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1 Laboratorio de Microbiologa General

2 Laboratorio de Microbiologa General

CONTENIDO

CONTENIDO................................................................................................. 2

PRCTICA N1 BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE


MICROBIOLOGIA.......................................................................................... 5

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS................................................................7

PRACTICA N2 UTILIDAD Y PREPARACION DE


MATERIALES USADOS EN MICROBIOLOGIA..................................................8

CUESTIONARIO......................................................................................... 8

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS................................................................9

PRACTICA N3 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO


(COMUNES Y ESPECIALES).........................................................................10

CUESTIONARIO....................................................................................... 10

PRACTICA N4 COLORACION GRAM Y ZIEHL


NEELSEN.................................................................................................... 11

RESULTADOS.......................................................................................... 11

DISCUSIN DE RESULTADOS..................................................................13

CUESTIONARIO....................................................................................... 13
3 Laboratorio de Microbiologa General

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS..............................................................15

PRACTICA N5 COLORACIONES ESPECIALES I.............16

RESULTADOS.......................................................................................... 16

COLORACION DE ESPORAS..................................................................16
............................................................................................................ 16
COLORACION DE CAPSULA..................................................................16
COLORACION DE FLAGELO..................................................................17
COLORACION DE CORPUSCULOS METACROMATICOS..........................17
............................................................................................................ 17
DISCUSION DE RESULTADOS..................................................................18

COLORACION DE ESPORAS..................................................................18
COLORACION DE CAPSULA..................................................................18
COLORACION DE FLAGELO..................................................................18
COLORACION DE CORPUSCULOS METACROMATICOS..........................18
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS..............................................................19

PRACTICA N5 COLORACIONES ESPECIALES II............20

RESULTADOS.......................................................................................... 20

DEMOSTRACION DE PARED CELULAR..................................................20


COLORACION DE MEMBRANA CELULAR...............................................20
TINCION DE NUCLEO BACTERIANO......................................................21
TINCION DE NUCLEO EN LEVADURAS..................................................21
DISCUSIN DE RESULTADOS..................................................................22

DEMOSTRACION DE PARED CELULAR..................................................22


COLORACION DE MEMBRANA CELULAR...............................................22
TINCION DE NUCLEO BACTERIANO......................................................22
TINCION DE NUCLEO EN LEVADURAS..................................................22
REFERNCIAS BIBLIOGRAFICAS................................................................23

PRACTICA N6 CULTIVO DE MICROORGANISMOS


AEROBIOS.................................................................................................. 24

RESULTADOS Y DISCUSION.....................................................................24

Aislamiento por el mtodo de Estriado...............................................24


Aislamiento por Diseminacion.............................................................24
4 Laboratorio de Microbiologa General

Aislamiento por Difusion.....................................................................25


CUESTIONARIO....................................................................................... 25

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS..............................................................29

PRACTICA N7 NUTRICION MICROBIANA Y


DETERMINACION DE REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES..........................30

RESULTADOS.......................................................................................... 30

DETERMINACION DE LOS REQUERIMIENTOS MINIMOS PARA EL


CRECIMIENTO...................................................................................... 30
DETERMINACION DE LOS REQUERIMIENTOS MINIMOS PARA EL
CRECIMIENTO...................................................................................... 31
.................................................................................................................. 32

DISCUSIN DE RESULTADOS..................................................................32

DETERMINACION DE LOS REQUERIMIENTOS MINIMOS PARA EL


CRECIMIENTO...................................................................................... 32
DETERMINACION DE LOS REQUERIMIENTOS MINIMOS PARA EL
CRECIMIENTO...................................................................................... 33
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS..............................................................33

PRACTICA N8 ENNUMERACION DE
MICROORGANISMOS.................................................................................. 34

RESULTADOS.......................................................................................... 34

RECUENTO POR EL METODO DE LAS PLACAS......................................34


CONTEO DIRECTO............................................................................... 35
METODOS TURBIDIMETRICOS..............................................................35
RECUENTOS POR EL METODO DEL NUMERO MS PROBABLE.............36
DISCUSIN DE RESULTADOS..................................................................36

RECUENTO POR EL METODO DE LAS PLACAS......................................36


CONTEO DIRECTO............................................................................... 37
METODOS TURBIDIMETRICOS..............................................................37
RECUENTOS POR EL METODO DEL NUMERO MS PROBABLE.............37
CUESTIONARIO....................................................................................... 37

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS..............................................................38
5 Laboratorio de Microbiologa General

PRCTICA N1
BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO
DE MICROBIOLOGIA

