Evaluation of Serological Diagnostic Tests for Typhoid Fever in Papua New

Guinea Using a Composite Reference Standard

Typhoid fever remainsa major global health problem. A major impediment to
improving out come sisthelack of appropriate diagnostic tools, which havenot
signicant lyimproved in low income settings for 100 years. We evaluated two
commercially available rapid diagnostic tests (Tubexand TyphiDot), aprototype
(Typhi RapidTR-02),and the commonly used single - serum Widal test inapreviously
reported high burdenarea of Papua New Guinea. Samples were collected from 530
out patients with axillary temperatures of>37.5C, and analysis was conductedon
all malaria-negative samples (n500). Acomposite reference standard of blood
culture and PCR was used, by which 47 participants (9.4%) were considered typhoid
fever positive. Thesensitivity and specicity of the Tubex (51.1% and 88.3%,
respectively) and Typhi Dot (70.0% and 80.1%, respectively) tests were not high
enough
towarranttheirongoinguseinthissetting;however,thesensitivityandspecicityfortheTR-
02prototypewere
promising(89.4%and85.0%,respectively).Anaxillarytemperatureof>38.5Ccorrelated
withtyphoidfever(P0.014).With anappropriate diagnostic test, conducting typhoid
fever diagnosis only on patients with high-grade fever could dramatically decrease
the costs associated with diagnosis while having no detrimental impact on the
ability to accurately diagnose the illness

Typhoid fever, caused by the bacterium Salmonella enterica serovar Typhi (S.Typhi),
remains animportant health problem through out the developing world. There are
an estimated 21.6 million cases annually worldwide, resulting in approximately
200,000 deaths (8). While typhoid fever endemicity is geographically widespread,
the burden is particularly high in the southern Asia region extending down to Papua
New Guinea(PNG),withan incidence rate of 100 to 1,000 per 100,000 (8). The most
recent epidemiological study on typhoid fever in PNG was conducted approximately
20 years ago in Goroka, Eastern Highlands Province. The annual incidence rate of
1,208 cases per 100,000 was, at that time, among the highest in the world (27). Up-
to-date incidence data are unavailable; however, the disease remains a common
diagnosis in febrile patients in the PNG highlands. Despite the high burden of
typhoid fever, the disease has been much neglected in recent years, in part due to
the lack of suitable diagnostic tools (19).
The mainstay of laboratory diagnosis for
typhoidfeverisbloodculture,althoughthegoldstandardisbone
marrowculture(28).Inlow-incomecountrieswherethemajority
oftyphoidfevercasesoccur,bacterialcultureisnotroutinelyconducted. Where culture is
conducted, bone marrow culture
remainsuncommonduetotheinvasivenessandtechnicaldifculty of the procedure. As
such, there is a dependence on alternative forms of diagnosis. The Widal test has
been widely used in lowincome countries for over a century. It detects patient serum
antibodiestoS.TyphiOandHantigens.However,ithasnumerous limitations (24, 27, 28),
including poor specicity (other conditions can lead to an increased antibody titer,
including malaria
infection)andacutofftiterthatdiffersaccordingtotheendemicityofthedisease.In
1987,therecommendedcutofftiterof 40 forasingle-
serumOantigentestresultedinatestthatwas98% sensitive and 98% specic in the
PNG highlands (29), but within5years,therecommendedcutofftiterhadrisento160
(27).TheuseoftheWidaltestinPNGhasnotbeenreevaluated
since,butitremainstheprimarymethodoflaboratorydiagnosis in this country. In recent
years, various alternative diagnostic tests for typhoid
fever have been developed and evaluated. Previous studies have shown that
various prototypes and commercially available diagnostic tests may have
advantages over the Widal test (1315, 25). However, there remains no single test
that has proven to be sufciently sensitive, specic, and practical for use in low-
income countries, and as such, these diagnostic kits are seldom used on a large
scale. Rapid diagnostic test (RDT) evaluations to date have used
bloodcultureprimarilyasthereferencestandardfortyphoidfever
diagnosis.Cultureprovidesdenitiveevidenceonfection,butit
failstodetectallcases,duetolownumbersofthepathogeninthe bloodstream and/or prior
exposure to antibiotics. There is no evidence to date to suggest that automated
systems overcome this shortcoming; indeed, in one recent study manual and
automated blood cultures were equally sensitive for the detection of S. Typhi (13).
The use of a composite reference standard for evaluation of
diagnostictestshasbeenproposedwhenthereisnosingletestthat is adequate as the
reference standard (1). The use of multiple highly specic tests may increase the
ability to detect a true-positive sample. This approach has been endorsed by the
TDR Diagnostics Evaluation Expert Panel (3). Inrecentyears,molecularbiology-
basedassayshavebeenevaluatedintrialsforthedetectionofS.Typhiinblood(4,11,18,22).
Theapplicationofsuchmethodsinroutinediagnosisfortyphoid fever is yet to be
established; however, nucleic acid diagnostic assays can offer high sensitivity and
excellent specicity. Given the previously reported high incidence of typhoid in the
highlands of PNG, the ongoing transmission of the disease, and the need to
determine the best diagnostic strategy in PNG, we evaluated two
commerciallyavailabletyphoidserodiagnostictestkits(TubexTF, manufactured by IDL
Biotech AB, Sweden, and TyphiDot, manufactured by Reszon Diagnostics
International Sdn. Bhd, Malaysia); one prototype kit, TR-02 (Reszon Diagnostics
International Sdn. Bhd, Malaysia); and the currently used Widal test. The TubexTF
test detects serum anti-Salmonella O9 (lipopolysaccharide) IgM and IgG antibodies
in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based assay (16). The TyphiDot
assay is a dot enzyme immunoassay which detects serum anti-Salmonella IgM
andIgGantibodiesspecicfora50-kDaoutermembraneprotein (OMP) antigen (6, 12).
The TR-02 prototype is an immunochromatography assay which detects serum IgM
(but not IgG) antibodiestothesameSalmonellaOMPantigenusedintheTyphiDot assay.
We used a composite reference standard of blood culture and real-time PCR to
evaluate the diagnostic kits.

