E. Práctica 5 Análisis de Leches y Derivados Lácteos UNAL

PRCTICA N 5
PGINA 1
ANLISIS DE LECHES Y DERIVADOS LCTEOS
CURSO DE MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS
UNIVERSIDAD VERSIN
- 1 - NACIONAL DE COLOMBIA
2
OBJETIVOS
- Capacitar a los estudiantes en las metodologas utilizadas para el anlisis microbiolgico de leche cruda, procesada, as como,
sus derivados.
- Identificar de forma general los microorganismos asociados naturalmente a la leche cruda, procesada y sus derivados.
- Emitir un concepto final acerca de la calidad del producto analizado, comparando los valores obtenidos con los criterios
microbiolgicos vigentes.
INTRODUCCIN.
MICROBIOLOGA DE LA LECHE.
Leche, se define como el producto integro, no alterado ni adulterado y sin calostros del ordeo higinico, regular, completo e
ininterrumpido de vacas sanas y bien alimentadas.
La leche es una secrecin natural de la glndula mamaria de los animales mamferos. Se trata de un alimento completo,
procedente del ordeo de los animales domsticos. La denominacin de leche, sin indicacin de la especie, se refiere a la leche de
vaca; cuando se trata de leche procedente de otras especies de animales domsticos se exige el nombre de la especie (leche de
oveja, leche de cabra, etc.). La composicin de la leche es variable, esto debido a factores como la alimentacin del animal, la
raza, la estacin del ao, etc., siendo su composicin media la siguiente (Tabla 1):
Tabla 1. Composicin media de la leche de vaca.
Compuestos Concentracin
Agua 87%
Protenas 3.5 % (casena 2.7 %).
Lpidos 3.5 4.0 %
Glcidos 5.1 % (Lactosa 4.9 %).
Sales minerales 0.7 % (Na, K, Ca, Fe, Mg, P, Cloruros y cido Ctrico).
C, B1, B2, B6, B12, Niacina, cido Pantotnico, cido Flico, Biotina, Colina e
Vitaminas hidrosolubles
Inositol.
Vitaminas liposolubles A, D, E y K.
La leche contiene tambin enzimas como: Lactenina, lactoperoxidasa, catalasa, reductasa, lipasa, fosfatasa, proteasa, amilasa y
lisozima. La lactenina, lactoperoxidasa y lisozima tienen actividad inhibidora sobre microorganismos. El pH est comprendido entre
6.5 y 6.7.
Precisamente por su composicin y pH, la leche se hace un medio excelente para el crecimiento de la mayor parte de los
microorganismos (bacterias y hongos), presentndose una serie de modificaciones qumicas que pueden dar lugar a:
- Procesos alterativos y,
- Procesos tiles para la elaboracin de otros productos (como quesos, yogur, etc.).
La leche constituye un producto altamente perecedero que, adems puede ser vehculo de bacterias patgenas para el hombre
(Mycobacterium tuberculosis, Brucella spp., Salmonella spp., Escherichia coli enteropatgeno, Listeria monocytogenes y otras).
Con el fin de destruir esta microbiota, la leche debe someterse a un tratamiento trmico de pasteurizacin.
FECHA DE
ELABORADO POR: Alberto Rojas Trivio M.Sc. ELABORACIN
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En la leche tambin pueden estar presentes Micotoxinas procedentes de vacas que han consumido alimentos contaminados
(Aflatoxina M segregada por Aspergillus flavus), o del desarrollo directo de mohos como Penicillium cyclopium, P, viridicatum o P.
stoloniferum, en las leches en polvo.
La leche, aunque proceda de vacas sanas y se halla obtenido en las mejores condiciones de higiene, resulta siempre contaminada
en menor o mayor grado, considerando como carga mnima de un ordeo completo la tasa de 100 a 500 microorganismos/mL. En
general, las primeras porciones extradas son siempre las ms contaminadas, por su proximidad al pezn y en algunas ocasiones
pueden superar 103 microorganismos/mL; las ltimas porciones, pueden resultar incluso estriles (Tabla 2).
Los microorganismos presentes son normalmente saprofitos del pezn y de los canales galactforos. Tambin, puede haber otros
microorganismos de animales enfermos, como los patgenos causantes de infecciones o intoxicaciones en los consumidores y
peligrosos desde el punto de vista sanitario. Los procedentes del pezn, aunque no representan un riesgo, se pueden desarrollar
abundantemente en la leche y producir la alteracin evidente de esta (Tabla 2).
Tabla 2. Fuentes de contaminacin que ocasionan la alteracin y presencia de patgenos en la leche

