Facultad de Ingeniera y Ciencias Agropecuarias (FICA)

IBT504 - Procedimientos de Biologa Molecular

GUA PARA PRCTICAS DE

LABORATORIO

Ingeniera en Biotecnologa

Facultad de Ingeniera y Ciencias Agropecuarias| Gua para Prcticas de Laboratorio 1

Facultad de Ingeniera y Ciencias Agropecuarias (FICA)

Presentacin

La presente Gua para Prcticas de Laboratorio ha sido desarrollada para que los
estudiantes de la asignatura de Procedimientos de Biologa Molecular dispongan
de la informacin necesaria para la realizacin de las prcticas correspondientes
de acuerdo a los temas, objetivos y resultados de aprendizaje definidos. En este
documento se incluye el proceso en el laboratorio de experimentacin e
investigacin, con los respectivos recursos y resultados esperados, para que el
estudiante pueda desarrollar su prctica-taller y la elaboracin de sus respectivos
informes o cualquier otra evidencia de aprendizaje, que sern evaluadas con las
rbricas que constan en los anexos.

La Gua presenta una secuencia donde se especifica cada sesin de prcticas en

laboratorio con su respectivo proceso didctico y formativo.

Facultad de Ingeniera y Ciencias Agropecuarias| Gua para Prcticas de Laboratorio 2

 Facultad de Ingeniera y Ciencias Agropecuarias (FICA)

ASIGNATURA: Procedimientos SIGLA: IBT504 PARALELO: PERIODO:

de Biologa 2015-1
Molecular

Fecha: PRCTICA SESIONES: 3

28/08/2014 No: 1a TEMA: Extraccin de DNA.

1.- OBJETIVO

- Conocer los principios bsicos de diseo y funcionamiento de un laboratorio de biologa

molecular y as como las tcnicas bsicas para la extraccin de ADN.

2.- RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPERADOS

Adquirirs las siguientes habilidades:

1. Utiliza las tcnicas ms comunes en biologa molecular, con sus variaciones e

innovaciones.
2. Reconoce en el laboratorio herramientas y principios de la biologa molecular para el
anlisis de los organismos.

Y se detallan los resultados o productos esperados de la prctica

3.- MATERIALES/RECURSOS Y EQUIPOS

Materiales:

- Jeringuillas de 5 ml con agujas o Tubo vacutainer con cpsula

- Microtubos de 1,5 mL
- Cajas con puntas de 10, 100 y 1000 uL
- Caja para microtubos de 1,5-2 mL
- Marcador de punta fina
- Guantes de Nitrilo

Facultad de Ingeniera y Ciencias Agropecuarias| Gua para Prcticas de Laboratorio 3

Facultad de Ingeniera y Ciencias Agropecuarias (FICA)

Reactivos

- Kit de Extraccin de DNA genmico Purelink (Invitrogen)

- Etanol absoluto (96-100%)
- Lisozima

Equipos

- Juego de Micropipetas
- Termobloque
- Incubadora
- Microcentrfuga
- Congelador -20C
- Vortex

Fuente de DNA:

- Sangre humana fresca

- Cultivo en crecimiento de Bacillus sp.

4.- METODOLOGA

Antes de empezar:

- Diluir las soluciones de lavado Wash 1 y Wash 2 con etanol absoluto de acuerdo a las
especificaciones del envase (Preparado por el profesor)

Sangre Humana Fresca

- Preparacin del Lisato

o Precalentar el termobloque a 55C
o Aadir 200 uL de sangre fresca a un microtubo de 1.5 mL
o Aadir 20 uL de proteinasa K y 20 uL de RNAsa A (suplementadas en el kit) a la muestra,
mezclar bien por vortex e incubar a temperatura ambiente por 2 minutos
o Aadir 200 uL de la Buffer de Lisis (PureLink Genomic Lysis/Binding Buffer) y mezclar
bien por vrtex hasta obtener una mezcla homognea
o Incubar a 55C por 10 minutos para promover la digestin proteica
o Aadir 200 uL de etanol absoluto (96-100%) al lisato. Mezclar bien por vrtex por 5
segundos hasta obtener una solucin homognea
o Colocar el lisato (aproximadamente 640 uL) en una columna de purificacin (PureLink
Spin Column).
o Centrifugar la columna a 10000 x g por 1 minuto