MATERIALS AND METHODS

Participant recruitment and specimen collection. Patient recruitment
tookplaceattheGorokaGeneralHospitaloutpatientcenterandtheLopi
UrbanClinicinGoroka,EasternHighlandsProvince,PapuaNewGuinea. Febrile patients
(axillary temperature, 37.5C) who reported having
feverforatleast2dayswereinvitedtoparticipateinthestudy.Inaddition, patients with an
absence of fever at the time of consultation, or selfreported fever for less than 2
days prior to consultation, were included in the study if there was clinical suspicion
of typhoid fever by the study staff or senior clinical staff at the study sites. All
patients were informed of the study aims, and following informed consent, a brief
questionnaire was administered. The questionnaire sought information regarding
clinical symptoms and prior antimicrobial treatment. Up to 25 ml of blood was
collectedfromadults,and3to5mlwascollectedfromchildren 5years
old.Abloodlmwaspreparedformalariamicroscopy.Blood,inoculated blood culture
bottles (see below), and the blood smear were transported to the laboratory within
2 h ofcollection. Upon receipt of samples at the laboratory, serum separator tubes
were centrifuged at 3,000 g for 10 min and aliquots of serum were stored at 20C
for later serological testing. Aliquots of whole blood were also stored at 20C for
later DNA extraction. Malaria diagnosis. Thick and thin blood lms were xed,
Giemsa stained, and read according to standard methods (5) by experienced
microscopists.Malaria-positivesampleswereexcludedfromfurtheranalysis on the
assumption that malaria was the primary cause of fever.
Bloodculture.Immediatelyfollowingbloodcollection,5mlofblood was added to 45 ml of
tryptic soy broth with sodium polyanethol sulfonate, as described by Gratten (10).
This methodology has been successfully used in our laboratory to culture a variety
of organisms (9). Blood cultures were incubated at 37C, and after 24 h of
incubation, approximately 100 l of blood culture broth was plated onto blood agar,
chocolate agar, MacConkey agar, and xylose-lysine desoxycholate agar. Plates
wereincubatedat37Cfor24handexaminedforgrowth.Bloodagarand chocolate agar
plates were incubated in a 5% carbon dioxide-enriched atmosphere and incubated
for 24 to 48 h to detect other causes of bacteremia. Subculture of the blood culture
broth onto solid medium was
repeatedafter3daysand7daysofbloodculturebottleincubation.Blood
cultureswereconsiderednegativeanddiscardediftherewasnogrowthon solid medium
inoculated on day 7. This is largely consistent with WHO guidelines for S. Typhi
culture (30). Serological tests. Batches of sera were removed from the freezer, and
all serological tests were conducted on sera within 24 h of thawing. The Widal test
was conducted using S. Typhi O antigen (Remel Europe Ltd.). Using a 6-well plate,
patient serum was diluted in S. Typhi O antigen to
produceserumtitersof40,80,160,and320.Theserumandantigenwere
allowed 1 min to agglutinate before reading. This method is standard procedure in
PNG. The TubexTF, TyphiDot, and prototype TR-02
diagnostictestswereconductedaccordingtothemanufacturersinstructions. Results for
all serological tests were double read. Molecular detection. DNA extraction was
conducted from 200 l of whole blood using the Qiagen DNeasy blood and tissue
extraction kit, according to the manufacturers instructions for extraction from blood
samples. Real-time PCR analysis was conducted on all malaria-negative
samplesusingapreviouslydescribedhydrolysisprobeassayforS.Typhi(18).
Thisassaytargetsa73-bpregionoftheS.TyphiH1-dflagellingeneusing
thefollowingprimersandprobe:forwardprimerST5(5=-CAACCTGGG CAA TAC CGT AAA
TAA-3=), reverse primer ST6A (5=-TTC GGT TGC GTA GTC GGA AT-3=), and dually
labeled probe ST7 (5=-HEX-TG TCT TCT GCC CGT AGC CGT ATC G-BHQ1-3=). The
real-time PCR was conducted in a 20-l reaction mix containing 2 l of the DNA
extract, 400 nM (each) ST5 and ST6A primers, 400 nM TaqMan probe ST7, 1
QuantiTect Mastermix (Qiagen), and nucleasefree water. All reactions were
conducted on a Bio-Rad CFX-96 real-time
systemwiththefollowingcyclingparameters:50Cfor2min,followedby 40 cycles of
94C for 1 min and 60C for 1 min. Negative and positive controls were included in
each run. A positive result was dened as a
samplehavingacyclethreshold(CT)between16and40usinganautocalculated single-
threshold baseline using the Bio-Rad CFX Manager software version 2.0. The
specicity of this real-time PCR assay has been previously described, and it was
found to be specic for S. Typhi. It does not amplify closely related bacteria,
including Salmonella enterica serovars Paratyphi, Typhimurium, Choleraesuis, and
Enteritidis, or non-Salmonella species Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,
Klebsiella aeruginosa, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa,
Enterobacter spp.,
Citrobacterfreundii,orAlcaligenesfaecalis(18).Thelimitofdetectionwas determined by
amplifying triplicate 10-fold serial dilutions of a
wholegenomeextractionofpureS.TyphicultureatknownCFU.Thedetection
limitwasdenedasthehighestdilutionwithapositiveresultineachofthe
triplicatesamplestested,resultinginalowerlimitof4.4CFU.Amplication efciency was
93%, and R2 was 0.991.
Dataanalysis.DatawereenteredintoanExcelspreadsheet(Microsoft
Corporation,Redmond,WA).AnalysiswasconductedinExcelandSPSS Statistics 20 (IBM
Corporation, Armonk, NY). Sensitivity, specicity,
positivepredictivevalue(PPV),andnegativepredictivevalue(NPV)were calculated as
described by the TDR Diagnostics Evaluation Expert Panel (3). Samples that were
positive by either blood culture or PCR were considered composite reference
standard positive: samples negative by both blood culture and PCR were composite
reference standard negative. Correlations were sought between the presence of
typhoid fever (as determined by the composite reference standard) and the severity
and duration of fever using chi-square analysis. Patients were stratied into three
groups according to severity of fever: no fever, low-moderate fever, and high fever
(axillary temperatures of 37.5C, 37.5 to 38.4C, and 38.5C, respectively). Patients
were also stratied according to self-reported duration of fever (2 days, 2 to 6 days,
and 7 days). Where correlation soccurred, diagnostic tests werere evaluated using
that parameter as part of the inclusion criteria. Ethical approval. This study was
reviewed and approved by the appropriate review boards, the Papua New Guinea
Institute of Medical Research Institutional Review Board (0818) and the Papua New
Guinea Medical Research Advisory Committee (08/17), and informed consent was
obtained from all the participants or their parents or guardians.