despus del proceso de ordeo.
Contaminacin de la leche posterior al ordeo

Animales: Escamas de la piel, pelos, suciedad, pezn, rabo, etc.
Ambiente: Contaminacin del aire, polvo, suelo, lecho, etc.
Sistema de ordeo: Manos del ordeador, ordeo mecnico poco higinico.
Recipientes de recoleccin: Material sucio, mal lavado y desinfestado.
Vectores: Particularmente insectos.
Posterior al ordeo y durante la conservacin, el inculo microbiano de la leche sufre ciertas variaciones, a saber:
- En la primera hora que se sigue al ordeo, se produce una disminucin del inculo de microorganismos, debido a la accin
inhibidora de las sustancias antimicrobiana presentes en la leche (lactenina, lactoperoxidasa y lisozima), en especial una
reduccin de bacterias lcticas.
- En una siguiente fase, se produce un incremento de microorganismos, supeditado a la temperatura de conservacin de la
leche. Si no se frena este crecimiento, se producen una serie de modificaciones fisicoqumicas en el producto.
- Se inicia a continuacin una fase de acidificacin, consecuencia de la fermentacin de la lactosa con la consecuente formacin
de cido lctico, descendiendo el pH a 4.0 4.5. La acidificacin es ms o menos rpida, segn la especie microbiana que la
origina y de las condiciones ambientales, principalmente la temperatura. El cido lctico, se combina con el calcio presente en
la molcula de casena producindose la coagulacin de la leche.
El aumento de acidez inactiva la accin de los fermentos lcticos, circunstancia que aprovechan los mohos (Geotrichum spp.,
Penicillium spp., etc.), y otros microorganismos acidfilos para su desarrollo, pudiendo crecer entonces otros gneros o especies
microbianas diferentes, de caractersticas aerobias y anaerobias, determinndose un proceso de putrefaccin que transforma la
leche y hace variar sus caracteres organolpticos (color, olor y sabor). La microbiota que logra desarrollarse abundantemente da
lugar a algunas modificaciones (Tabla 3).
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Tabla 3. Alteraciones de origen microbiano ms frecuentes observadas en la leche y que producen modificaciones.
Alteracin Proceso de alteracin
Los grmenes responsables son de tipo moho y heterolctico; entre los 10 y 37C, los
microorganismos que intervienen son: Streptococcus lactis, asociado a veces con coliformes,
Agriado y enterococos, micrococos y lactobacilos. Por encima de 37C intervienen Streptococcus
acidificacin del thermophilus, Streptococcus faecalis y Lactobacillus bulgaricus. En leche pasteurizada, intervienen
coagulo. microorganismos termfilos que han resistido la accin del calor o microorganismos esporulados
como Bacillus spp., y Clostridium spp. Si se observa desprendimiento de gases, se conlcuye que en
el proceso han intervenido grmenes heterofermentativos.
Se favorece por el almacenamiento prolongado de la leche a baja temperatura; se manifiesta por su
Protelisis. olor y una ligera alcalinizacin. La microbiota incriminada pertenece a los gneros: Micrococcus
spp., Alcaligenes spp., Pseudomonas spp., Bacillus spp., y Clostridium spp.
Esta alteracin se puede producir tambin por causas no bacterianas (exceso de crema o
coagulacin de la lactoalbmina por calentamiento), por accin microbiana directa (paso de
leucocitos y fibrina a la leche como consecuencia de una mastitis), y por accin microbiana directa,
Leche filante.
originada por: Alcaligenes viscosus, Micrococcus freudenreichii, Micrococcus mucofaciens, algunas
cepas de Aerobacter aerogenes, Streptococcus lactis, Lactobacillus spp., y Leuconostoc spp. La
alteracin se manifiesta por el aumento de la viscosidad que hace a la lecha filante.
- Amarilla: Pseudomonas synxanta, Flavobacterium spp., y Xanthomonas spp.
Coloraciones - Azulada o gris azulado: Pseudomonas syncyanea y Pseudomonas aeruginosa.
extraas. - Roja: Serratia marcescens, Brevibacterium erythrogenes y Pseudomonas spp.
- Violeta: Chromobacterium violaceum.
Estas coloraciones se deben en parte, al tipo de alimentacin del animal y en parte a la
contaminacin de la leche:
- Olor a fruta: Pseudomonas fragi, Flavobacterium lactis, Bacillus estenificans (que produce olor a
pia).
- Olor a rancio: Crecimiento de grmenes lipolticos como Pseudomonas spp., y Bacillus cereus.
Modificaciones del
- Olor y sabor a pescado: Debido a la formacin de trimetilamina en la leche (Pseudomonas spp.,
sabor o el olor.
y Torulopsis amara).
- Olor y sabor a casena: Micrococcus caseolyticus.
- Sabor amargo: Bacillus liquefaciens lactis amari, Micrococcus casei amari y Torulopsis amara.
- Olor a Urea y Amonaco: Pseudomonas fluorescens, Alcaligenes faecalis.
- Sabor a caramelo: Streptococcus lactis var. maltigenes.
- Sabor a jabn: Bacillus lactis saponacei y Pseudomonas putida.
Definiciones de algunos derivados lcteos.
Leche natural. Se entiende por leche natural, el producto ntegro, no alterado ni adulterado y sin calostros del ordeo higinico,
regular, completo e ininterrumpido de vacas sanas y bien alimentadas.
Leche certificada. Es la leche procedente de ganaderas certificadas y/o de sanidad comprobada, en las que los procesos de
produccin, obtencin, envasado y distribucin, estn sometidos a riguroso control sanitario oficial que, garantiza la inocuidad y
valor nutritivo.
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Leche pasteurizada. Es la leche natural, entera, desnatada o semidesnatada, sometida a un proceso tecnolgico adecuado que
asegure la destruccin de los microorganismos patgenos y casi la totalidad de microbiota banal, sin modificacin sensible de su
naturaleza fisicoqumica, caractersticas biolgicas y cualidades nutritivas.
Leche concentrada. Se entiende por leche concentrada, la leche natural, entera, desnatada o semidesnatada, pasterizada y
privada de parte de su agua de constitucin.
Leche esterilizada. Se entiende por la leche natural, entera, desnatada o semidesnatada, sometida despus de su envasado a un
proceso de calentamiento en condiciones tales de temperatura y tiempo que, aseguren la destruccin de los microorganismos y la
inactividad de sus formas de resistencia.
Leche UHT. Se entiende por leche UHT, la leche natural, entera, desnatada o semidesnatada, sometida a un proceso de
calentamiento en condiciones tales de temperatura y tiempo que aseguren la destruccin de los microorganismos y la inactividad
de sus formas de resistencia y envasada posteriormente en condiciones aspticas.
Leche en polvo. Es el producto seco y pulverulento que se obtiene mediante la deshidratacin de la leche natural entera,
desnatada o semidesnatada, sometida a un tratamiento trmico equivalente al menos a la pasteurizacin y realizado en estado
lquido antes o durante el proceso de fabricacin.
Yogur. O Yoghourt, es el producto de leche coagulada, obtenido por fermentacin lctica mediante la accin de Lactobacillus
bulgaricus y Streptococcus thermophilus, a partir de leche pasteurizada, leche concentrada pasteurizada, leche total o parcialmente
desnatada pasteurizada, leche concentrada parcial o totalmente desnatada, con o sin adicin de nata pasteurizada, leche en polvo
entera semidesnatada o desnatada, suero en polvo, protena de leche y/u otros productos procedentes del fraccionamiento de la
leche. Los microorganismos productores de la fermentacin lctica deben ser viables y estar presentes en el producto terminado
en una cantidad mnima de 1x107 colonias/g mL. Todos los yogures deben tener un pH igual o inferior a 4.6.