Facultad de Ingeniera y Ciencias Agropecuarias| Gua para Prcticas de Laboratorio 4

Facultad de Ingeniera y Ciencias Agropecuarias (FICA)
o Descartar el Collection tube y colocar la columna sobre un nuevo Collection tube
o Aadir 500 uL de Solucin de lavado Wash 1 preparada con etanol sobre la columna y
centrifugar la columna a 10000 x g por 1 minuto
o Descartar el Collection tube y colocar la columna sobre un nuevo Collection tube
o Aadir 500 uL de Solucin de lavado Wash 2 preparada con etanol sobre la columna y
centrifugar la columna a mxima velocidad por 3 minutos.
o Descartar el Collection tube y colocar la columna sobre un microtubo de 1.5 mL nuevo
o Aadir de 100 uL de buffer de elucin (PureLink Genomic Elution Buffer) sobre la
columna, incubar a temperatura ambiente por un minuto
o Centrifugar a mxima velocidad durante un minuto
o Tomar la solucin del tubo y colocarla nuevamente en la columna. Centrifugar
nuevamente a mxima velocidad por otro minuto
o El tubo contiene el DNA purificado. Descartar la columna de purificacin
o Almacenar el DNA a 4C hasta su uso o a -20C para almacenamiento largo perodo.

Cultivo en crecimiento de Bacillus sp.

Preparacin del Solucin lisozima.

Preparar 1ml de solucin lisozima (20mg lisozima/1ml buffer lisozima)

Extraccin de DNA.

1. Precalentarlos dos termobloque a 55C y 37C

2. Colocar 1 ml de agua en una placa de Bacillus subtilis y raspar levemente alrededor de la
placa con un tringulo de siembra.
3. Colocar el 1ml de agua con la bacteria en un tubo eppendorf de 1.5 ml.
4. Centrifugar a 10.000rpm por 1 min.
5. Resuspender el pellet en 180 ul de solucin lisozima y mezclar bien por voxter.
6. Incubar a 37 C durante 30 min.
7. Anadir 20 ul de Proteinasa K y mezclar por vortex.
8. Aadir 200ul de Genomic lysis/ Binfing y mezclar bien por vortex.
9. Aadir 200ul de etanol absoluto y mezclar bien por voxter.
10. Colocar el lisato en una columna de purificacin (PureLink SpinColumn).
11. Centrifugar la columna a 10.000g durante 1 min.
12. Descartar el Collection tube y colocar la columna sobre un nuevo Collection tube.
13. Aadir 500ul de Solucion Wash 1 y centrifugar a 10.000g durante 1min.
14. Descartar el Collection tube y colocar la columna sobre un nuevo Collection tube.
15. Aadir 500ul de Solucion Wash 2 y centrifugar a Mxima velocidad g durante 3min.
16. Descartar el Collection tube y colocar la columna sobre un tubo eppendorf de 1.5 ml.
17. Aadir 100ul de buffer de elucin dentro de la columna e incubar durante 1 min a
Temperatura Ambiente.
18. Centrifugar la columna a mxima velocidad durante 1 min.

Facultad de Ingeniera y Ciencias Agropecuarias| Gua para Prcticas de Laboratorio 5

Facultad de Ingeniera y Ciencias Agropecuarias (FICA)
19. El tubo contiene el DNA purificado. Descartar la columna de purificacin
20. Tomar la solucin del tubo y colocarlo nuevamente dentro de la columna y centrifugar a
velocidad mxima durante un 1 min.
21. Descartar la Columna de purificacin y rotular el tubo de DNA purificado.
22. Almacenar el tubo de DNA a -20C.