RESULTS
Participants.Atotalof530patientswithaxillarytemperaturesof 37.5C for at least 2
days and/or clinical suspicion of typhoid
feverwererecruitedoveraperiodof18monthsfromMarch2009 to September 2010. Of
the 530 participants, 321 (60%) were en Sibarolled at the Goroka General Hospital
and 209 (40%) were enrolledattheLopiUrbanClinic,and269(51%) were male and 261
(49%) were female. Participants were between 1 year of agea nd 60 years of
age,with amedian age of 38.5years. Thirty patients (6%) were malaria positive, and
thus, no further analysis was conducted, on the assumption that malaria was
thesole cause of fever. Of the remaining 500 participants, 54 had no fever at the
time of recruitment (and thus were enrolled in the study on clinical suspicion of
typhoid fever), while 262 and 184 had axillary temperatures of 37.5 to 38.4C and
38.5C, respectively. Of the 446 patients with fever, 6 reported having had fever for
2 days, 241 reportedhavinghadfeverfor2to6days,and199reportedhaving had fever
for 7 days. Bloodculture.CultureforS.Typhiwasconductedonthe500 malaria-negative
samples, with an isolation rate of 4% (n 22).
Onlyonesamplewasculturepositiveforanotherbacterialpathogen (Escherichia coli).
PCR. Forty patients (8%) were diagnosed with typhoid fever by real-time PCR: 15 of
the PCR-positive patients were blood culture positive, while 25 were blood culture
negative. Seven bloodculture-positivesampleswerePCRnegative.Thus,bycombination
of PCR and blood culture 47 participants (9.4%) were diagnosed with typhoid fever,
over twice the number of positive patients diagnosed by blood culture alone.
Serology. Forty-three (8%) patients tested positive using the Widal test at a titer of
160, 77 (15%) tested positive using TubexTF, 121 (23%) tested positive using
TyphiDot, and 110 (22%) tested positive using the TR-02 prototype test. The Widal
test was positive for 19/22 blood culture-positive samples and 17/40 PCR-positive
samples. Corresponding data for the other rapid detection tests were as follows:
TubexTF, positive for 17/22
and19/40samples,respectively;TyphiDot,21/22and24/40sam
ples, respectively; and TR-02, 22/22 and 35/40 samples, respectively.
Evaluationofdiagnostictests.Alloftheserologicaltestswere evaluated using the
composite reference standard and also using blood culture alone as the reference
standard (Table 1). This was to better enable comparison of our ndings with
previous evaluations of Tubex and TyphiDot. A correlation was observed between S.
Typhi infection and severity of fever when stratied (2 7.309; degrees of freedom
[df] 2; P 0.026). Further analysis revealed a correlation between the absence of S.
Typhi infection and low-moderate fever (2 7.009; df 1; P 0.008) and the presence
of S. Typhi infection and high fever (2 5.993; df 1; P 0.014). No correlations were
observed between the duration of fever and S. Typhi infection. On this basis,
serological tests were reevaluated, excluding patients with no and low-moderate
fever (38.5C). Thus, data from 184 patients were included, of which 25 (13.6%)
were composite reference standard positive. Sensitivity, specicity, PPV, and NPV
were similar to those derived from the evaluations using the entire data set (Table
2).

DISCUSSION
Our study demonstrates the value of using the molecular detection of S. Typhi in
blood when evaluating rapid diagnostic tests. Despite bone marrow culture being
the gold standard of typhoid diagnosis, blood culture is universally used as the
reference standard when evaluating typhoid diagnostic tests. We have
demonstrated a 2.1-fold increase in typhoid fever diagnosis when blood culture and
real-time PCR detection were used, relative to blood culture alone.
Previousstudieshavedemonstratedthepotentialofmolecular detection of S. Typhi from
blood; however, debate remains regarding the true utility of PCR as a diagnostic tool
for typhoid fever. The validity of the debate is evident in the current study,
wheresevenof22(32%)bloodculture-positivesampleswerePCR negative. Nga and
colleagues also demonstrated that blood
samplesthatwereculturepositivecouldbePCRnegative,where58% ofculture-
positivesampleswerenegativeusingdetectionbyrealtime PCR. In contrast to our
ndings, Nga et al. did not detect S.
Typhi(orS.ParatyphiA)inanybloodsampleswithsymptomsof enteric (typhoid) fever
that were culture negative (23). However,
otherresearchershavedetectedS.Typhiinculture-negativeblood by using regular,
nested, and real-time PCR platforms (4, 11, 18,
22).OurdatasuggestthatPCRisusefulasacomplementaryform of diagnosis in the
context of diagnostic evaluation and provides the advantage of being able to detect
nonviable cells (e.g., in patients who have recently commenced antibiotics).
However, for reasons previously outlined PCR is not currently applicable for routine
diagnostic use (2). Typhoid fever diagnostic evaluations have consistently
demonstratedlessthanoptimalsensitivityandspecicityofrapidtests (26). When using
blood culture as the reference standard, we found the sensitivity and specicity of
the Tubex and TyphiDot tests to be comparable to those in previous reports (13, 14,
25). However, these assays performed less satisfactorily when evaluated against
the composite reference standard. In contrast, the performance of the prototype
diagnostic test (TR-02) was promising when evaluated against the composite
reference standard, having both a sensitivity and a specicity of 85%. The
correlation between typhoid fever and high-grade fever (axillary temperature of
38.5C) may have important implications for typhoid fever diagnosis. When study
participants with low-grade fever were excluded from analysis, the sensitivity and
specicity of the assay improved, albeit marginally. In our study,
22patientswithconrmedtyphoidfeverwouldbeexcludedfrom initial testing if such a
testing algorithm were adopted. However, this is from a total of 316 excluded
patients (i.e., 6.96% positive): of the 184 patients who would be tested for typhoid
fever, 25 (13.59%) were positive. In a clinical setting, considerable money could be
saved on diagnostic tests if only patients with a current fever of 38.5C (axillary
temperature) were tested for typhoid
fever.Patientsnottestedwouldneedtobeadvisedtopresentin2 to 3 days if symptoms
persisted to minimize the number of true cases not correctly diagnosed. On the
basis of our ndings, there
couldbeareductionof63%inthenumberoftestsrequired,with no compromise in the
ability to accurately diagnose typhoid fever. It has been speculated that the lack of
specicity of some rapid diagnostic tests might be in part due to the inability of
blood culturetodetectallactiveinfections(13),i.e.,therapiddiagnostic kits may be
correctly diagnosing an active typhoid case when blood culture is negative. The use
of both blood culture and PCR to detect S. Typhi infection is no guarantee that all
true positive cases will be detected, but it did increase the rate of detection.