Nata. Se entiende por nata, en general, al producto lcteo rico en materia grasa separado de la leche, que toma la forma de
emulsin del tipo grasa en agua.
Nata en polvo. Es el producto seco y pulverulento que se obtiene mediante la deshidratacin de la nata, pasterizada en estado
lquido, antes o durante el proceso de fabricacin.
Mantequilla. Es el producto graso obtenido exclusivamente de leche o nata de vaca, higienizadas.
Queso. El producto fresco o maduro, slido o semislido, obtenido por separacin del suero despus de la coagulacin de la leche
natural, de la desnatada total o parcialmente, de la nata, del suero de mantequilla o de una mezcla de algunos o de todos estos
productos por la accin del cuajo u otros coagulantes apropiados, con o sin hidrlisis previa de la lactosa.
As mismo, se entiende por queso el conseguido mediante tcnicas de elaboracin que, comprendan la coagulacin de la leche y/o
de materias obtenidas de la leche y que den un producto final que posea las mismas caractersticas del producto definido
anteriormente y siempre que la relacin entre la casena y las protenas sricas sea igual o superior a la de la leche.
Queso curado o madurado. Es el queso que, tras el proceso de fabricacin, requiere mantenerse durante cierto tiempo a una
temperatura y en condiciones tales que se produzcan los cambios fsicos y/o qumicos necesarios y caractersticos del mismo.
Queso curado o madurado con mohos. Es aquel en el que el curado se ha producido principalmente como consecuencia del
desarrollo caracterstico de mohos en su interior y/o sobre la superficie del mismo.
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Queso Fresco. Es el queso que est dispuesto para el consumo al finalizar el proceso de fabricacin.
Queso Fundido. Se entiende por queso fundido, el producto obtenido por molturacin y/o mezcla, fusin y emulsin con
tratamiento trmico de una o ms variedades de queso, con o sin adicin de agentes emulgentes, de leche y productos lcteos y
otros productos alimenticios.
Cuajada. Es el producto semislido, obtenido de la leche sometida a tratamiento trmico adecuado para conseguir las
caractersticas bacteriolgicas que se fijan posteriormente; entera o desnatada total o parcialmente, coagulada por la accin del
cuajo y otras enzimas coagulantes autorizadas, sin adicin de fermentos lcticos y sin proceso de desuerado.
Otros: Arequipe, leches saborizadas, helados, kumis, etc.
Enzimas coagulantes.
Enzimas coagulantes de la leche son las de origen animal, vegetal o microbiano y sus mezclas, capaces de provocar el
desdoblamiento de la molcula de casena, bajo las condiciones tecnolgicas habituales en el proceso al que van destinadas.
Estas son de dos clases: El cuajo, que es el producto lquido, pastoso o slido, cuyo componente activo est formado por la mezcla
de las enzimas obtenidas por extraccin de los cuajares de rumiantes exclusivamente y los coagulantes de leche, que son los
productos lquidos, pastosos o slidos, cuyo componente activo est formado por otra(s) enzima(s) diferente(s) de las incluidas en
el apartado anterior.
MICROBIOLOGA DE LOS DERIVADOS LCTEOS.
Por ser productos obtenidos en algunas ocasiones a partir de la leche cruda y si no se realizan tratamientos adecuados para la
reduccin o eliminacin de grmenes de la misma, se pueden encontrar remanentes de microorganismos asociados a la alteracin
de estos productos o al peligro por la presencia de patgenos.
Entre los microorganismos asociados al agriado y otros tipos de alteraciones se encuentran Streptococcus thermophilus, S. lactis,
Lactobacillus bulgaricus, entre otros. Los gneros Bacillus spp., y Clostridium spp., son productores de agriado y gas; mientras
que, Enterococcus faecalis y Proteus spp., son causantes de la protelisis y su consecuente sabor amargo.
La mantequilla, que es un producto estable en comparacin con otros debido a su baja humedad (15% aproximadamente), tambin
puede ser alterada, principalmente por bacterias psicrotrficas, hongos y sus enzimas, como: Pseudomonas fragi y Pseudomonas
putrefaciens, las cuales son causantes del enranciamiento y superficie ptrida, respectivamente; adems de, otros bacilos Gram
negativos afines. Los mohos son pertenecientes principalmente a los gneros Alternaria spp., Aspergillus spp., Rhizopus spp.,
Geotrichum spp., Penicillium spp., Cladosporium spp., y Mucor spp.; as como, algunas levaduras del gnero Torulopis spp. Este
tipo de microorganismos, producen liplisis y coloraciones verdes, azules, blancas o grises, esto dependiendo del color de sus
esporas.
Existen unas 400 variedades de quesos agrupados en aproximadamente 20 categoras, elaborados la mayora con la misma leche,
pero variando los cultivos, enzimas y otros factores de fabricacin; si los gneros lcticos se encuentran en cantidades altas en los
quesos, se presenta una fermentacin lctica durante el proceso de elaboracin. En estas mismas etapas otros microorganismos
pueden causar malos olores y gas; entre estos microorganismos asociados al deterioro se encuentran Aerobacter aerogenes,
Clostridium sporogenes que ocasiona putrefaccin, Bacillus proteolyticum que puede ocasionar color oscuro y olor desagradable.
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En algunos quesos el crecimiento de Lactobacillus plantarum o L. brevis, producen manchas de aspecto oxidado en la superficie.
En los derivados con altos contenidos de azcar como la leche condensada y el arequipe, los microorganismos no tienen un medio
de fcil crecimiento y solo cuando las condiciones del envase y la manipulacin no son adecuadas se puede presentar la entrada y
crecimiento de hongos y levaduras osmoflicas especialmente en la superficie (Torulopsis lactis-condensi, Torulopsis globula y
mohos como Aspergillus spp., y Penicillium spp.).
En los helados y postres, la contaminacin es casi nula, pues en la fabricacin de estos productos, los ingredientes se mezclan y
pasteurizan (ingredientes que aportan contaminacin); posteriormente, son congelados y si este proceso es rpido e
inmediatamente despus de la pasterizacin, las alteraciones se harn prcticamente imposibles.
En los yogures, se debe evitar la produccin excesiva de cido almacenando a 4C, con el fin de limitar el desarrollo de los cultivos
iniciadores (un pH muy bajo altera el aroma del yogur). Esta acidez natural del producto, no permite el desarrollo de
microorganismos alterantes y/o patgenos que no soportan las condiciones. Los mohos y las levaduras pueden no verse afectadas
por las condiciones de acidez, por lo que en ocasiones pueden desarrollarse en estos productos.
La mayora de los derivados lcteos se fabrican con leche tratada trmicamente, pero este proceso de destruccin de
microorganismos algunas veces no es eficiente, ya que existen microorganismos resistentes a estos procesos (microorganismos
termodricos), como Streptococcus thermophilus, Micrococcus luteus, Corynebacterium lacticum, junto con esporas de Bacillus
spp., y Clostridium spp. En los tratamientos UHT, puede presentarse la sobrevivencia de esporas de Bacillus stearothermophillus y
Bacillus subtilis.
ACTIVIDAD PRCTICA.
Materiales y equipos.
Muestras: Leche cruda, leche pasteurizada, leche ultrapasteurizada, leche saborizada, leche condensada, leche en polvo,
mantequilla, crema de leche, queso doble crema, queso fresco y yogur.
- Stomacher o licuadora que permita una buena homogenizacin.