Tipo de Medida de
Accidentes Medida de Bioseguridad
riesgo Seguridad

La ocurrencia de Fsico y
un incendio Qumico

Ganar espacio
Los sismos Fsico
abierto

Evitar la
exposicin
Irradiacin UV Fsico
directa. Uso
de lentes

Uso de lquidos Fsico Uso de


inflamables cabinas o
6 Laboratorio de Microbiologa General

extractores de
aire

Derrame de un
cultivo
Agregar leja a la mesa
bacteriano sobre Biolgico
durante 10 minutos
la mesa de
practica

Eliminacin de Colocarlos en una bolsa


desechos Biolgico roja, llevaros a autoclave y
contaminados de ah a la basura

Colocar las agujas en un


Pincharse con
recipiente de vidrio, no
aguja de
Biolgico intentar tapar las agujas.
extraccin de
Llevar a autoclave y
sangre
desechar

Conexiones
Fsico
elctricas

Investigue acerca de las especies microbianas que se ubican en


cada nivel de bioseguridad

NIVEL DE BIOSEGURIDAD 1

Trabajo con agentes caracterizados que no causan enfermedad en


adultos inmunocompetentes y tienen un bajo potencial de peligro
para los trabajadores y el ambiente.

cepas no patgenas de Escherichia coli


Bacilus subtilis
Naegeria gruberi
Virus de hepatitis canina infecciosa

NIVEL DE BIOSEGURIDAD 2
7 Laboratorio de Microbiologa General

Agentes asociados con enfermedades humanas que no causan


infecciones mortales y no son transmitidos por el aire. Existe
inmunizacin o tratamiento disponible.

Virus del Sarampin


Salmonella sp.
Clostridium botulinum
Virus hepatitis B

NIVEL DE BIOSEGURIDAD 3

Trabajo con agentes exticos que tienen potencial de transmitirse


por va respiratoria y pueden causar infecciones letales en los
operadores con riesgo moderado al medio ambiente. Uso de
proteccin respiratorio obligatorio.

Mycobacterium tuberculosis
Francicsella tularensis
Coxiella burnetii
Brucella abortus
Virus de la encefalitis de San Luis
Histoplasma capsulatum

NIVEL DE BIOSEGURIDAD 4

Trabajo con agentes exticos peligrosos con un alto riesgo de


infeccin para el operador y el medio ambiente. Los agentes
patgenos que se estudian no tienen una terapia disponible y en
algunos casos se desconoces su transmisin. Todos los agentes del
nivel de bioseguridad 4 son virus.

Virus Ebola
Virus Marburg
Virus Lassa
Virus de la fiebre hemorrgica Congo-Crimea
Virus Hanzalova

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Jy, Lee, Eun Sj, Park Kd, Kim Jk, Im Js, Hwang Ys, y Kim Yi. [Biosafety of
microbiological laboratories in Korea]. Journal of preventive medicine and
public health = Yebang Uihakhoe chi 38, n.o 4 (2005 de 2005): 449-56.
8 Laboratorio de Microbiologa General

Niveles de bioseguridad en el Laboratorio Enfoque en Epidemiologa de


Campo. Accedido 9 de septiembre de 2016.
https://webcache.googleusercontent.com/search?
q=cache:QcCiXOrImgEJ:https://nciph.sph.unc.edu/focus/vol5/issue1/5-
1BiosafetyLevels_espanol.pdf+&cd=1&hl=es&ct=clnk&gl=pe.

PRACTICA N2
UTILIDAD Y PREPARACION DE
MATERIALES USADOS EN
MICROBIOLOGIA

CUESTIONARIO

1. Por qu es necesario preparar el material de vidrio antes


de hacer los cultivos?

Se necesita un medio libre de residuos que puedan


contaminar los cultivos. Primero es necesario eliminar los
restos de suciedad o residuos de infecciones del material a
9 Laboratorio de Microbiologa General

utilizar, para esto se utilizan detergentes de un pH neutro y


luego enjuagar con abundante agua potable para eliminar los
residuos de detergente, con un ltimo enguaje con agua
destilada. Ahora bien, dicho material tendr que ser
esterilizado para eliminar cualquier agente infeccioso. Todos
estos pasos aseguran que los cultivos no se vean
contaminados con hongos o esporas.

2. Por qu no se pueden usar tubos con tapones de jebe?

Porque los tapones de jebe mantienen el ambiente del


contenedor totalmente sellado. Esto nos trae diferentes
problemas; por ejemplo, es importante que el tapn no sea
muy ajustado para no tener dificultades en su manipulacin,
situacin que sucedera si se utilizara tapones de jebes. Al
mantener totalmente sellado el contenido frente al ambiente,
no se dara un intercambio de gases para el correcto
crecimiento de cultivos de bacteria aerbicas. Por esas
razones que se utilizan tapones de algodn.

3. Qu efecto tendra el algodn quemado sobre el


crecimiento de microorganismos?