However, in our study the specicity of the rapid diagnostic tests
evaluateddidnotimprovewhenthecompositereferencestandard was used, as opposed
to blood culture alone. This suggests some inherent specicity issues with the
currently available typhoid fever diagnostic assays. In the primary health care
setting, none of the established typhoid rapid diagnostic tests is sufciently
sensitive to warrant their immediate routine use in PNG. Similar ndings have been
observed in Bangladesh (21) and sub-Saharan Africa (14), al
Though under certain circum stances,it has been suggested tha the use of rapid
diagnostic tests with known limitations might be of somevalue(7).On the basis of
our ndings, theTR-02prototype warrants further evaluation for potential routine use
in PNG and other settings.More over,theTR-02 isuser-friendly,being asolid phase
immunechromatic assay (similar to a rapid pregnancy test oramalariaRDT);can be
store dat 20 to 25C; is rapid (10min); and is easy to interpret. It detects the same
anti-Salmonella antibodies as does the TyphiDot assay but has better sensitivity and
specicity.Thisispresumablyafunctionofthedifferentimmune platforms on which the
tests are based. Another difference is that the TR-02 detects only IgM, whereas the
TyphiDot and Tubex detectbothIgMandIgG.TheTR-02prototypeandtheTyphiDot
assayhaverecentlybecomeavailablethroughReszonDiagnostics International Sdn.
Bhd (Malaysia); the prototype TR-02 is marketed under the name TyphiDot Rapid (or
Typhi Rapid). Typhoid fever diagnostic evaluations conducted on hospitalized
patients (13, 25) provide little insight into the application of the diagnostic tests in
the community health care setting. However, it is the primary health care level
where sensitive, specic, rapid, cheap, and user-friendly typhoid diagnostic kits are
most required. The clinical differentiation of typhoid fever from other causes of
febrile illness present in regions where typhoid is endemic (e.g., malaria, dengue
and other arbovirus infections,
rickettsialinfections,andleptospirosis)isdifcult,butthetreatments differ markedly
(20, 26). Moreover, with the rollout of malaria rapid diagnostic tests through the
Global Fund Initiative, there may be an increased need for diagnosis of other causes
of febrile illnessiftheguidelinesareadheredtoandnomalariatreatmentis given to
malaria RDT-negative patients. It is in this context that high-grade fever is
important: in areas of malaria and typhoid endemicity where a malaria RDT yields a
negative result, there may be clinical signs and symptoms such as severity of fever
that can help determine the value of conducting a typhoid diagnostic test without
negatively impacting patient outcome. It is likely that the Widal test will remain in
use in PNG and manyotherlow-incomesettingsfortheforeseeablefuture,despite
itsknownlimitationsinsuchsettings(17).Wehavedemonstrated
thatusingthelocallyrecommendedcutofftiterof160givesriseto a test with poor
sensitivity, albeit high specicity. Lowering the
cutofftitermayimprovesensitivitybutdecreasespecicity.Ifuse
oftheWidaltestiscontinuedinPNG,amulticenterstudyshould be considered to
determine background titers in asymptomatic patients and to further investigate the
cutoff titer which is optimized for both sensitivity and specicity.

ACKNOWLEDGMENTS
Rapid diagnostic kits were donated by IDL Biotech AB, Sweden (Tubex), and
Malaysian Bio-Diagnostics Research Sdn. Bhd, Malaysia (TyphiDot and prototype TR-
02; these kits are now available from Reszon Diagnostics International Sdn. Bhd,
Malaysia). We thank the Bacteriology and Immunology staff at PNG Institute of
Medical Research who assisted with laboratory work. Audrey Michael and Mition
Yoannes assisted with the microscopy and conrmation of bacterial cultures and
biochemical tests; William Pomat oversaw immunology staff (Jacinta Francis, Mildred
Lai, Hennah Aole, and Brian Martin) who assisted with conducting rapid diagnostic
tests. MarinjhoJonduohelpedestablishthereal-time PCR assay.
AnnaSolomonconductedpatientrecruitment,and weal so thank the staff of the clinics
where the study was conducted (Goroka General Hospital outpatient center and the
Lopi Urban Clinic). We are grateful to Stephen
BakerforhisinsightsintomoleculardiagnosisofS.Typhiintheplanning stages of this
study. Jo-Ann Larkins and Andrew Percy (Monash University, Australia )
providedadviceonstatisticalanalysis. We are grateful to all the patients who
participated in this study.