- Recipiente de vidrio esterilizable(o bolsas de polietileno para Stomacher).
- Balanza de precisin 0.1 g.
- Para preparacin de muestras: cuchilla, tijeras, cuchillo y tenedor previamente esterilizados.
- Pipetas de 1mL estriles.
- Pipetas de 10 mL estriles.
- Frascos con diluyente (Agua peptona 0.1% estril).
- Cajas Petri estriles.
- Asas bacteriolgicas y micolgicas.
- Asas de vidrio.
- Bao de agua (45C - 50C).
- Incubadora.
- Contador de colonias.
- Agar para recuento en placa Standard Plate Count (SPC).
- Agar Violeta Rojo Bilis (VRB), o Eosina Azul de Metileno (EMB), para recuento de E. coli.
- Agar OGY o Sabouraud par recuento de mohos y levaduras.
- Agar OPSP, SPS (Sulfito Polimixina Sulfadiazina) o agar Anaerbico para recuento de E.C.S.R.
- Cajas Petri con agar Baird Parker, Salado Manitol para recuento de S. aureus.
- Cajas Petri con agar DNAsa.
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- Cajas con agar Mossel o Selectivo para B. cereus.

- Cajas con agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD), Rambach o Desoxicolato.
- Erlenmeyer con 225 mL de agua peptona 1%.
- Tubos con 10 mL de caldo Tetrationato, Rapapport o Selenito Cistina para deteccin de Salmonella spp.
- Tubos con 0.5mL de caldo BHI (Brain Heart Infusion).
- Tubos taparosca con agar inclinado Citrato de Simmons, LIA y TSI.
- Tubos taparosca con agar SIM, recto.
- Tubos con caldo Rojo de Metilo-Voges Proskauer.
- Tubos con caldo KCN
- Tubos con caldo Urea.
- Tubos con caldo Nitrato.
- Tubos con caldo Rojo de Fenol + 0.5% de Dulcitol.
- Tubos con Caldo Rojo de Fenol + 1% de Lactosa.
- Tubos con Caldo Rojo de Fenol + 1% de Sacarosa.
- Tubos con Caldo LMX-Fluorocult o BRILA con campana Durham.
- HCl 1N.
- KOH 40%.
- Reactivo de kovacs.
- Reactivo de Griess.
- Polvo de zinc.
- Reactivo Rojo de Metilo
- Reactivo -naftol-5%.
PROCEDIMIENTO.
- Prepare adecuadamente el sitio de trabajo en el laboratorio y desinfeste el empaque en el cual se encuentra contenido el
producto a analizar.
- Preparar la muestra a analizar y realizar diluciones de los homogenizados hasta 10-4.
- De acuerdo al producto a analizar, realizar los anlisis correspondientes citados en la tabla de Criterios Microbiolgicos
(Anexo A), considerando par cada caso las siguientes detecciones y recuentos: Aerobios Mesfilos (en placa profunda),
coliformes (NMP), mohos y levaduras (en placa profunda), S. aureus (en placa en superficie), Bacillus cereus (en placa en
superficie), E.C.S.R (en placa profunda), y Salmonella (ausencia-presencia).
- Pipetear por duplicado en cajas Petri, alcuotas de las diluciones seleccionadas para realizar los anlisis. Recuerde
homogenizar correctamente las cajas, cuando se aplique placa profunda y extender el inculo con el asa de vidrio cuando se
inocula la superficie del agar (tcnica en superficie).
- Como prueba de la esterilidad de los medios utilizados, vierta 15mL de cada agar utilizado en una caja Petri sin muestra y
como control de los caldos, tubos con medio diluyente sin inocular (testigos).
- Invierta las cajas Petri de cada prueba e incbelas a la temperatura adecuada de acuerdo al anlisis realizado.
- Pasado el tiempo de incubacin, proceda a realizar el conteo de las colonias presentes en cada una de las cajas (cuando el
anlisis as lo requiera). Realice el clculo de los recuentos y reporte correctamente los resultados.
- Proceda a realizar confirmaciones de los anlisis que lo ameriten e incube estas pruebas a la temperatura y tiempo
apropiados.
NOTA: El tiempo transcurrido entre el momento de depositar las distintas diluciones en las placas y verter sobre ellas el medio de
cultivo no debe ser superior a 10 minutos, as como, la extensin de los inculos con el asa de vidrio en la superficie de los agares
debe ser inmediata. Del mismo modo, no se superarn los 20 minutos desde que se prepara la primera dilucin de la serie, hasta
que se vierte el agar en la ltima placa.
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Tcnica de Siembra en Placa Profunda para el recuento de E.C.S.R.
Esta tcnica es utilizada cuando se sospecha que el alimento a analizar puede contener una poblacin del microorganismo mayor
a 100 UFC/g mL.
- Prepare diluciones iguales a 10-1, 10-2 y 10-3 a partir de la muestra.