La funcin de algodn es de facilitar la manipulacin del


cultivo y a su vez no permitir la contaminacin de este. Si se
utilizara algodn quemado no cumplira la funcin de ser
aislante para no contaminar el cultivo.

4. Por qu no se puede utilizar material de vidrio roto?

En el caso de material de vidrio roto, en una primera instancia


trae el problema de preparado del material, ya que al tener
restos filosos pude daar la integridad fsica del operador al
momento del lavado. El segundo problema es al momento de
esterilizacin ya que se necesita que el material este
completamente forrado para llevarse al horno o al autoclave
(segn sea el caso), los restos filosos podran daar la
envoltura del material causando que el material en cuestin
no sea esterilizado con un posible riesgo de contaminacin a
la hora de la prctica. Si se utiliza material roto al momento de
10 Laboratorio de Microbiologa General

manipular agentes patgenos existe alto riesgo de


contaminacin por un posible corte.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Medigraphic. Medica del Hospital General. Medigraphic, 1993.

PARA QUE SIRVE LOS TAPONES DE JEBE... - Brainly.lat. Consultado


el 4 de octubre de 2016. http://brainly.lat/tarea/60748.

PRACTICA N3
PREPARACION DE MEDIOS DE
CULTIVO (COMUNES Y ESPECIALES)

CUESTIONARIO

1. Cul es la razn de calentar el medio solido en


preparacin, antes de esterilizarlo?

Se caliente el medio slido hasta la ebullicin del mismo


agitando de vez en cuando, para asegurar una completa
11 Laboratorio de Microbiologa General

disolucin del agar y los componentes nutricionales. Una vez


que todos los componentes estn diluidos se procede a
esterilizarlos. Esto se hace ya que durante la preparacin del
medio de cultivo se pudo haber contaminado nuestro medio,
por lo que llevarlo a esterilizar nos asegura que en el medio
no se encuentre ningn tipo de contaminante que pueda
afectar a la muestra problema que queramos cultivar en el
medio realizado.

2. Puede usted medir y ajustar el pH a un medio caliente?


Por qu?

No es recomendable, ay que la temperatura a la cual est el


medio hace que la ionizacin de la muestra vare. Por esta
razn no se recomienda cambiar el pH cuando el medio est
caliente, ya que al momento de enfriarse, el pH que
conseguimos a dicha temperatura cambiaria. Es
recomendable que el medio este a una temperatura
ambiente para ajustar el nivel de pH.

PRACTICA N4
COLORACION GRAM Y ZIEHL
NEELSEN

RESULTADOS
12 Laboratorio de Microbiologa General

Aumento total de 1000x

Se observa la tincin Gram de un cultivo Enterobacter aerogenes,


un bacilo Gram-negativo.

Aumento
total de 1000x

Se observa la tincin Gram de un cultivo Bacillus subtilis, un bacilo


Gram-positivo
13 Laboratorio de Microbiologa General

Aumento total de 1000x

Se observa la tincin Gram de un cultivo de Escherichia coli, un


bacilo Gram-negativo

Aumento total
de 1000x

Se observa la tincin Gram de un cultivo de Staphylococcus aureus,


un coco Gram-positivo
14 Laboratorio de Microbiologa General

Aumento total de 1000x

Se observa la tincin Ziehl-Nielsen de una muestra de


Mycobacterium tuberculosis

DISCUSIN DE RESULTADOS

Con respecto a las tinciones Gram de E. coli, S. aureus, E.


aerogenes y B. subtilis; se puede observar claramente la coloracin
de la muestra fundamentada en la composicin qumica de la pared
de cada una de ellas. Esta coloracin tambin nos permite describir
la forma de la bacteria como es el caso de bacilos o cocos.

En Mycobacterium tuberculosis, que contiene una gran cantidad de


cido micolico, es necesario otro tipo de tincin, usando fucsina y
una fuente de calor, para que los lpidos dejen penetrar el colorante,
y que una vez regresado a temperatura ambiente, este no salga de
la bacteria, confirindole la denominacin de cido-alcohol
resistente. Los que tienen dicha capacidad se tien de color rojo, y
las dems bacterias se tien de azul ya que se le agrega azul de
metileno.

CUESTIONARIO

1. Afecta la edad del cultivo a la coloracin de Gram?


S, porque cultivos viejos de bacterias Gram Positivas que en
otras condiciones tienen un pared celular rica en
peptidoglucano, se va reduciendo las capas, por lo cual la
bacteria no es capaz de retener el primer colorante al tratarlo
con alcohol: acetona, liberndolo y volvindose a teir con el
colorante de contraste, pasando a ser un falso Gram Negativo.
15 Laboratorio de Microbiologa General

2. Existen diferencias qumicas que expliquen la velocidad de


decoloracin en las bacterias Gram (+) y Gram (-)?