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Defenisi Demam Tifoid Demam tifoid disebut juga
dengan Typus abdominalis atau typoid fever. Demam tipoid ialah penyakit infeksi
akut yang biasanya terdapat pada saluran pencernaan (usus halus) dengan gejala
demam satu minggu atau lebih disertai gangguan pada saluran pencernaan dan
dengan atau tanpa gangguan kesadaran .11 2.2. Infectious Agent 4 Demam tifoid
disebabkan oleh bakteri Salmonella typhi atau Salmonella paratyphi dari Genus
Salmonella. Bakteri ini berbentuk batang, gram negatip, tidak membentuk spora,
motil, berkapsul dan mempunyai flagella (bergerak dengan rambut getar). Bakteri
ini dapat hidup sampai beberapa minggu di alam bebas seperti di dalam air, es,
sampah dan debu. Bakteri ini dapat mati dengan pemanasan (suhu 600 C) selama
15 20 menit, pasteurisasi, pendidihan dan khlorinisasi. Salmonella typhi
mempunyai 3 macam antigen, yaitu : 12 1. Antigen O (Antigen somatik), yaitu
terletak pada lapisan luar dari tubuh kuman. Bagian ini mempunyai struktur kimia
lipopolisakarida atau disebut juga endotoksin. Antigen ini tahan terhadap panas dan
alkohol tetapi tidak tahan terhadap formaldehid. 2. Antigen H (Antigen Flagella),
yang terletak pada flagella, mbriae atau pili dari kuman. Antigen ini mempunyai
struktur kimia suatu protein dan tahan terhadap formaldehid tetapi tidak tahan
terhadap panas dan alkohol. Universitas Sumatera Utara 3. Antigen Vi yang terletak
pada kapsul (envelope) dari kuman yang dapat melindungi kuman terhadap
fagositosis. Ketiga macam antigen tersebut di atas di dalam tubuh penderita akan
menimbulkan pula pembentukan 3 macam antibodi yang lazim disebut aglutinin.
2.3. Patogenesis 13 Salmonella typhi dan Salmonella paratyphi masuk kedalam
tubuh manusia melalui makanan yang terkontaminasi kuman. Sebagian kuman
dimusnahkan oleh asam lambung dan sebagian lagi masuk ke usus halus dan
berkembang biak. Bila respon imunitas humoral mukosa IgA usus kurang baik maka
kuman akan menembus sel-sel epitel terutama sel M dan selanjutnya ke lamina
propia. Di lamina propia kuman berkembang biak dan difagosit oleh sel-sel fagosit
terutama oleh makrofag. Kuman dapat hidup dan berkembang biak di dalam
makrofag dan selanjutnya dibawa ke plaque Peyeri ileum distal dan kemudian ke
kelenjar getah bening mesenterika. Selanjutnya melalui duktus torasikus kuman
yang terdapat di dalam makrofag ini masuk ke dalam sirkulasi darah
(mengakibatkan bakterimia pertama yang asimtomatik) dan menyebar ke seluruh
organ retikuloendotelial tubuh terutama hati dan limpa. Di organ-organ ini kuman
meninggalkan sel-sel fagosit dan kemudian berkembang biak di luar sel atau ruang
sinusoid dan selanjutnya masuk ke dalam sirkulasi darah lagi yang mengakibatkan
bakterimia yang kedua kalinya dengan disertai tanda-tanda dan gejala penyakit
infeksi sistemik, seperti demam, malaise, mialgia, sakit kepala dan sakit perut.
Universitas Sumatera Utara 2.4. Gejala Klinis14 Gejala klinis demam tifoid pada
anak biasanya lebih ringan jika dibanding dengan penderita dewasa. Masa inkubasi
rata-rata 10 20 hari. Setelah masa inkubasi maka ditemukan gejala prodromal,
yaitu perasaan tidak enak badan, lesu, nyeri kepala, pusing dan tidak bersemangat.
Kemudian menyusul gejala klinis yang biasa ditemukan, yaitu : a. Demam Pada
kasus-kasus yang khas, demam berlangsung 3 minggu. Bersifat febris remiten dan
suhu tidak berapa tinggi. Selama minggu pertama, suhu tubuh berangsurangsur
meningkat setiap hari, biasanya menurun pada pagi hari dan meningkat lagi pada
sore dan malam hari. Dalam minggu kedua, penderita terus berada dalam keadaan
demam. Dalam minggu ketiga suhu tubuh beraangsur-angsur turun dan normal
kembali pada akhir minggu ketiga. b. Ganguan pada saluran pencernaan Pada
mulut terdapat nafas berbau tidak sedap. Bibir kering dan pecah-pecah (ragaden) .
Lidah ditutupi selaput putih kotor (coated tongue), ujung dan tepinya kemerahan,
jarang disertai tremor. Pada abdomen mungkin ditemukan keadaan perut kembung
(meteorismus). Hati dan limpa membesar disertai nyeri pada perabaan. Biasanya
didapatkan konstipasi, akan tetapi mungkin pula normal bahkan dapat terjadi diare.
c. Gangguan kesadaran Umumnya kesadaran penderita menurun walaupun tidak
berapa dalam, yaitu apatis sampai somnolen. Jarang terjadi sopor, koma atau
gelisah. Universitas Sumatera Utara 2.5. Epidemiologi Demam Tifoid 2.5.1.
Distribusi dan Frekwensi a. Orang Demam tifoid dapat menginfeksi semua orang
dan tidak ada perbedaan yang nyata antara insiden pada laki-laki dan perempuan.
Insiden pasien demam tifoid dengan usia 12 30 tahun 70 80 %, usia 31 40
tahun 10 20 %, usia > 40 tahun 5 10 %.15 Menurut penelitian Simanjuntak, C.H,
dkk (1989) di Paseh, Jawa Barat terdapat 77 % penderita demam tifoid pada umur 3
19 tahun dan tertinggi pada umur 10 -15 tahun dengan insiden rate 687,9 per
100.000 penduduk. Insiden rate pada umur 0 3 tahun sebesar 263 per 100.000
penduduk.16 b. Tempat dan Waktu Demam tifoid tersebar di seluruh dunia. Pada
tahun 2000, insiden rate demam tifoid di Amerika Latin 53 per 100.000 penduduk
dan di Asia Tenggara 110 per 100.000 penduduk.6 Di Indonesia demam tifoid dapat
ditemukan sepanjang tahun, di Jakarta Utara pada tahun 2001, insiden rate demam
tifoid 680 per 100.000 penduduk dan pada tahun 2002 meningkat menjadi 1.426
per 100.000 penduduk.17 2.5.2. Faktor-faktor yang Mempengaruhi (Determinan) a.
Faktor Host Manusia adalah sebagai reservoir bagi kuman Salmonella thypi.