- Siembre por duplicado 1 mL de las diluciones 10-1 y 10-2 en el fondo de una placa de Petri.
- Adicione 15 mL de agar fundido SPS, OPSP, agar selectivo para C. perfringens (o el agar seleccionado para el anlisis; ver
Anexo C), y homogenice el inculo en el agar fundido, realizando movimientos circulares a la placa Petri.
- Cuando las placas hayan solidificado, dispngalas en una jarra de anaerobiosis, prepare el sistema de anaerobiosis e
introdzcalo en la jarra simultneamente con el indicador de la anaerobiosis; cierre correcta e inmediatamente la jarra.
- Incube las placas a 43 2C / 24-48 2 h.
- Pasado el tiempo de incubacin, retire las cajas de la incubadora y de la jarra; seleccione las cajas que presenten entre 15 y
300 colonias aisladas de color negro y de 1 a 3 mm de dimetro; pueden presentarse planas, algo rizoides y elevadas en el
centro. Proceda a realizar la prueba confirmativa.
Prueba de confirmacin de las colonias para Clostridium perfringens.
- Tome como mnimo tres colonias tpicas para ensayar; inocule en caldo Tioglicolato por 4 horas a 46C en bao de agua o
toda la noche a 35-37C (Anexo C).
- Realice extensiones y talas con los colorantes de Gram y de Schaeffer Fulton. Posterior a las tinciones, se deben observar
clulas Gram-positivas, con forma bacilar, grandes y de extremos redondeados, con presencias de esporas subterminales no
deformantes. La observacin de esporas es difcil de lograr, para ello se recomienda sembrar en agar inclinado Carne Cocida e
incubarlo a 30C / 5-7d en condiciones de anaerobiosis.
- Una vez comprobada la morfologa, se procede a sembrar las pruebas bioqumicas: Caldo Nitrato, agar Gelatina, agar SIM,
agar Sangre (en general de las pruebas tpicas de las cuales se disponga). Incubar las pruebas a 43 2C / 18-24 horas en
condiciones de anaerobiosis.
- Realizar la prueba de Catalasa, adicionando a una colonia emulsionada en portaobjetos una solucin de Perxido de
Hidrgeno al 3%.
- Compare los resultados obtenidos con las reacciones bioqumicas registradas en la literatura cientfica y concluya.
Tcnica del Nmero Ms Probable.
Este mtodo es empleado para el anlisis de los alimentos de los cuales se sospecha puedan presentar un nmero menor a 100
UFC/g mL, de este microorganismo. Para esta tcnica se utilizan los medios DRCM, SPS, OPSP y las bateras bioqumicas para
su identificacin.
Prueba Presuntiva.
- A partir de las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3, siembre 1mL de cada una sobre tres tubos conteniendo 10 mL de caldo DRCM
(Caldo Diferencial Reforzado para Clostridium).
- Cubra cada tubo con parafina estril (vaselina o aceite mineral estril), y deje solidificar, con el fin de lograr condiciones de
anaerobiosis. En este medio se detecta el cambio de atmsfera, por el cambio del color rosado del caldo a amarillo, durante
las primeras horas de incubacin.
- Incube todos los tubos como mnimo a 30C (46C), por 24-48h. El ennegrecimiento del medio, pone de manifiesto la posible
presencia de C. perfringens, al producirse cido Sulfhdrico que se combina con el hierro presente en el caldo, originando
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Sulfuro de Hierro que es de color negro. Realice la lectura de los tubos que se observan ennegrecidos y confronte los
resultados con la Tabla del NMP.
Prueba Confirmativa.
- De los tubos que a las 48 horas presenten ennegrecimiento, remueva la capa de parafina (vaselina o aceite mineral), y con
una pipeta estril, proceda a sembrar 1mL de cada tubo en una placa de Petri, a la cual posteriormente adicionar agar SPS,
OPSP u otro medio para Clostridios, fundido. Incube en condiciones de anaerobiosis a 43 2C / 24-48h, realizando una
primera lectura a las 24 horas.
Prueba Final.
Contine al igual que el procedimiento de siembra en placa profunda.
Modificaciones a la metodologa. Una modificacin a la tcnica consiste en tratar trmicamente todos los tubos sembrados,
antes de incubarlos, a una temperatura de 60C por 30 minutos e incubarlos a 30C por mnimo 7 das. Aqu la mayora de los
cultivos positivos se pueden observar al cabo de 3 o 4 das. Las observaciones posteriores debern prolongarse hasta cuatro
semanas, porque la germinacin de las esporas puede tardar mucho tiempo. La identificacin se debe continuar con otros
exmenes.
Con el fin de asegurar un poco ms los resultados en el recuento en placa, se pueden someter las diluciones a un choque trmico
a 60C/15 min., para destruir formas vegetativas y pre-activar formas esporuladas. A continuacin, se siembra en profundidad y se
incuba en las condiciones anteriormente mencionadas. Las colonias formadas posteriores a este proceso, son originadas por las
formas esporuladas anaerobias; se realizan confirmaciones morfolgicas, reaccin de Gram y pruebas bioqumicas, para descartar
otras especies de Clostridium o de bacterias termorresistentes facultativas.
Resultados.
Recuento en placa profunda. Para informar tenga en cuenta los resultados de las pruebas bioqumicas y tenga en cuenta para el
informe, aplicar el factor de correccin utilizado para S. aureus.
a donde,
N = ________________________
V (n1 + (0.1*n2)) d
N: Nmero total de UFC de Clostridium perfringens por gramo o mililitro de la muestra.

a: Sumatoria del nmero de colonias tpicas en cada caja examinada.
V: Volumen de muestra inoculada
n1: Nmero de cajas retenidas en la primera dilucin.
n2: Nmero de cajas retenidas en la segunda dilucin.
d: Factor de dilucin de la primera dilucin empleada en el recuento.
b
a= * C, donde:
A
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b: Nmero de colonias identificadas como positivas de acuerdo al criterio microbiolgico.

