra velocidad de 06 864,893617
cin reaccin 0,6622340
0,6592553 43 827,7925532
19 0 0,6622340
0,6587234 43 794,6808511
04 19761,70213 0,6615957
0,6592553 45 763,3797054
19 9888,829787 0,6611702
0,6608510 13 734,6335697
64 6608,510638 0,6602127
0,6618085 66 707,3708207
11 4963,56383 0,6602127
0,6621276 66 682,9787234
6 3972,765957 0,6597872
0,6622340 34 659,787234
43 3311,170213 0,6598936
0,6619148 17 638,6067261
94 2836,778116 0,6598936
0,6618085 17 618,650266
11 2481,781915 0,6598936
0,6617021 17 599,9032882
28 2205,673759 0,6596808
0,6618085 51 582,0713392
11 1985,425532 0,6596808
0,6629787 51 565,4407295
23 1808,123791 0,6595744
0,6636170 68 549,6453901
21 1659,042553 0,6593617
0,6637234 02 534,6175963
04 1531,669394 0,6592553 520,4647256
 19
0,6595744 tiempo vs absorbancia
68 507,3649755
0.63
0,66 495
0,6601063 0.63
83 483,0046705 f(x) = - 0x + 0.62
0,6607446 absorbancia 0.62 f(x) = - 0x^2 + 0x + 0.62
R = 0.54
R = 0.77
81 471,9604863 0.62
0,6611702 0.61
13 461,2815438 0 10 20 30 40 50 60 70
0,6612765 tiempo
96 450,8704062
0,6606382
98 440,4255319
0,6605319 Discusin de los resultados
15 430,7816836
En la tabla 1 y 2 se encuentran los datos
0,6592553
19 420,8012675 obtenidos en el espectrofotmetro UV y los
0,6574468 datos de concentracin y velocidad de reaccin
09 410,9042553 obtenidos con la ecuacin de Lamber-Beer.
0,6570212 Para obtener la concentracin y la velocidad de
77 402,2579244 reaccin fue necesario obtener el Coeficiente
0,6565957 de extincin molar del indicador Rojo Fenol que
45 393,9574468 se encontraba a una concentracin de 0,28 M,
0,6565957 el Epsilon obtenido fue de 0,94 M-1cm-1, con el
45 386,232791 cual se obtuvo la concentracin que se puede
0,6567021 observar en la tabla 2; en las concentraciones
28 378,8666121 obtenidas se puede observar claramente como
0,6564893 a medida que pasa el tiempo la concentracin
62 371,5977519 aumenta, esto es debido que las molculas de
0,6563829 rojo fenol reaccionan con las molculas de
79 364,6572104 amoniaco producidas por influencia de la
0,6563829 enzima Ureasa de la Harina de Soya que acta
79 358,0270793 como catalizador, el aumento en la
0,6561702 concentracin indica que se produce la
13 351,5197568 formacin de producto y por lo tanto la
0,6561702 coloracin de la disolucin es ms intensa.
13 345,3527436 Caso contrario ocurre con la velocidad de la
0,6559574 reaccin pues como se ve en la tabla 2 esta
47 339,2883346 disminuye a medida que pasa el tiempo, esto
0,6559574 es debido a que cada vez hay menos
47 333,5376848
molculas de sustrato con el que la enzima
pueda formar el intermediario SE (sustrato-
Grafica 6: Especificidad de la enzima con enzima, que tiene una energa de activacin
toiurea. ms baja), por lo que hay cada vez menos
molculas que lleguen al estado de transicin,
lo que hace que la velocidad disminuya, ya que
esta es proporcional a las molculas en estado
de transicin.
Las tabla 4 y 5 junto con la grafica 2, nos
muestran los datos y valores obtenidos en el
experimento de la actividad enzimtica de la
enzima preparada de la Harina de soya
comercial, en ella se observa los mismos
rasgos que anteriormente se explicaron, sin
embargo se hace notar que en el tabla 1 y 2
solo se tomaron 10 datos que proporcionaron
una linealidad aceptable que nos permiti
obtener un R2 muy cercano a 1, en cambio en
las tablas 4 y 5 si se tomaron todos los datos y
el R2 obtenido prcticamente 1, esto significa
que en la experiencia 2 se presentaron menos
errores que en la 1.
La velocidad de reaccin por enzimas
proporciona informacin directa del mecanismo
de reaccin cataltica y la especificad de la
enzima. La velocidad de reaccin catalizada
por una enzima se debe tener en cuenta las
condiciones que esta se debe mantener, puesto
si no se logra obtener las situaciones ideales
est no sufrir ningn cambio. ende la enzima se desnaturaliza.
En la tabla 6 y 7, se recogieron los datos de la
influencia de la temperatura sobre la actividad
enzimtica, en ellas se puede observar que al
calentar la enzima a 60C no afecta de manera
seria a la actividad de la enzima, pues la
enzima no se alcanza a desnaturalizar, sin
embargo, al calentarla la enzima a una
temperatura de 90C si se observa la
inactividad de la enzima o como comnmente
se conoce la enzima se desnaturalizo, pues la
alta temperatura provoca el aumento en la
vibracin de las molculas provocando la
ruptura de enlaces, entre ellos los mas dediles
como los de Hidrogeno, este proceso al ser
irreversible la enzima deja de funcionar.