Terjadinya penularan Salmonella thypi sebagian besar melalui makanan/minuman
yang tercemar oleh kuman yang berasal dari penderita atau carrier yang biasanya
keluar bersama Universitas Sumatera Utara dengan tinja atau urine. Dapat juga
terjadi trasmisi transplasental dari seorang ibu hamil yang berada dalam bakterimia
kepada bayinya.18 Penelitian yang dilakukan oleh Heru Laksono (2009) dengan
desain case control , mengatakan bahwa kebiasaan jajan di luar mempunyai resiko
terkena penyakit demam tifoid pada anak 3,6 kali lebih besar dibandingkan dengan
kebiasaan tidak jajan diluar (OR=3,65) dan anak yang mempunyai kebiasaan tidak
mencuci tangan sebelum makan beresiko terkena penyakit demam tifoid 2,7 lebih
besar dibandingkan dengan kebiasaan mencuci tangan sebelum makan (OR=2,7).
20 b. Faktor Agent Demam tifoid disebabkan oleh bakteri Salmonella thypi. Jumlah
kuman yang dapat menimbulkan infeksi adalah sebanyak 105 109 kuman yang
tertelan melalui makanan dan minuman yang terkontaminasi. Semakin besar
jumlah Salmonella thypi yang tertelan, maka semakin pendek masa inkubasi
penyakit demam tifoid.24 c. Faktor Environment Demam tifoid merupakan penyakit
infeksi yang dijumpai secara luas di daerah tropis terutama di daerah dengan
kualitas sumber air yang tidak memadai dengan standar hygiene dan sanitasi yang
rendah. Beberapa hal yang mempercepat terjadinya penyebaran demam tifoid
adalah urbanisasi, kepadatan penduduk, sumber air minum dan standart hygiene
industri pengolahan makanan yang masih rendah. Berdasarkan hasil penelitian
Lubis, R. di RSUD. Dr. Soetomo (2000) dengan desain case control , mengatakan
bahwa higiene perorangan yang kurang, mempunyai resiko terkena penyakit
demam tifoid 20,8 kali lebih besar dibandingkan dengan yang higiene perorangan
yang baik (OR=20,8) dan kualitas air minum yang Universitas Sumatera Utara
tercemar berat coliform beresiko 6,4 kali lebih besar terkena penyakit demam tifoid
dibandingkan dengan yang kualitas air minumnya tidak tercemar berat coliform
(OR=6,4) .19 2.6. Sumber Penularan (Reservoir) Penularan penyakit demam tifoid
oleh basil Salmonella typhi ke manusia melalui makanan dan minuman yang telah
tercemar oleh feses atau urin dari penderita tifoid.4 Ada dua sumber penularan
Salmonella typhi, yaitu :13 2.6.1. Penderita Demam Tifoid Yang menjadi sumber
utama infeksi adalah manusia yang selalu mengeluarkan mikroorganisme penyebab
penyakit, baik ketika ia sedang menderita sakit maupun yang sedang dalam
penyembuhan. Pada masa penyembuhan penderita pada umumnya masih
mengandung bibit penyakit di dalam kandung empedu dan ginjalnya. 2.6.2. Karier
Demam Tifoid. Penderita tifoid karier adalah seseorang yang kotorannya (feses atau
urin) mengandung Salmonella typhi setelah satu tahun pasca demam tifoid, tanpa
disertai gejala klinis. Pada penderita demam tifoid yang telah sembuh setelah 2 3
bulan masih dapat ditemukan kuman Salmonella typhi di feces atau urin. Penderita
ini disebut karier pasca penyembuhan. Pada demam tifoid sumber infeksi dari karier
kronis adalah kandung empedu dan ginjal (infeksi kronis, batu atau kelainan
anatomi). Oleh karena itu apabila terapi Universitas Sumatera Utara medika-
mentosa dengan obat anti tifoid gagal, harus dilakukan operasi untuk
menghilangkan batu atau memperbaiki kelainan anatominya. 3 Karier dapat dibagi
dalam beberapa jenis.21 a. Healthy carrier (inapparent) adalah mereka yang dalam
sejarahnya tidak pernah menampakkan menderita penyakit tersebut secara klinis
akan tetapi mengandung unsur penyebab yang dapat menular pada orang lain,
seperti pada penyakit poliomyelitis, hepatitis B dan meningococcus. b. Incubatory
carrier (masa tunas) adalah mereka yang masih dalam masa tunas, tetapi telah
mempunyai potensi untuk menularkan penyakit/ sebagai sumber penularan, seperti
pada penyakit cacar air, campak dan pada virus hepatitis. c. Convalescent carrier
(baru sembuh klinis) adalah mereka yang baru sembuh dari penyakit menulat
tertentu, tetapi masih merupakan sumber penularan penyakit tersebut untuk masa
tertentu, yang masa penularannya kemungkinan hanya sampai tiga bulan
umpamanya kelompok salmonella, hepatitis B dan pada dipteri. d. Chronis carrier
(menahun) merupakan sumber penularan yang cukup lama seperti pada penyakit
tifus abdominalis dan pada hepatitis B. 2.7. Komplikasi Komplikasi demam tifoid
dapat dibagi atas dua bagian, yaitu : 2.7.1. Komplikasi Intestinal13 a. Perdarahan
Usus Sekitar 25% penderita demam tifoid dapat mengalami perdarahan minor yang
tidak membutuhkan tranfusi darah. Perdarahan hebat dapat terjadi hingga
penderita Universitas Sumatera Utara mengalami syok. Secara klinis perdarahan
akut darurat bedah ditegakkan bila terdapat perdarahan sebanyak 5 ml/kgBB/jam.
b. Perforasi Usus Terjadi pada sekitar 3% dari penderita yang dirawat. Biasanya
timbul pada minggu ketiga namun dapat pula terjadi pada minggu pertama.
Penderita demam tifoid dengan perforasi mengeluh nyeri perut yang hebat
terutama di daerah kuadran kanan bawah yang kemudian meyebar ke seluruh
perut. Tanda perforasi lainnya adalah nadi cepat, tekanan darah turun dan bahkan
sampai syok. 2.7.2. Komplikasi Ekstraintestinal 22 a. Komplikasi kardiovaskuler :
kegagalan sirkulasi perifer (syok, sepsis), miokarditis, trombosis dan tromboflebitis.
b. Komplikasi darah : anemia hemolitik, trombositopenia, koaguolasi intravaskuler
diseminata, dan sindrom uremia hemolitik. c. Komplikasi paru : pneumoni,
empiema, dan pleuritis d. Komplikasi hepar dan kandung kemih : hepatitis dan
kolelitiasis e. Komplikasi ginjal : glomerulonefritis, pielonefritis, dan perinefritis f.