5.- ACTIVIDAD FORMATIVA

Prerrequisitos (Antes de comenzar este ejercicio, debers dominar lo siguiente:)

- Manejo bsico de equipo e insumos de laboratorio (Aprobar el examen de conocimientos

previos)
- Fundamentos tericos de las caractersticas fsico-qumicas de los cidos nucleicos

Descripcin de la actividad:
Extraccin de DNA genmico de dos fuentes diferentes: Sangre humana y bacterias

6.- REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Green M.R. and Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.), Three-
volume set. New York. U.S.A.: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Life sciences, (2007), Inv Purelink Genomic DNA Kits. User Manual.

7.- MECANISMO DE EVALUACIN Y ANEXOS

Facultad de Ingeniera y Ciencias Agropecuarias| Gua para Prcticas de Laboratorio 6

 Facultad de Ingeniera y Ciencias Agropecuarias (FICA)

ASIGNATURA: Procedimientos SIGLA: IBT504 PARALELO: PERIODO:

de Biologa 2015-1
Molecular

Fecha: PRCTICA SESIONES: 3

13/08/2014 No: 1b TEMA: Cuantificacin de DNA

1.- OBJETIVO

- Aprender las tcnicas bsicas para la cuantificacin de ADN usando diversas tcnicas
disponibles.

2.- RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPERADOS

Adquirirs las siguientes habilidades:

1. Utiliza las tcnicas ms comunes en biologa molecular, con sus variaciones e

innovaciones.
2. Reconoce en el laboratorio herramientas y principios de la biologa molecular para el
anlisis de los organismos.

Y se detallan los resultados o productos esperados de la prctica

3.- MATERIALES/RECURSOS Y EQUIPOS

- Microtubos de 1.5 mL
- Caja para microtubos de 0.2 mL
- Marcador de punta fina
- Tubos Qubit
- Cajas con puntas de 10, 100 y 1000 uL
- Microtubos de 1,5 mL

Reactivos:

- ADN obtenido de la extraccin anterior

- Kit Qubit para cuantificacin

Facultad de Ingeniera y Ciencias Agropecuarias| Gua para Prcticas de Laboratorio 7

Facultad de Ingeniera y Ciencias Agropecuarias (FICA)
Equipos:

- Juego de Micropipetas
- Fluormetro Qubit

4.- METODOLOGA

Cuantificacin por fluorometra usando el Kit Qubit dsDNA BR Assay

- Definir el nmero de muestras a cuantificarse incluidos los estndares. El kit utiliza dos
estndares para la cuantificacin. Etiquetar los tubos Qubit
- Preparar la solucin de trabajo diluyendo el reactivo Qubit dsDNA BR reagent 1:200 en la
Buffer Qubit. El volumen de mezcla para cada muestra debe ser 200 uL. El volumen de
mezcla para cada uno de los estndares son 190 uL de mezcla y 10 de estndar. El
volumen para cada muestra puede ir de 180 uL a 199 uL dependiendo de la cantidad de
DNA que supone que tenga. Calcular precisamente el volumen demuestra
- Colocar 190 uL de la solucin de trabajo en los tubos etiquetados como estndares. Aadir
10 uL de cada estndar en los tubos etiquetados para ello hasta completar 200 uL de
volumen total. Agitar 2 o 3 segundos en el vrtex
- Colocar de 180 a 199 uL de la solucin de trabajo en los tubos etiquetados para las
muestras y colocar entre de 20 a 1 uL de la muestra de DNA extrado hasta completar un
volumen total de 200 uL. Agitar 2 o 3 segundos en el vrtex
- Incubar los tubos a temperatura ambiente por 2 minutos
- En la pantalla del Fluormetro Qubit, seleccionar dsDNA BR como tipo de ensayo. En la
pantalla estndar, escogemos Nueva Calibracin
- Insertar el estndar 1 y presionar Read, cuando solicite el estndar 2, insertar el
estndar 2 y presionar Read.
- Una vez que este calibrado, colocar cada una de las muestras y presionar Read. Repetir 2
veces la lectura de las muestras para determinar si efectivamente los valores se
mantienen. Promediar las tres lecturas para obtener una concetracin estndar.
- Calcular la concentracin de los stocks con la siguiente frmula.