A: Nmero de colonias examinadas.
C: Nmero de colonias contadas en cada una de las cajas retenidas.
Nmero Ms Probable. Para el NMP tenga en cuenta los tubos positivos (presuntivo), colonias tpicas en medios slidos
(confirmativo), y el resultado de las pruebas bioqumicas (final). Reporte los resultados remitindose a la Tabla del NMP y exprese
como: Grmenes Clostridium perfringens/g.
NOTA: No olvide que para el anlisis de esporas de Clostridium Sulfito Reductores (E.C.S.R.), debe contar con jarras de
anaerobiosis, sistemas de anaerobiosis e indicadores de atmsfera (indicadores de anaerobiosis); as como, los reactivos
reveladores de las pruebas que se presenten en los medios de cultivo utilizados.
Anlisis de Staphylococcus aureus coagulasa positivos.
Recuento en placa en superficie.
Esta tcnica es utilizada cuando se sospecha que el alimento a analizar contiene una alta poblacin del patgeno (>100 UFC/g
mL)
- Preparar diluciones iguales a 10-1, 10-2 y 10-3.

- Sembrar por duplicado 0.1mL de las diluciones 10-1 y 10-2 en la superficie de agar Baird Parker, Salado Manitol o el medio
seleccionado para el anlisis.
- Con la ayuda de las asas de hockey extender sobre toda la superficie, esperar 10 minutos hasta que el inculo sea absorbido
por el agar; en caso contrario, incubar las cajas con la tapa hacia arriba por 1h hasta que este absorba.
- Incube las cajas en posicin invertida a 35+/- 2C por 24-48h.
- Pasado el tiempo de incubacin seleccione las cajas que presenten entre 15 300 colonias aisladas (ICONTEC), o 20 200
colonias aisladas (MinSalud); realice el conteo de dichas colonias.
- En agar Salado Manitol las colonias que deben ser contadas aparecen de color amarillo por viraje del medio y de apariencia
cremosa. En agar Baird Parker las colonias tpicas son de 2-3 mm de dimetro, redondas, lisas, convexas, negras y brillantes,
y con halos precipitados opacos reducidos y un halo exterior claro que contrasta con el medio de cultivo opaco. Las colonias
tiene apariencia gomosa cuando se manipulan con asa bacteriolgica. Las colonias aisladas de helados o comidas
deshidratadas que generalmente se almacenan por periodos prolongados de tiempo, se desarrollan de color menos negro que
las colonias tpicas y pueden tener apariencia spera y textura seca. En agar Vogel Johnson, se presentan colonias de color
negro con halos amarillos debidos a la fermentacin del manitol.
- Marcar la posicin de las colonias tpicas contadas e incubar por 18 horas adicionales.
- Contar todas las colonias que presentan el aspecto antes mencionado y que se han desarrollado durante la incubacin
adicional. Las colonias que no presenten caractersticas tpicas deben ser contadas independientemente.
- Tomar un mnimo de tres colonias tpicas y atpicas y realizar con ellas la prueba de coagulasa. Para realizar la prueba,
siembre cada una de las colonias a examinar sobre la superficie de agar TSA o agar Nutritivo e incube a 35C/24h.
Tcnica del Nmero Ms Probable (NMP), para S. aureus.
Este mtodo es empleado para el anlisis de alimentos en los cuales se sospecha un nmero menor a 100 UFC/g mL del
patgeno, utilizando los medios lquidos: Giolitti Cantoni o Tripticasa de Soja con 10% de NaCl y 1% de Piruvato de Sodio;
parafina estril, agar Baird Parker, agar DNAsa y pruebas de coagulasa.
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Prueba Presuntiva.
- A partir de las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3, sembrar 1mL sobre las tres series de tubos (c/u de tres tubos), conteniendo alguno
de los caldos mencionados.
- Cubrir los tubos con parafina estril y dejar solidificar. Esto se hace con el fin de evitar el crecimiento de Micrococcus spp.
- Incubar los tubos a 35+/- 2C/24-48h.
- Realizar la lectura de los tubos pasado el tiempo de incubacin. El ennegecimiento del caldo Giolitti Cantoni pone de manifiesto
la posible presencia de S. aureus o la presencia de turbidez en el caldo TSA. Confronte los resultados con la Tabla del NMP.
Prueba Confirmativa.
- De los tubos que a las 48h, presenten ennegecimiento, remover la capa de parafina y con una pipeta sembrar 0.1mL en placas
Petri con agar Baird Parker o Salado Manitol.
- Incubar a 35+/- 2C/24-48h., realizando una lectura a las 24h. Observar colonias tpicas de acuerdo al medio utilizado (ver
apartado de recuento en placa en superficie para S. aureus).
- Informar como S. aureus: NMP/g o NMP/mL, dependiendo de si la muestra es lquida o slida.
Confirmacin de Coagulasa Termonucleasa. La presencia de la enzima coagulasa, as como, la DNAsa, son indicadoras
primarios de la presencia de S. aureus, productores de enterotoxinas. Por esto, se debe realizar esta confirmacin en los
alimentos, para determinar la presencia de dichas cepas toxignicas y de la cuanta existente de la misma.
a) Prueba de coagulasa. La coagulasa es una enzima proteica similar a la protombina; capaz de transformar el fibringeno en
fibrina y provocando la formacin de un cogulo visible en un sistema analtico adecuado. Esta prueba es til para identificar S.
aureus coagulasa positivos de otros estafilococos coagulasa negativos. Esta enzima se puede encontrar de dos formas: Libre y
ligada o camping factor, cada una de las cuales poseen diferentes propiedades que requieren el uso de diferentes tcnicas para
ser detectadas.
- Coagulasa fija: Se lleva a cabo en portaobjetos y es una enzima que est unida a la pared celular bacteriana. Los hilos de
fibrina formados entre las clulas suspendidas en el plasma (que contiene el fibringeno), provocan su aglutinacin, que se
revela por la presencia de cmulos visibles en el portaobjetos.
Prueba en Portaobjetos: Para esta prueba se coloca una gota de agua destilada estril en la lmina y con ayuda de un asa
se transfiere y homogeniza una porcin del crecimiento de cada colonia a examinar del agar TSA; a continuacin, se adiciona
una gota de plasma reconstituido, junto a la gota del microorganismo; se mezclan bien y se inclina el portaobjetos hacia uno y
otro lado, observando la formacin inmediata de un precipitado granular blanquecino. Una reaccin positiva se detecta entre
los 15 a 20 segundos y se considera negativa si dentro del plazo de 2 a 3 minutos no se observa ningn proceso de
aglutinacin. Esta prueba es solo presuntiva y todos los cultivos negativos o positivos tardos, deben ser verificados mediante
pruebas en tubo.
- Coagulasa libre: Es una enzima extracelular que se halla presente en los filtrados de los cultivos. Cuando una suspensin de
bacterias se mezcla en partes iguales con plasma en un tubo, se forma un coagulo visible como consecuencia de la utilizacin
del plasma por los factores de coagulacin; de manera similar a cuando se aade trombina.
Prueba en Tubo: Esta prueba se realiza tomando una porcin de la colonia a examinar y se suspende en 0.5mL de caldo
BHI, se incuba a 35C / 18-24h; pasado este tiempo se toma aspticamente 0.3 - 0.5mL de plasma reconstituido en un tubo y
se adiciona igual cantidad del cultivo de 24h de S. aureus en BHI. Se agita suavemente el tubo para homogenizar la mezcla,
se coloca en un bao de agua o en incubadora a 35+/- 2C, observando cada hora los tubos durante 4 horas y
posteriormente, a las 24 horas si no se ha presentado disminucin de la fluidez del contenido de los tubos o formacin de
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cogulos. Para esta prueba se recomienda realizar controles positivos y negativos (tubo con plasma solamente). Una prueba
positiva definitiva, es aquella que presenta una reaccin de 1/3 del medio coagulado.
b) Determinacin de Termonucleasa (Desoxirribonucleasa). Los mtodos ms usuales para la determinacin de S. aureus en