Komplikasi tulang : osteomielitis, periostitis, spondilitis, dan artritis g. Komplikasi
neuropsikiatrik : delirium, meningismus, meningitis, polineuritis perifer, psikosis,
dan sindrom katatonia. Universitas Sumatera Utara 2.8. Pencegahan Demam Tifoid
Pencegahan dibagi menjadi beberapa tingkatan sesuai dengan perjalanan penyakit,
yaitu pencegahan primer, pencegahan sekunder, dan pencegahan tersier.23 2.8.1.
Pencegahan Primer Pencegahan primer merupakan upaya untuk mempertahankan
orang yang sehat agar tetap sehat atau mencegah orang yang sehat menjadi sakit.
Pencegahan primer dapat dilakukan dengan cara imunisasi dengan vaksin yang
dibuat dari strain Salmonella typhi yang dilemahkan. Di Indonesia telah ada 3 jenis
vaksin tifoid, yaitu : 4 a. Vaksin oral Ty 21 a Vivotif Berna. Vaksin ini tersedia dalam
kapsul yang diminum selang sehari dalam 1 minggu satu jam sebelum makan.
Vaksin ini kontraindikasi pada wanita hamil, ibu menyusui, demam, sedang
mengkonsumsi antibiotik . Lama proteksi 5 tahun. b. Vaksin parenteral sel utuh :
Typa Bio Farma. Dikenal 2 jenis vaksin yakni, K vaccine (Acetone in activated) dan L
vaccine (Heat in activated-Phenol preserved). Dosis untuk dewasa 0,5 ml, anak 6
12 tahun 0,25 ml dan anak 1 5 tahun 0,1 ml yang diberikan 2 dosis dengan
interval 4 minggu. Efek samping adalah demam, nyeri kepala, lesu, bengkak dan
nyeri pada tempat suntikan. Kontraindikasi demam,hamil dan riwayat demam pada
pemberian pertama. c. Vaksin polisakarida Typhim Vi Aventis Pasteur Merrieux.
Vaksin diberikan secara intramuscular dan booster setiap 3 tahun. Kontraindikasi
pada hipersensitif, hamil, menyusui, sedang demam dan anak umur 2 tahun.
Universitas Sumatera Utara Indikasi vaksinasi adalah bila hendak mengunjungi
daerah endemik, orang yang terpapar dengan penderita karier tifoid dan petugas
laboratorium/mikrobiologi kesehatan. Mengkonsumsi makanan sehat agar
meningkatkan daya tahan tubuh, memberikan pendidikan kesehatan untuk
menerapkan prilaku hidup bersih dan sehat dengan cara budaya cuci tangan yang
benar dengan memakai sabun, peningkatan higiene makanan dan minuman berupa
menggunakan cara-cara yang cermat dan bersih dalam pengolahan dan penyajian
makanan, sejak awal pengolahan, pendinginan sampai penyajian untuk dimakan,
dan perbaikan sanitasi lingkungan.4 2.8.2. Pencegahan Sekunder Pencegahan
sekunder dapat dilakukan dengan cara mendiagnosa penyakit secara dini dan
mengadakan pengobatan yang cepat dan tepat. Untuk mendiagnosis demam tifoid
perlu dilakukan pemeriksaan laboratorium. Ada 3 metode untuk mendiagnosis
penyakit demam tifoid, yaitu :24 a.Diagnosis klinik Diagnosis klinis penyakit ini
sering tidak tepat, karena gejala kilinis yang khas pada demam tifoid tidak
ditemukan atau gejala yang sama dapat juga ditemukan pada penyakit lain.
Diagnosis klinis demam tifoid sering kali terlewatkan karena pada penyakit dengan
demam beberapa hari tidak diperkirakan kemungkinan diagnosis demam tifoid. b.
Diagnosis mikrobiologik/pembiakan kuman Metode diagnosis mikrobiologik adalah
metode yang paling spesik dan lebih dari 90% penderita yang tidak diobati, kultur
darahnya positip dalam minggu Universitas Sumatera Utara pertama. Hasil ini
menurun drastis setelah pemakaian obat antibiotika, dimana hasil positip menjadi
40%. Meskipun demikian kultur sum-sum tulang tetap memperlihatkan hasil yang
tinggi yaitu 90% positip. Pada minggu-minggu selanjutnya hasil kultur darah
menurun, tetapi kultur urin meningkat yaitu 85% dan 25% berturut-turut positip
pada minggu ke-3 dan ke-4. Organisme dalam tinja masih dapat ditemukan selama
3 bulan dari 90% penderita dan kira-kira 3% penderita tetap mengeluarkan kuman
Salmonella typhi dalam tinjanya untuk jangka waktu yang lama. c.Diagnosis
serologik12 c.1. Uji Widal Uji Widal adalah suatu reaksi aglutinasi antara antigen
dan antibodi (aglutinin). Aglutinin yang spesik terhadap Salmonella typhi terdapat
dalam serum penderita demam tifoid, pada orang yang pernah tertular Salmonella
typhi dan pada orang yang pernah mendapatkan vaksin demam tifoid. Antigen yang
digunakan pada uij Widal adlah suspensi Salmonella typhi yang sudah dimatikan
dan diolah di laboratorium. Tujuan dari uji Widal adalah untuk menentukan adanya
aglutinin dalam serum penderita yang diduga menderita demam tifoid.25 Dari
ketiga aglutinin (aglutinin O, H, dan Vi), hanya aglutinin O dan H yang ditentukan
titernya untuk diagnosis. Semakin tinggi titer aglutininnya, semakin besar pula
kemungkinan didiagnosis sebagai penderita demam tifoid. Pada infeksi yang aktif,
titer aglutinin akan meningkat pada pemeriksaan ulang yang dilakukan selang
Universitas Sumatera Utara waktu paling sedikit 5 hari. Peningkatan titer aglutinin
empat kali lipat selama 2 sampai 3 minggu memastikan diagnosis demam tifoid.
