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COMPTE-RENDU DE TP MGG
Plasmides et PCR

I) Extraction de lADN Plasmidique et carte de restriction

1) But et principe du TP :

But: tablir la carte de restriction de deux plasmides recombinants contenant un

Insert et en tirer des conclusions sur le sens dinsertion du fragment .
Principe: extraction et purification de l'ADN plasmidique partir de bactries
transformes par ces plasmides. Puis digestion de ces ADNs par 3 enzymes
de restriction diffrentes; sparation des fragments obtenus sur gel d'agarose
pour en dterminer la taille en comparant une courbe standard tablie avec
des fragments de taille connue.

2) Expliquer brivement le rle des diffrentes tapes

1re centrifugation: rcuprer les bactries en culot et liminer le milieu de

croissance
Tampon A: resuspendre les bactries dans un tampon neutre (TrispH 7,5) qui
contient de l'EDTA (chlateur des ions divalents) qui va fragiliser les
membranes bactriennes) et RNase (dtruit l'ARN bactrien)
Tampon B: lyse des bactries grce au pH alcalin de la soude et au dtergent
(SDS) qui dnature les protines. En plus la soude dnature l'ADN bactrien et
gnomique.
Actate de potassium: permet de revenir un pH neutre, ce qui entrane la
prcipitation des protines et de l'ADN gnomique (non renatur); l'ADN
plasmidique reste en suspension car il est renatur (petit et circulaire).
Isopropanol: en prsence des sels contenus dans les solutions, l'isopropanol va
faire prcipiter l'ADN
Ethanol 70%: permet de remettre les sels en suspension qui pourraient gner
les tapes ultrieures
Eau: resuspension de l'ADN une concentration choisie
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II) Digestion de lADN et analyse sur gel

1) Dcrire brivement les tapes et leur rle

Digestion par les enzymes de restriction: permet de digrer l'ADN des sites
spcifiques et d'obtenir des fragments de diffrentes tailles. Pour cela on
prpare 6 tubes, 3 pour chaque plasmide. Dans chacun de ces tubes on
dposera lADN plasmidique pI ou pII, le tampon adquat lenzyme de
restriction, de la BSA qui protge lactivit enzymatique et lenzyme choisie.
Dans 2 autres tubes on dpose lADN avec de leau ; ces tubes serviront de
contrle et donneront des informations sur la quantit etla qualite des ADNs
plasmidiques ltat natif. Les tubes sont ensuite mis pendant la nuit 37C,
temprature dactivit optimale des enzymes de restriction choisies
Gel d'agarose: permet de sparer les fragments d'ADN selon leur taille car ils
migrent dans un champ lectrique grce la charge porte par les phosphates.
Bromure d'thidium: agent mis dans le gel, qui s'intercale entre les bases
d'ADN et qui en fluorescant aux UV permet de visualiser les fragments d'ADN
Bleu/glycrol: le glycrol ajout aux chantillons permet d'alourdir l'ADN pour
qu'il tombe au fond des puits; le bleu, qui selon le % d'agarose reprsente une
taille prcise permet de suivre la migration et d'arrter la migration au bon
moment.
Marqueur de taille: fragments d'ADN de taille connue qui permettent d'tablir
une courbe de rfrence de migration en fonction de la taille.

2) Interprtation
a) photo du gel :
coller la photo et ne pas oublier de la lgender

b) analyse

- courbe talon sur papier semi-log; les Kb sur lchelle log, la distance de
migration sur l'chelle normale. .

- En dduire la taille des diffrents fragments obtenus :

- SacI: on obtient les 2 mmes fragments pour pI et pII, il y a donc 2 sites de

restriction. La ligation de l'insert s'tant faite dans le site SacI du polylinker, un
des fragments (environ 2,9 Kb)reprsente le plasmide, l'autre (environ 1,9 Kb)
l'insert.
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- PstI: pour PI, on obtient 3 fragments; sachant qu'il en existe 1 dans le

polylinker, les 2 autres sont sur l'insert. Le grand fragment (3,1 Kb) comprend le
plasmide et un morceau d'insert (environ 0,25 Kb). On peut donc placer un 1er
site 0,25 Kb d'un site SacI. Celui de 1,1 Kb qui est commun aux digestions
PstI de PI et PII se trouve au milieu de l'insert et le 3 me (0,65 Kb) se trouve de
l'autre ct, du ct polylinker; pour PII, en raisonnant de la mme faon on
dtermine que l'insert est orient dans le sens inverse
- KpnI: pour pI et pII on obtient 2 fragments donc il existe 2 sites, l'un dans le
polylinker , l'autre dans l'insert. Pour PI, le grand fragment d'environ 3,6 Kb
comprend le plasmide et un fragment d'insert d environ (0,7Kb). On peut donc
placer le site dans l'insert 0,7Kb d'un site SacI. La digestion de ce site et de
celui du polylinker libre un fragment de 1,2 Kb. Pour pII, l'insert est orient en
sens inverse librant un fragment de 0,7 Kb et un fragment de 2,9 + 1,2 Kb -
les plasmides pI et pII reprsentent deux plasmides contenant le mme insert
clon dans un sens ou dans lautre

4)Critiques des rsultats:

Critiques sur la photo donne: traines dans le haut du gel qui peuvent tre
dues une contamination d'ADN gnomique.
Mauvaise rsolution de certains des fragments du standard (haut PM) , ce qui
donne des approximations grossires de la taille des fragments digrs. Ceci
explique les diffrences de taille observes parfois dans la somme des
fragments.
Mauvaise digestion : explications ? ? ? ? ?

II- Analyse de lADN par PCR

1) analyse de la PCR :

Photo du gel: avec la lgende

2) interprtation des rsultats;

Pour le plasmide PI, on a une amplification avec les amorces GP1 et Re qui
sont donc des amorces se trouvant sur lun et lautre brin et en sens opposs.
Comme lamplification GP1/Re donne un fragment de 1,4 Kb et que le fragment
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entier mesure 2 Kb, il reste donc 0,6 Kb entre GP1 et lautre extrmit de
linsert.
De mme pour le plasmide PII, lamplification GP2/Re donne un fragment de
0,9Kb ce qui montre que GP2 et Re sont sur 2 brins diffrents et en orientation
opposes. Le fragment restant est donc de 1,1 Kb
On peut donc reprsenter le schma final

b) lamplification GP1-GP2 donnerait le mme fragment de 300 paires de

bases avec pI ou pII

c) ces rsultats confirment bien que linsert est intgr en sens oppos
dans les plasmides 1 et 2.

3) Critiques des rsultats

Pas damplification, pourquoi ?
Contamination : pourquoi ??