los alimentos consideran la positividad de la prueba de coagulasa como una identificacin definitiva de dicha bacteria. Sin
embargo, existen algunas dificultades en la interpretacin de dicha prueba. Se ha encontrado por otra parte que, S. aureus produce
una enzima, la Desoxirribonucleasa, que se caracteriza por ser una enzima termoestable y exclusiva de esta bacteria. El pH
ptimo para la formacin de esta enzima es 8.3 y se ha demostrado la relacin entre la produccin de esta y la formacin de
coagulasa, aunque recientemente se ha detectado la presencia de esta enzima en cepas S. aureus coagulasa negativos. Se dice
que del 95 al 100% de cepas enterotoxignicas producen DNAsas termoestables.
Deteccin mtodo A: A partir de las colonias crecidas en medio TSA, se siembra en estras radiales o en una sola estra sobre
una placa de agar DNAsa. Incubar a 35+/- 2C/18-24h. Pasado este tiempo se revelan las placas adicionando HCl 1N, sobre las
lneas de crecimiento; la aparicin de zonas claras alrededor de las colonias indica la produccin de la enzima. Tambin, se puede
utilizar azul de toluidina para revelar las placas, caso en el cual aparecern zonas de color rosado alrededor del crecimiento
indicando la positividad de la prueba.
Deteccin mtodo B: Luego de preparar las placas con agar DNAsa y una vez solidificados y secados en estufa, con ayuda de un
tubo capilar estril de 2 mm de dimetro, se practican varias perforaciones, eliminando los tapones del agar. De cada uno de los
cultivos de caldo BHI utilizados en la prueba de coagulasa y previamente hervidos por 15 minutos en un bao de agua, se toman
con una micropipeta 3 microlitros de caldo y se depositan en cada una de las perforaciones. Se inocula una cepa control positivo
de S. aureus enterotxico y otra control negativo; se incuban las placas a 35+/- 2C/18-24h y se revela con HCl 1N. La aparicin
de una zona transparente alrededor de las perforaciones es indicativo de una prueba positiva (tambin puede utilizarse azul de
toluidina, observndose zonas rosadas en pruebas positivas).
Pruebas complementarias.
1. Catalasa. Use el crecimiento de TSA (o AN), y coloque una porcin del mismo sobre una gota de agua destilada estril
ubicada en el centro de un portaobjeto de vidrio, emulsione y adicione H 2O2 al 3%, ilumine por debajo para observar produccin
de burbujas de gas propiamente.
2. Utilizacin anaerobia de glucosa. Inocule un tubo de medio de fermentacin de carbohidratos que contenga glucosa al 0.5%.
Inmediatamente inocule cada tubo con una suspensin del crecimiento sobre agar TSA con ayuda de un asa de aluminio; lleve
el inculo al fondo del tubo. Adicione parafina estril de por lo menos 25 mm de espesor e incube 5 das a 37C. El cido se
produjo anaerbicamente si, el indicador cambia para tornarse amarillo (el medio contiene rojo de fenol como indicador de pH).
3. Utilizacin anaerobia de manitol. Repita la prueba nmero 2, pero reemplace el carbohidrato por manitol. S. aureus
usualmente resulta positivo, aunque algunas cepas son negativas para esta prueba.
4. Sensibilidad a la Lisostafina. Traslade una porcin del crecimiento del agar TSA a un tubo con 0.2mL de solucin Buffer
fosfato salino y emulsinela. Transfiera la mitad (0.1mL de la solucin anterior), de las clulas suspendidas a otro tubo.
Adicione 0.1mL de Lisostafina (disolver en Buffer fosfato salino 0.02M que contiene 1% de NaCl), e incube por 2 horas. Si la
turbiedad aparece en la muestra, la prueba es considerada como negativa para la sensibilidad. Si no se presenta turbidez en
2 horas, la prueba es positiva (S. aureus generalmente es positivo).
Resultados.
Recuento en placa en superficie: Calcular el nmero total de S. aureus coagulasa positivo, teniendo en cuenta el nmero total
de colonias tpicas crecidas en cada una de las cajas Petri, el nmero de colonias examinadas y el nmero de colonias positivas,
de la siguiente forma:
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a
N = ________________________ donde,
V (n1 + (0.1 * n2)) d
N: Nmero total de UFC de S. aureus coagulasa positivo por gamo o mililitro de la muestra.
a: Sumatoria del nmero de colonias tpicas en cada caja examinada.
V: Volumen de muestra inoculada
n1: Nmero de cajas retenidas en la primera dilucin.
n2: Nmero de cajas retenidas en la segunda dilucin.
d: Factor de dilucin de la primera dilucin empleada en el recuento.
b
a= * C, donde:
A
b: Nmero de colonias identificadas como positivas de acuerdo al criterio microbiolgico.