Interpretasi hasil uji Widal adalah sebagai berikut :12 a. Titer O yang tinggi ( > 160)
menunjukkan adanya infeksi akut b. Titer H yang tinggi ( > 160) menunjukkan telah
mendapat imunisasi atau pernah menderita infeksi c. Titer antibodi yang tinggi
terhadap antigen Vi terjadi pada carrier. Beberapa faktor yang mempengaruhi uji
Widal antara lain :11,25 1. Faktor-faktor yang berhubungan dengan Penderita a.
Keadaan umum gizi penderita Gizi buruk dapat menghambat pembentukan
antibodi. b. Waktu pemeriksaan selama perjalanan penyakit Aglutinin baru
dijumnpai dalam darah setelah penderita mengalami sakit selama satu minggu dan
mencapai puncaknya pada minggu kelima atau keenam sakit. c. Pengobatan dini
dengan antibiotik Pemberian antibiotik dengan obat antimikroba dapat
menghambat pembentukan antibodi. d. Penyakit-penyakit tertentu Pada beberapa
penyakit yang menyertai demam tifoid tidak terjadi pembentukan antibodi,
misalnya pada penderita leukemia dan karsinoma lanjut. Universitas Sumatera
Utara e. Pemakaian obat imunosupresif atau kortikosteroid dapat menghambat
pembentukan antibodi. f. Vaksinasi Pada orang yang divaksinasi demam tifoid, titer
aglutinin O dan H meningkat. Aglutinin O biasanya menghilang setelah 6 bulan
sampai 1 tahun, sedangkan titer aglutinin H menurun perlahan-lahan selama 1 atau
2 tahun. Oleh karena itu titer aglutinin H pada seseorang yang pernah divaksinasi
kurang mempunyai nilai diagnostik. g. Infeksi klinis atau subklinis oleh Salmonella
sebelumnya Keadaan ini dapat menyebabkan uji Widal positif, walaupun titer
aglutininnya rendah. Di daerah endemik demam tifoid dapat dijumpai aglutinin
pada orang-orang yang sehat. 2. Faktor-faktor teknis a. Aglutinasi silang Karena
beberapa spesies Salmonella dapat mengandung antigen O dan H yang sama, maka
reaksi aglutinasi pada satu spesies dapat juga menimbulkan reaksi aglutinasi pada
spesies lain. Oleh karena itu spesies Salmonella penyebab infeksi tidak dapat
ditentukan dengan uji widal. b. Konsentrasi suspensi antigen Konsentrasi suspensi
antigen yang digunakan pada uji widal akan mempengaruhi hasilnya. c. Strain
salmonella yang digunakan untuk suspensi antigen Universitas Sumatera Utara
Daya aglutinasi suspensi antigen dari strain salmonella setempat lebih baik
daripada suspensi antigen dari strain lain. c.2. Uji Enzym-Linked Immunosorbent
Assay (ELISA)12 a. Uji ELISA untuk melacak antibodi terhadap antigen Salmonella
typhi belakangan ini mulai dipakai. Prinsip dasar uji ELISA yang dipakai umumnya
uji ELISA tidak langsung. Antibodi yang dilacak dengan uji ELISA ini tergantung dari
jenis antigen yang dipakai. b. Uji ELISA untuk melacak Salmonella typhi Deteksi
antigen spesik dari Salmonella typhi dalam spesimen klinik (darah atau urine)
secara teoritis dapat menegakkan diagnosis demam tifoid secara dini dan cepat. Uji
ELISA yang sering dipakai untuk melacak adanya antigen Salmonella typhi dalam
spesimen klinis, yaitu double antibody sandwich ELISA. Pencegahan sekunder dapat
berupa : a. Penemuan penderita maupun carrier secara dini melalui penigkatan
usaha surveilans demam tifoid. b. Perawatan umum dan nutrisi Penderita demam
tifoid, dengan gambaran klinis jelas sebaiknya dirawat di rumah sakit atau sarana
kesehatan lain yang ada fasilitas perawatan. Penderita yang dirawat harus tirah
baring dengan sempurna untuk mencegah komplikasi, terutama perdarahan dan
perforasi. Bila klinis berat, penderita harus istirahat total. Bila penyakit membaik,
maka dilakukan mobilisasi secara bertahap, sesuai dengan pulihnya kekuatan
penderita. Universitas Sumatera Utara Nutrisi pada penderita demam tifoid dengan
pemberian cairan dan diet. Penderita harus mendapat cairan yang cukup, baik
secara oral maupun parenteral. Cairan parenteral diindikasikan pada penderita sakit
berat, ada komplikasi penurunan kesadaran serta yang sulit makan. Cairan harus
mengandung elektrolit dan kalori yang optimal. Sedangkan diet harus mengandung
kalori dan protein yang cukup. Sebaiknya rendah serat untuk mencegah perdarahan
dan perforasi. Diet untuk penderita tifoid biasanya diklasikasikan atas : diet cair,
bubur lunak, tim dan nasi biasa. c. Pemberian anti mikroba (antibiotik) Anti mikroba
(antibiotik) segera diberikan bila diagnosa telah dibuat. Kloramfenikol masih
menjadi pilihan pertama, berdasarkan ekasi dan harga. Kekurangannya adalah
jangka waktu pemberiannya yang lama, serta cukup sering menimbulkan karier dan
relaps. Kloramfenikol tidak boleh diberikan pada wanita hamil, terutama pada
trimester III karena dapat menyebabkan partus prematur, serta janin mati dalam
kandungan. Oleh karena itu obat yang paling aman diberikan pada wanita hamil
adalah ampisilin atau amoksilin. Universitas Sumatera Utara 2.8.3. Pencegahan
Tersier Pencegahan tersier adalah upaya yang dilakukan untuk mengurangi
keparahan akibat komplikasi. Apabila telah dinyatakan sembuh dari penyakit
demam tifoid sebaiknya tetap menerapkan pola hidup sehat, sehingga imunitas
tubuh tetap terjaga dan dapat terhindar dari infeksi ulang demam tifoid. Pada
penderita demam tifoid yang carier perlu dilakukan pemerikasaan laboratorium
pasca penyembuhan untuk mengetahui kuman masih ada atau tidak. Universitas
Sumatera Utara