En realidad las bacterias Gram (+) y Gram (-) pueden


decolorarse, por eso es importante el tiempo que se deja con
alcohol acetona. Cuando a una gram (-) se le agrega alcohol
acetona, este disuelve los lpidos de membrana externa que
permite la salida del colorante por esos poros. En el caso de
gram (+), por tener pared celulares ms espesas y con mayor
contenido de peptidoglucano en comparacin con la pared de
las gram (-) dificultando la penetracin de acetona pero si es
dejado un tiempo ms largo, es posible que la acetona
penetre la pared y permita la salida del colorante.

3. Qu componentes bacterianos permiten la resistencia a la


decoloracin con alcohol acido?

El peptidoglucano contiene N-glucolilmuramico en lugar de N-


acetilglucosamina, el peptidoglucano se encuentro unido al
arabinogalactano y estos a su vez a los cido micolicos,
cadenas carbonadas largas, que son las responsables de
resistir la decoloracin con alcohol-acido, despus de la
tincin con colorantes bsicos. Por lo tanto estos
microorganismos no se tien adecuadamente con los
reactivos utilizados en la coloracin de Gram y no pueden ser
clasificados como Gram positivos o negativos.

4. Qu significa BAAR y cul es su interpretacin?


16 Laboratorio de Microbiologa General

Bacterias acido alcohol resistente, cuyo representante ms


comn es Mycobacterium tuberculosis son bacterias que
resisten a la decoloracin alcohol acido por tener cantidades
considerables de cido micolico en la pared celular. Es posible
detectar este tipo de bacterias por el mtodo Ziehl-Nielsen,
que consistes en agregar el colorante en caliente tie de color
rojo a la bacteria. Al enfriar con agua, esto provoca una
solidificacin de los cidos grasos impidiendo que el colorante
salga de las bacterias, y dicho calentamiento permite que las
molculas del colorante entre a las bacterias.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Macarulla, Jos M., y Flix M. Goi. Bioqumica humana: curso


bsico. Reverte, 1994.

Microbiologa, Publicado por Profesora de. La Batalla de los


Microorganismos. Consultado el 6 de octubre de 2016.
http://microbiologiaujap2012.blogspot.com/2012/03/la-tincion-de-
gram-normal-0-21-false.html.

Tincin Gram. Scribd. Consultado el 6 de octubre de 2016.


https://es.scribd.com/doc/109668904/Tincion-Gram.
17 Laboratorio de Microbiologa General

PRACTICA N5
COLORACIONES ESPECIALES I

RESULTADOS
COLORACION DE ESPORAS

Aumento total de 1000x. Bacillus subtilis

Se observan las esporas de color verde y el resto de la bacteria de


color rojo. Incluso se evidencian algunas esporas fuera de las
bacterias.

COLORACION DE CAPSULA
18 Laboratorio de Microbiologa General

Aumento total de 1000x.


Staphylococcus aureus

Se observan las esporas de color verde y el resto de la bacteria de


color rojo. Incluso se evidencian algunas esporas fuera de las
bacterias.

COLORACION DE FLAGELO

Aumento total de 1000x.


Pseudomonas aeruginosa

Se observan los flagelos de las bacterias, tambin se pueden


observar a lo largo de todo el campo que se han desprendido de la
bacteria

COLORACION DE CORPUSCULOS METACROMATICOS


19 Laboratorio de Microbiologa General

Aumento total de 1000x. Muestra de saliva

Se observan bacilos de color azul, que poseen granulaciones de


color azul-violeta

DISCUSION DE RESULTADOS

COLORACION DE ESPORAS

El cultivo utilizado fue el de B. subtilis, especficamente un cultivo


viejo, ya que en la fase estacionario es donde las bacterias
comienzan a esporular frente a condiciones adversas como es el
caso de la baja concentracin de nutrientes en el medio. Tambin es
posible encontrar esporas fuera de las clulas ya que en estas ya ha
sucedido su lisis. Al tener las esporas bajo contenido de agua es
difcil su tincin, es por esa razn que se tie en caliente

COLORACION DE CAPSULA

La tincin de la capsulas es posible ya que los polisacridos de la


capsula, justo con otros componentes, no dejas penetrar las
partculas de tinta, por esta razn solo el medio donde se encuentra
el cultivo tiene una coloracin negra. Se tiene que hacer un juego
con el diafragma para encontrar la intensidad lumnica ptima para
poder observar el halo.

