Prctica N3: Tcnicas de Aislamiento de cidos Nucleicos:

Aislamiento de ADN plasmdico

Otro de los mtodos importantes en Biologa Molecular es el aislamiento de ADN

plasmdico. Los plsmidos son molculas pequeas de ADN circular capaces de
replicarse de forma autnoma, independientemente del cromosoma. Son muy comunes
en bacterias y algunos de ellos, los ms pequeos, existen en las clulas bacterianas en
un nmero elevado (hasta 100 copias por clula). Los plsmidos son una herramienta
fundamental en Biologa Molecular e Ingeniera Gentica ya que se pueden usar como
vectores para introducir en ellos cualquier fragmento de ADN de inters y de as
amplificarlo de forma natural dentro de la bacteria en la que el plsmido se replica (es lo
que se llama clonar un fragmento de ADN). Existen muchos plsmidos disponibles
para usar con este fin y la mayora contienen al menos los siguientes elementos:
Un origen de replicacin autnomo para E. coli (ejm. ColE1) que permite la
replicacin autnoma en esta bacteria.
Un gen que confiere a la bacteria portadora del plsmido resistencia a algn
antibitico, generalmente ampicilina.
Un sitio de clonacin mltiple en el que se encuentra dianas nicas para varias
enzimas de restriccin y que permite la introduccin del ADN a clonar.
Objetivos:
1. Obtener ADN plasmdico de una clula procariota, Escherichia coli.
2. Comparar el procedimiento de extraccin de ADN plasmdico con los de
extraccin de ADN genmico.
3. Determinar las principales diferencias entre procedimientos.
Teora:
El uso y propagacin de los vectores plasmdicos depende en gran medida de
saber aislar el ADN plasmdico, transformar las cepas receptoras y mantenerlas. El
mtodo ms difundido para extraer ADN plasmdico de E. coli es el de lisis alcalina
(Sambrook y col, 1989). A continuacin se describe el mtodo propuesto por Saunders y
Burke (1990) y con las recomendaciones de Brischbach (1993)
En este mtodo de lisis alcalina se separa el ADN plasmdico del ADN
cromosmico debido a que el ADN se desnaturaliza con NaOH. Si el ADN es lineal, sus
hebras se separan lejos unas de otras. Por el contrario, la mayora de plsmidos son
circulares covalentemente cerrados (cccADN) por lo que, durante la desnaturalizacin,
las hebras no se alejan entre s, de tal modo que al llevar el pH a 5.2 con Acetato de
Potasio, solo las molculas de los plsmidos se renaturalizan rpidamente, teniendo una
solubilidad distinta al ADN no renaturalizado (ADN genmico)
Materiales y Reactivos:
1. Cepa de E. coli con plsmidos
2. Medio LB
3. Ampicilina
4. Solucin I: (Glucosa, EDTA, Tris HCl pH 8)
5. Solucin II: (NaOH, SDS)
6. Solucin III: (Acetato de Potasio, cido actico glacial)
7. Isopropanol
8. Etanol 70%
9. Buffer TE
Procedimiento
1. Cultivar por 12 horas la cepa de E. coli en 5 ml de medio LB con ampicilina
(concentracin final 50ug/ml) a 37C con agitacin.
2. En el caso del plsmido pBR22 y derivados, despus de 10 horas de cultivo aadir en
forma estril cloranfenicol hasta la concentracin final de 75 ug/ml y prolongar el
cultivo 3 horas ms.
3. Colectar las clulas por centrifugacin por 10 minutos a 2500 rpm o separar el cultivo
en tubos Eppendorf (1.5 ml) y centrifugar en microcentrfuga 1 minuto a 12000 rpm
4. Resuspender las clulas en 200 ul de solucin I (por cada 2.5 ml de cultivo)
Solucin I: 0.5 ml de glucosa 1M
0.2 ml de EDTA 0.5M
0.25 ml Tris HCl pH 8 1M
1.05ml de agua ultra pura
5. Aadir a cada tubo 400 ul de la solucin II recientemente preparada y agitar por