[CADN]= Valor Qubit (200/X)

Valor Qubit es el valor de concentracin que entrega el Fluormetro

X = microlitros aadidos al tubo de ensayo.

5.- ACTIVIDAD FORMATIVA

Prerrequisitos (Antes de comenzar este ejercicio, debers dominar lo siguiente:)

Facultad de Ingeniera y Ciencias Agropecuarias| Gua para Prcticas de Laboratorio 8

Facultad de Ingeniera y Ciencias Agropecuarias (FICA)

- Manejo bsico de equipo e insumos de laboratorio

- Fundamentos tericos de las caractersticas fsico-qumicas de los cidos nucleicos
Descripcin de la actividad:
Cuantificacin de DNA

Facultad de Ingeniera y Ciencias Agropecuarias| Gua para Prcticas de Laboratorio 9

Facultad de Ingeniera y Ciencias Agropecuarias (FICA)

ASIGNATURA: Procedimientos SIGLA: IBT504 PARALELO: PERIODO:

de Biologa 2015-1
Molecular

Fecha: PRCTICA SESIONES: 4 TEMA: Electroforesis de DNA

13/08/2014 No: 1c

1.- OBJETIVO

- Aprender las tcnica de electroforesis de DNA y su aplicacin en varios contextos

2.- RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPERADOS

Adquirirs las siguientes habilidades:

1. Ejecuta con destreza diversas tcnicas moleculares mediante el desarrollo de prcticas de

laboratorio.

Y se detallan los resultados o productos esperados de la prctica

3.- MATERIALES/RECURSOS Y EQUIPOS

Materiales:

- Piseta de Agua Destilada

- Parafilm
- Cajas con puntas de 10, 100 y 1000 uL
- Cartulina negra

Reactivos

- Agarosa
- Agua Destilada
- Tris-HCl
- cido Brico
- Na2EDTA
- SYBR Green
- DNA obtenido previamente
- Track-it

Facultad de Ingeniera y Ciencias Agropecuarias| Gua para Prcticas de Laboratorio 10

Facultad de Ingeniera y Ciencias Agropecuarias (FICA)
- Buffer de Carga

Equipos

- Cmara de Electroforesis
- Juegos de Micropipetas

4.- METODOLOGA

1) Preparar un gel de agarosa al 1% p/v en buffer TBE 1X. Fundir la agarosa en el microondas y
agitar hasta que se enfre.
2) Una vez que alcance una temperatura de unos 60 grados, aadir 1 uL de SYBR Safe por cada
100 mL de gel. Agitar hasta que se homogenice la muestra.
3) Dispensar el gel lquido con el SYBR Safe en la cmara de electroforesis y colocar los peines
en el extremo superior. Esperar a que se solidifique y retirar los peines
4) Llenar con TBE 1X la cmara de electroforesis con el gel incluido hasta cubrir completamente
el gel con el Buffer.
5) Preparar la muestra a cargarse con 8 uL de DNA y 2 uL de buffer de carga 6X, colocar con la
micropipeta en cada pocillo, empezando por el track it en el primer carril y continuar as hasta
cargar todas las muestras. Procurar que la muestra de ADN caiga en el pocillo y no fuera de
el. Verificar que no se rompa el pocillo con la punta.
6) Conectar la fuente de poder y correr la electroforesis a 100 voltios durante 30 minutos
7) Visualizar el gel bajo la luz UV del transiluminador. Fotodocumentar

5.- ACTIVIDAD FORMATIVA

Prerrequisitos (Antes de comenzar este ejercicio, debers dominar lo siguiente:)

- Manejo bsico de equipo e insumos de laboratorio

- Fundamentos tericos de las caractersticas fsico-qumicas de los cidos nucleicos

Descripcin de la actividad:
Electroforesis de DNA

6.- REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Green M.R. and Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.), Three-
volume set. New York. U.S.A.: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Life sciences, (2007), Qubit dsDNA BR Assay Kits. User Manual.

Facultad de Ingeniera y Ciencias Agropecuarias| Gua para Prcticas de Laboratorio 11