COLORACION DE FLAGELO

Se observaron los flagelos unidos a las celular y algunos se


encontraron esparcidos en el medio, esto se da porque el flagelo es
una estructura muy delgada que tiende a romperse con facilidad, se
puede ver al microscopio ptico debido al colorante. El colorante se
agrega justo con cido tnico (acta como mordiente) que tiene una
carga negativa fcilmente atrayente hacia las cargas positivas de
las protenas del flagelo, creando as capas sobre capas que
incrementan el grosor del flagelo permitiendo su observacin.
20 Laboratorio de Microbiologa General

COLORACION DE CORPUSCULOS METACROMATICOS

Se observaron granulaciones en las bacterias encontradas en una


muestra de saliva. Estas granulaciones son acumulaciones de
fosfatos insolubles en agua, tambin llamados corpsculos meta
cromticos o de votulina. Estos fosfatos son afines a colorantes
bsicos, por lo cual se usa el Azul de metileno de Loeffer (alcalino)

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Flagella Stain-Lophotrichous arrangement - Biology Forums


Gallery. Consultado el 6 de octubre de 2016. http://biology-
forums.com/index.php?
PHPSESSID=ubddj8o3je488s8pd57crushe0&action=gallery&sa=vie
w&id=18069.

MICROBIOLOGIA - Bacteriologia, Medios de cultivo y pruebas


bioquimicas. Consultado el 6 de octubre de 2016.
http://elblogdeadepi.blogspot.com/p/microbiologia-bacteriologia-
medios-de.html.
21 Laboratorio de Microbiologa General

PRACTICA N5
COLORACIONES ESPECIALES II

RESULTADOS
DEMOSTRACION DE PARED CELULAR

Se observa la pared
celular de B. sutilis. La
pared se ve engrosada en
comparacin del
citoplasma. La pared se
observa de una
coloracin azul y el
citoplasma de color
amarillo (muy tenue)

Aumento total 1000x Bacillus subtilis

COLORACION DE MEMBRANA CELULAR


Se observa la membrana
celular de B. sutilis. La
membrana se ve de un
color marrn (baja
intensidad de color), lo
ms resaltante es el color
amarillo que corresponde
al citoplasma
22 Laboratorio de Microbiologa General

Aumento total
1000x Bacillus subtilis

TINCION DE NUCLEO BACTERIANO

Se observa el nucleoide
bacteriano de B. sutilis. El
citoplasma se ve incoloro,
dentro de estas se
observa pequeas
regiones circulares de
color azul (la intensidad
es muy tenue)

Aumento total 1000x Bacillus subtilis

TINCION DE NUCLEO EN LEVADURAS

Se observa el ncleo de
Saccharomyces
cerevisiae. El ncleo se
observa con una
coloracin azul y el
citoplasma de color
rosado o lila claro
23 Laboratorio de Microbiologa General

Aumento total 1000x


Saccharomyces cerevisiae

DISCUSIN DE RESULTADOS

DEMOSTRACION DE PARED CELULAR

Para poder observar la pared celular se utiliz el mtodo de


Robinow. En el cual se agrega el fijador de Bouin (inactiva la
reactividad del citoplasma) y cristal violeta (tie tanto pared como
citoplasma ya que reacciona con peptidoglucano), el uso de ambos
crea una diferencia de colores entre la pared y el citoplasma.

COLORACION DE MEMBRANA CELULAR

Para poder observar la membrana celular se utiliz el mtodo de


Knaysi. Al igual que el mtodo anterior se utiliza el fijador Bouin
para inactivar la reactividad del citoplasma, se somete a vapores de
ter para disolver los lpidos y que entre el lugol dando una
coloracin marrn, como se vio en la prctica.

TINCION DE NUCLEO BACTERIANO

El fijador inactiva la reactividad del citoplasma, el HCl cambia la


afinidad del citoplasma por el colorante ya que est en un medio
24 Laboratorio de Microbiologa General

cido y bajo este mismo principio aumenta la afinidad del ADN por
el colorante (Giemsa)

TINCION DE NUCLEO EN LEVADURAS

Se observ el ncleo de Saccharomyces cerevisiae, para que se


pueda observar el ncleo debemos inactivar la reactividad de los
dems componente citoplasmticos o hidrolizarlos, como se realiz
en este mtodo. El KOH se utiliz para hidrolizar el citoplasma ya
que si no le agrega, no se teir el ncleo (realizamos dicha
coloracin sin KOH)

REFERNCIAS BIBLIOGRAFICAS

Afficher le sujet - Bacillus sp. Le Naturaliste. Consultado el 6 de


octubre de 2016. http://www.lenaturaliste.net/forum/viewtopic.php?
f=54&t=4590.

Bennington, James L. Diccionario enciclopdico del laboratorio


clnico. Ed. Mdica Panamericana, 2000.