inversin 5 veces, no utilizar el vrtex. Colocar los tubos en hielo.
Solucin II: 0.08 g de NaOH
9 ml de agua ultrapura
1ml de SDS al 10%
6. Aadir 300 ul de la solucin III fra, mezclar por inversin 5 veces. Dejar por 20
minutos a -4C
Solucin III: 2.945 g de Acetato de Potasio
5 ml de agua ultrapura
1.15 ml cido actico glacial
3.85 ml agua ultrapura
7. Centrifugar a 12000 rpm por 5 minutos. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo.
8. Aadir al sobrenadante 600 ul de Isopropanol, agitar y dejar 2 minutos a temperatura
ambiente. Centrifugar por 15 minutos, eliminar parte del sobrenadante y dejar secar
el sedimento.
9. Resuspender el sedimento en 100 ul de buffer TE y aadir igual volumen de LiCl 5M,
agitar y dejar a -20C durante 20 minutos. Centrifugar durante 5 minutos y trasladar
 el sobrenadante a un nuevo tubo.
10. Agregar 0.1 volmenes de acetato de sodio 3M pH 5.2 y luego aadir 2.5 volmenes
de etanol absoluto frio. Dejar a -20C durante 30 minutos.
11. Centrifugar por 15 minutos y eliminar el sobrenadante con cuidado y secar el
sedimento.
Los pasos 9, 10,11 y 15 no se realizarn en esta prctica
12. Lavar el sedimento con 1 ml de etanol al 70% helado.
13. Centrifugar por 5 minutos y remover el sobrenadante. Mucho cuidado aqu, es
muy fcil perder el sedimento!. Dejar secar el sedimento.
14. Resuspender el sedimento en 50 ul de buffer TE.
15. Adicionar 1 ul de ARNasa.
Recomendaciones
Para obtener un buen rendimiento es necesario asegurarse de resuspender
completamente todo el sedimento con la solucin I, si es posible utilizando un vrtex de
lo contrario solo se destruirn las clulas resuspendidas, perdiendo material.
El mayor problema que se tiene es que durante la lisis alcalina se libera no solo
ADN plasmdico sino tambin genmico, pues ambos estn en el citoplasma bacteriano.
Por ello, en la etapa de lisis y las siguientes conviene agitar con suavidad, sin vrtex ni
pipeteo pues se podra incrementar la contaminacin con ADN genmico
Otro contaminante es el ARN. Para superar ello es que se usa NaOH a ms de 0.1
N (valor que es suficiente para denaturalizar el ADN) y el ARN es inestable a pH alcalino
y se hidroliza en gran parte. El tratamiento con cloruro de litio para precipitar ARN es
efectivo, siempre que no interfiera con las reacciones en las que se emplear el ADN
plasmdico. Generalmente, en la electroforesis el ARN migra muy delante del ADN
plasmdico y no interfiere en su caracterizacin,
Cuestionario
1. Determine la composicin (concentracin de los componentes) de las soluciones I, II,
y III. Realice los clculos respectivos.
2. Qu tratamiento debe aplicarse al ADN plasmdico obtenido para que tenga la pureza
adecuada para su secuenciamiento?
3. Por qu se emplea el cloranfenicol para la extraccin de ciertos plsmidos?
4. Cules son las diferencias entre un plsmido vector de clonacin y un plsmido
vector de expresin?
5. Explique las caractersticas de los siguientes plsmidos:
pBR322, pUC18, pGEM-T, pGEX, Bluescript.
Use mapas si es necesario.
Bibliografa
Ausubel F, Brent R, Kingston R, Moore D, Seidman J, Smith J y Struhl K, editores.
Current Protocolos in Molecular Biology. Massachusetts General Hospital: Harvard
Medical School; 1990.
Brischbach D. Maximing Wizard maxiprep DNA isolations. Promega Notes 1993; 43:4-
9
Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2da ed.
Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.
Sauders SE y Burke F. rapid isolation of miniprep DNA for double strand sequencing.
Nucleic Acids Research 1990;18:4948