En las tablas 8,9,10 y 11 se encuentran los
datos obtenidos de la influencia del pH sobre la
actividad de la enzima en pH 4 y 12 (por
duplicado), la mayora de las enzimas son muy
sensibles a cambios de pH, valores con pocas
dcimas por debajo o por encima del pH optimo
pueden afectar drsticamente la actividad de la
enzima, la ureasa tiene un pH optimo de 7,
segn (Casanova et al, 1995) por lo que a pH.
4 y 12 no eran de esperarse una actividad
considerablemente favorable a nivel industrial o
de laboratorio. En las graficas previamente
mencionadas (tablas 8, 9,10 y 11) se ilustra los
resultados que corroboran dicha informacin.
Los enzimas poseen grupos qumicos
ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol
-SH; imidazol, etc.) en las cadenas laterales de
sus aminocidos. Segn el pH del medio, estos
grupos pueden tener carga elctrica positiva,
negativa o neutra. Como la conformacin de las
protenas depende, en parte, de sus cargas
elctricas, habr un pH en el cual la
conformacin ser la ms adecuada para la
actividad cataltica. Este es el llamado pH
ptimo segn (Casanova et al 1995).
Para el caso de la ureasa esta tiene una carga
negativa la cual en medio protonado (acido)
estabiliza su carga y a medida que esta se
estabiliza pierde su accin de catalizar y por
La grafica a pH 4, ilustra como la activada
enzimtica es optima hasta los 20 segundos
(ubicndose el pico ms alto en este punto), de
all empieza a decaer, revelando una
desnaturalizacin de la enzima, la cual va
inhibiendo su actividad hasta el segundo 40,
donde se observa su actividad en una mnima
proporcin, posteriormente siguiendo una
tendencia lineal constante indicando inactividad
enzimtica.
Para la actividad enzimtica a pH 12 (grafica
5) se observa una desnaturalizacin de la
enzima desde el momento de la medida en el
equipo de UV-vis. Este comportamiento o
hecho se debe a la cantidad de iones OH
presentes en el medio acuoso (pH alcalino), ya
que estas enzimas son optimas a pH neutros
(7) y este medio es muy alcalino el cual no es
el adecuado para la ureasa.
Para la especifidad (ver grafica 6) se observa
una actividad bien particular, ya que las
literaturas muestran otro tipo de tendencias en
cuanto a esta variable, (graficas con formas de
arco). En este punto la Ureasa se encuentra en
su pH ptimo (7), temperatura ambiente y
concentracin 0,28M condiciones apropiadas
para una actividad enzimtica normal para esta
enzima, no obstante la grafica refleja una
variacin donde la actividad enzimtica sube,
baja, se mantiene constante por unos
segundos y vuelve a subir y a bajar, dando a
entender que en ciclos de tiempo trabaja y
vuelve a descansar, dato opuesto al
bibliogrfico. Este comportamiento se puede
atribuir a errores aleatorios, a la hora de medir
las cantidades de soluciones, contaminacin de
la muestra problema, o de soluciones. Si bien
la actividad enzimtica depende de la
temperatura, concentracin y pH y afinidad, a
las condiciones expuestas de la enzima los
resultados deberan ser de tendencia normal
(parecidos a los de las biografas).
Conclusiones
Las enzimas son molculas de naturaleza
protenica producidas por los seres vivos,
desempean un papel esencial en el
metabolismo de todos los organismos, se
encargan de acelerar reacciones qumicas. Lo
que significa que a mayor velocidad de
reaccin menor es la concentracin de
la enzima.
El error mnimo de cuadrados no
concuerda con el R^2 puesto a los
errores grasos y a las condiciones de
pH.
La espectrofotometra UV es un
mtodo efectivo que sirve para la
determinacin cuantitativa de la
actividad enzimtica de una enzima,
debido a su alta sensibilidad.
Para una actividad optima en campo
se podra modificar la variable
temperatura, ya que esta aumenta las
colisiones entre enzima- sustrato
permitiendo mas contacto y velocidad
de reaccin, el cual sera un caso
favorable para sistemas que requieran
descomposicin de reactivos
especficos(obviamente sin descartar
los riesgos que pueda llevar esta
accin, por formacin de compuestos
txicos o explosin al contacto con
otros reactivos presentes en el
sistema).
Referencias
1. Burns, R.G. 1982. Enzyme activity
in soil: Location and a possible role
in microbial ecology. SoilBiology
and Biochemistry. 14, 423-427.
2. Science in School, 2008.
http://www.scienceinschool.org/prin
t/1074. Consultado en marzo de
2017.
3. Lorenc, A. (2010). La investigacin
de la accin de la ureasa. Science
in School. Vol 9. Recuperado de:
http://www.scienceinschool.org/es/
2008/issue9/urease.
4. Mulvaney, R. L; &Bremner, J. M.
(1979). A modified diacetyl
monoxime method form
colorimetric determination of urea
in soil extrac. Communications in
Soil Science and Plant Analysis. Vol
10:1. Pag 1.163-1.170.
5. Cern, R.L., Melgarejo, M.L. 2005.
Enzimas del Suelo: Indicadores de
Calidad y Salud. Acta Biolgica
Colombiana. 1, 5-18.
6. Kandeler, E., Gerber, H. 1988.
Short-term assay of soil urease
activity using colorimetric
determination of amonium. Biology
and Fertility of Soils. 6, 68-72.
7. Casanova, M.P., & Benavides, C.Z.
(1995). Actividad de la Ureasa en
suelos de la zona central de chile.
Agricultura Tecnica (Chile). Vol
55:2. Pag 155-158.