Tcnicas Histolgicas. Protocolos. Atlas de Histologa Vegetal y


Animal. Consultado el 6 de octubre de 2016.
http://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/protocolos/s-fijador-
bouin.php.
25 Laboratorio de Microbiologa General

PRACTICA N6
CULTIVO DE MICROORGANISMOS
AEROBIOS

RESULTADOS Y DISCUSION

Aislamiento por el mtodo de Estriado

Se utiliz un cultivo de mix


para poder observar las
colonias de las bacterias en
dicho cultivo. Se
encontraron 3 tipos
diferentes de colonia que
se caracterizaran ms
adelante. Este mtodo se
utiliza preferentemente
para la caracterizacin de
colonias
26 Laboratorio de Microbiologa General

Aislamiento por Diseminacion

Al igual que en el aislamiento descrito anteriormente, se utiliz un


cultivo mix, a diferencia que el anterior, se utiliz la esptula de
Drigalsky. Se observ la placa opacada ya que las colonias estaban
en toda la placa lo que no permita su fcil identificacin. Uno de los
usos de dicho mtodo es para comprobar el poder antibitico de
ciertas sustancias. Encontramos crecimiento de hongos, esto
posiblemente se debe a la falta de tcnica.

Aislamiento por Difusion

Se utiliz como muestra jugo


de naranja, y se procedi a
realizar diluciones de la
5
muestra: 1/10 , 1/106.
Encontramos crecimiento
bacteriano, y tambin de
hongos es las 2 diluciones. Se
caracteriz 1 de las colonias
por este mtodo que se ver
ms adelante. Este mtodo se
utiliza para cuantificar la
cantidad de microorganismos
por ml en una muestra
problema. Este se utiliza en

CUESTIONARIO

Haga los esquemas de las colonias aisladas y la morfologa


microscpica correspondiente
27 Laboratorio de Microbiologa General

Colonia aislada
por el mtodo
Aumento total 20x de difusin.
Muestra de jugo
de naranja.
Dilucin 1/106

Tamao Textura de
Forma Borde Elevacin
(dimetro) superficies
10mm En roseta Ondulado Acojinado Plegada

Consistenci Grado de Cromogenes Caracteres


a adherencia is complementarios

Fuertemente Amarillo
Acartonada Opaco
adherente cremoso

Colonia aislada
por el mtodo
de estriado.
Muestra de un
Aumento total 20x cultivo mix
28 Laboratorio de Microbiologa General

Tamao Textura de
Forma Borde Elevacin
(dimetro) superficies
5 mm Circular Entero Convexa Granular

Consistenci Grado de Cromogenes Caracteres


a adherencia is complementarios

Dbilmente
Butirosa crema
adherente

Colonia aislada
por el mtodo
de estriado.
Muestra de un
cultivo mix

Aumento total 20x

Tamao Elevaci Textura de


Forma Borde
(dimetro) n superficies
4 mm Irregular Entero Elevado Lisa

Consistenci Grado de Caracteres


Cromogenesis
a adherencia complementarios

Rosa en el
Dbilmente
Butirosa centro y crema
adherente
en los extremos
29 Laboratorio de Microbiologa General

Colonia aislada
por el mtodo
de estriado.
Muestra de un
cultivo mix

Aumento total 20x

Tamao Elevaci Textura de


Forma Borde
(dimetro) n superficies
2 mm Circular Entero Acojinado Lisa

Consistenci Grado de Caracteres


Cromogenesis
a adherencia complementarios

Dbilmente
Butirosa Mate
adherente

Tincin Gram de la
colonia aislado. Se
observan ttradas
(coco) Gram
Positivas.

Aumento total 1000x

Colonia aislada
por el mtodo
de difusin.
Muestra de jugo
de naranja.
Dilucin 1/106
30 Laboratorio de Microbiologa General

Tamao Elevaci Textura de


Forma Borde
(dimetro) n superficies
5 mm Circular Entero Plana Lisa

Consistenci Grado de Cromogenes Caracteres


a adherencia is complementarios

Moderadamente
Mucoide Blanco Brillante en superficie
adherente

Tincin Gram de la
colonia aislado. Se
observan diplococos
Gram Negativos.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
31 Laboratorio de Microbiologa General

PRACTICA N7
NUTRICION MICROBIANA Y
DETERMINACION DE
REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES
RESULTADOS
DETERMINACION DE LOS REQUERIMIENTOS MINIMOS PARA
EL CRECIMIENTO

Superior derecho: Bacillus Superior izquierdo: Escherichia


subtilis coli

Inferior derecho: Inferior izquierdo:


Saccharomyces cerevisiae Pseudomonas aeruginosa
a) nicamente agar b) Agar + Minerales

c) Agar + Minerales + Fuente


orgnica de azcar
d) Agar + Minerales + Azcar
+ Fuente de nitrgeno
orgnico
32 Laboratorio de Microbiologa General

DETERMINACION DE LOS REQUERIMIENTOS MINIMOS PARA


EL CRECIMIENTO

a) Triptena soya agar (TSA) b) Agar mnimo de Davies

c) Agar mnimo de Davies con los grupos de aminocidos , vitaminas


o bases
33 Laboratorio de Microbiologa General

DISCUSIN DE RESULTADOS

DETERMINACION DE LOS REQUERIMIENTOS MINIMOS PARA


EL CRECIMIENTO

En la placa a, no hubo crecimiento bacteriano para ninguna de las


bacterias cultivados demostrando as que el agar es solo un agente
solidificante. En placa b y c, que tena agar + sales y agar +
sales + glucosa respectivamente. Se observ crecimiento residual
que se debe al caldo en donde antes se encontraba y un nmero
limitado de los nutrientes que las bacterias necesitan, esto permiti
34 Laboratorio de Microbiologa General

que creciera un nmero de colonias reducido en comparacin a


cultivos hechos es medios completos. En la placa d, que tena
todo lo antes mencionado con adicin de peptona (lisis con
pepsina), se encontr un gran crecimiento proporcional ya que
contena todos los requerimientos nutricionales. Solo no se encontr
crecimiento en E. coli, esto se debe a que al momento de sembrar
las otras bacterias nos olvidamos de sembrar E. coli.

DETERMINACION DE LOS REQUERIMIENTOS MINIMOS PARA


1 2 3 4 5

6 ADENINA GUANINA CISTEINA METIONINA TIMINA

7 HISTIDINA LEUCINA ISOLEUCINA VALINA LISINA

FENILALANIN TRIPTOFAN
8 A SERINA O TREONINA PROLINA

9 GLUTAMICO TIROSINA ALANINA ASPARTICO ARGININA

EL CRECIMIENTO

Para realizar este test auxonogrfico se us un cultivo de P.


aeuroginosa que previamente se haba expuesto a radiacin UV. El
objetivo era encontrar la ruta metablica que fue afectada por una
posible mutacin que se produjo por la exposicin a UV. En las
placas 3,4,7,8,9 no se evidencio crecimiento bacteriano, aunque
hubo problemas en evidenciar lo dicho antes porque en las placas
7,8 y 4 se encontr crecimiento pero no era bacteriano, sino de un
hongo. Estas placas contenan agar mnimo de Davies (medio que
contiene sales, fuente de azcar orgnico y una fuente de nitrgeno
inorgnico) y un grupo de aminocidos y bases. Que no haya
ocurrido crecimiento en ninguna de estas placas indica que la
mutacin no haya ocurrido en una ruta metablica en la que est
implicado cualquiera de los aminocidos y/o bases incluidos en el
medio. En las placas 2 y 6, se encontr crecimiento bacteriano. En
estas 2 placas la base en comn es Guanina. Este resultado indica
que la mutacin inducida por UV, afecta la ruta metablica
implicada en la sntesis de guanina (biosntesis de nucletidos
35 Laboratorio de Microbiologa General

puricos), por lo cual este cultivo de bacterias no tiene la capacidad


para producirla, por lo que solo podr crecer en un medio que
contenga lo que necesita.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Davis Minimal Agar for microbiology | Sigma-Aldrich. Consultado el


3 de octubre de 2016.
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/79332?
lang=en&region=PE.

Garibay, Mariano Garca, Rodolfo Quintero Ramrez, y Agustn Lpez-


Mungua Canales. Biotecnologa alimentaria. Editorial Limusa, 1993.

Stanier, Roger Y., y Julio R. Villanueva. Microbiologa. Reverte, 1996.


36 Laboratorio de Microbiologa General

PRACTICA N8
ENNUMERACION DE
MICROORGANISMOS

RESULTADOS
RECUENTO POR EL METODO DE LAS PLACAS

Muestra problema de agua


potable

a) 1/10, 1/100, 1/1000

b) 1/10000 = Dilucin 10-4

c) 1/100000 = Dilucin 10-5


37 Laboratorio de Microbiologa General

d) 1/1000000 = Dilucin 10-6


CONTEO DIRECTO

Zona
contada

Cultivo de
Pseudomo
nas

4
m. o . de bacterias factor de dilucion a 10
Numero de =
ml N de cuadros contados

Dnde:

a=25 si se cuentan los 25 cuadrados, b=400 si se cuentan los


cuadrados ms pequeos

m. o . 800 1 25 10 4
Nume ro de =
ml 1

m. o . 800 1 25 104
Numero de = =210 8
ml 1

METODOS TURBIDIMETRICOS

Cultivo de Pseudomonas aeruginosa


equivalente al tubo 6 de la escala
=2,272 x 109 m.o. /ml

E. Coli equivalente al tubo 3 = 1,136 x


109 m.o. /ml

Bacillus subtilis equivalente al tubo 3


= 9 x 108 m.o. /ml

Cultivo de Pseudomonas aeruginosa


RECUENTOS POR EL METODO DEL NUMERO MS
PROBABLE

Dilucin 1/10: En los 3 tubos se encontr sedimento

Dilucin 1/100: Se encontr sedimento en 1 tubo

Dilucin 1/1000: Se encontr sedimento en 1 tubo

DISCUSIN DE RESULTADOS

RECUENTO POR EL METODO DE LAS PLACAS

Como era de esperarse en las diluciones de 1/10 a 1/10000, la


concentracin era muy alta, por lo que no era posible distinguir
entre cada colonia. En las diluciones 1/105 y 1/106 se identifican
colonias individuales, pero existen ms de 300 colonias por lo tanto
no se debe contar dichas placas. Esto se debe a que si se excede
este nmero el recuento dar cifras ms bajas a causa del
antagonismo bacteriano; es la inhibicin, deterioro o muerte de un
microorganismo por accin de otro.
CONTEO DIRECTO

El cultivo utilizado fue de Pseudomonas aeruginosa, se coloca un


poco en la cmara de Neubauer (0.1 mm 3). El resultado encontrado
fue de 2x108 m.o. /ml. Una cantidad que guarda relacin al hecho de
que el cultivo utilizado no fue diluido. Este mtodo es muy utilizado
debido a que se realiza en tiempo real. Como hemos podido
observar en prctica, uno de sus factores en contra es que el ojo se
cansa debido a que la bacteria est en constante movimiento.

METODOS TURBIDIMETRICOS

En este mtodo se obtuve el resultado de 2,272 x 10 9 m.o. /ml


utilizando la escala de McFarland, estndares creados al mezclar
soluciones de cido sulfrico y cloruro de bario al 1% en distintos
volmenes, para su uso se puede verificar la densidad del estndar
con un espectrofotmetro y previa utilizacin se tiene que
uniformizar la solucin. El resultado que se encontr usando este
mtodo es mucho mayor en comparacin con el cultivo anterior
(conteo directo), esto se puede deber que al usar solo la turbidez de
un cultivo no se distingue entre las bacterias vivas y las muertas,
creando as un margen de error grande, que puede ser de menor
cantidad si se utiliza un cultivo joven comparndolo con un cultivo
viejo.

RECUENTOS POR EL METODO DEL NUMERO MS


PROBABLE

Se utiliz diluciones de un cultivo que contena petrleo en su


medio. Utilizando 3 diluciones por triplicado y con ayuda de la tabla
del NMP, se encontr una densidad poblacional de 700 m.o. / ml
Para indicar que ha habido crecimiento o no se observa el
sedimento. Esta tcnica se basa en la determinacin de presencia o
ausencia (pos o neg) en rplicas de diluciones consecutivas de
atributos particulares de microorganismos presentes en muestras de
suelo u otros ambientes para poder reconocer un atributo particular
de la poblacin en el medio de crecimiento a utilizarse. En este caso
si puede utilizar el petrleo como fuente de carbono, degradndolo.

CUESTIONARIO
1. Cul de los mtodos de enumeracin le parece el ms
exacto?

Cada uno de los mtodos tiene sus pros y contras, y tambin


utilizado para distintos casos, como en el caso de mtodo del
Nmero ms probable, ya que se utiliza para poder reconocer
un atributo especial en la muestra. En el caso de muestras
problemas, el mtodo ms exacto es el de conteo directo, ya
que puedes conocer la densidad poblacional en tiempo real,
discriminar entre las muertas y vivas (movimiento), en
comparacin con las otros mtodos.

2. En qu casos se emplea la Escala McFarland?

Para utilizar la escala de McFarland se tiene que tener un


cultivo puro ya que si utilizramos una muestra problema
donde no hemos identificado las bacterias, el nivel de
translucidad de cada una afectara a la lectura. Otro factor
importante al momento de usar la escala de McFarland aun
cuando se usa un cultivo puro, es que este tiene que ser
joven, ya que si se utiliza un cultivo viejo, se encontrara un
mayor nmero de clulas muertas que interferirn con el nivel
de turbidez de la muestra aumentndola.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Cona T., Erna. Condiciones para un buen estudio de susceptibilidad


mediante test de difusin en agar. Revista chilena de infectologa
19 (2002): 7781. doi:10.4067/S0716-10182002019200001.

Prez, Roco, Thania S. Terrn, y Jess Muoz-Rojas. Antagonismo


microbiano asociado a cepas bacterianas provenientes de jitomate
(Lycopersicum esculentum Mill) y maz (Zea Mays). Revista
Iberoamericana dde Ciencias, 2014.
https://www.researchgate.net/profile/Jesus_Munoz-
Rojas/publication/277776563_Antagonismo_microbiano_asociado_a_
cepas_bacterianas_provenientes_de_jitomate_Lycopersicum_esculen
tum_Mill_y_maiz_Zea_Mays/links/5573aeea08aeacff1ffca483.pdf.