A: Nmero de colonias examinadas.
C: Nmero de colonias contadas en cada una de las cajas retenidas.
Nmero Ms Probable: De acuerdo al nmero de tubos positivos, leer en la Tabla del NMP placas de agar BP que presenten
Staphylococcus aureus y prueba de coagulasa positiva, leer de nuevo en la Tabla de NMP. Recuerde que los mtodos usuales
para la deteccin de S. aureus en alimentos consideran la positividad de la prueba de coagulasa como una identificacin definitiva
del microorganismo. Exprese los resultados como NMP/ g mL de S. aureus. Realice el reporte de acuerdo al siguiente ejemplo:
Diluciones**
Etapa Aspecto a evaluar NMP de la tabla Reporte final
10-1 10-2 10-3
Presuntiva (Caldo
Ennegrecimiento de los tubos. 3/3 2/3 1/3 150 bact./ g mL.
GC)*
NMP de Staphylococcus
Confirmativa (agar Crecimiento colonias tpicas por cada tubo
2/3 1/2 1/1 20 bact./ g mL. aureus coagulasa positivos:
BP)* sembrado
7.4 bacterias /g mL.
Final (BHI Coagulasa positivo por cada colonia
1/2 1/1 0/1 7.4 bact./ g mL.
+plasma) examinada
* Medios Utilizados: caldo Giolitti Cantoni (GC), y agar Baird Parker (BP).
** El resultado por dilucin est registrado como positivos/totales.
Anlisis de Bacillus cereus.
Recuento en placa en superficie.
Esta tcnica se utiliza cuando se sospecha que el alimento contiene ms de 10 UFC de Bacillus cereus por gramo de muestra y de
la siguiente forma.
- Preparar la serie de diluciones decimales.

- A partir de la serie de diluciones y por duplicado, depositar 0.1mL de cada una sobre la superficie seca de Agar Mossel o Agar
selectivo para Bacillus cereus.
- Diseminar el inoculo con ayuda del asa de vidrio y dejar reposar 15 minutos.
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- Incubar a 30+/- 1C/24-48h.

- Hacer el recuento de colonias tpicas de la siguiente forma:
- En agar Mossel (inicialmente rosado), las colonias tpicas son de color rosado cremosas rodeadas de un halo de
precipitacin blanco denso y una gama de tono rojo violeta al fondo.
- En agar selectivo para Bacillus cereus (verde azulado), las colonias tpicas aparecen de color azul, cremosas con halo
denso alrededor (lecitinasa positivas).
- De las colonias tpicas, sembrar por estra de tres a cinco colonias sobre agar Nutritivo, para hacer la confirmacin posterior e
incubar a 30C+/-1C/24h.
Confirmacin bioqumica.
Partiendo del crecimiento obtenido en agar nutritivo de cada colonia, realice las siguientes pruebas:
- Tincin de Gram y de esporas.

- Con asa recta sembrar en tubos con agar BHI por puncin y cubrir con parafina estril. Incubar a 30C+/-1C/ 7 das,
observando cada da crecimiento sobre la lnea de puncin.
- Sembrar un tubo con Caldo Glucosa Tamponado (sin fosfato), e incubar a 30C+/- 1C/24-8h. En este tubo, detectar la
formacin de Acetilmetilcarbinol (prueba de Voges Proskauer), adicionando 0.6mL de -naftol-5% y 0.2mL de KOH-40%, para
revelar la prueba.
- Sembrar por suspensin caldo Nitrato, caldo Glucosa, caldo Xilosa, caldo Arabinosa, e incubar a 30C+/-1C/24-48h y revelar.
- Sembrar sobre superficie de agar Almidn, agar CASO, agar SIM, agar TSI y en agar Gelatina e incubar a 30C+/-1C/24h.
Tcnica del Nmero Ms Probable (NMP), para B. cereus.
Esta tcnica es recomendada cuando se sospecha que el alimento a examinar contiene menos de 10 UFC de Bacillus cereus por
gramo o mililitro de muestra. Tambin, se emplea para alimentos deshidratados y para los que la tcnica de recuento en placa es
inapropiada. Para realizar esta tcnica se emplean nueve tubos con Caldo Tripticasa de Soya Polimixina - CTSP (10mL c/tubo).
- Preparar la serie de diluciones decimales hasta 10-3.

- A partir de cada una de las tres series de diluciones decimales consecutivas inocular 3 tubos de CTSP, usando 1 mL de cada
dilucin.
- Incubar a 30C+/- 1C/48h y observar el crecimiento por turbidez en los tubos (puede aparecer un precipitado denso en el
fondo de los mismos).
- De los tubos positivos, tome 0,1mL y simbrelos sobre la superficie de Agar Mossel, Selectivo para B. cereus o Manitol-yema
de huevo-rojo de fenol (Una caja por cada tubo positivo), e incubar las placas a 30C/24-48h.
- Observar aparicin de colonias tpicas en cada caja y transferir por estra algunas colonias tpicas sobre agar Nutritivo, para
hacer la confirmacin posterior; incubar a 3030C+/-130C/24h (Continuar la confirmacin igual que para el recuento en placa
y calcular el resultado de igual forma como se hizo para S. aureus).
Los clculos y resultados de los anlisis en superficie y NMP, se realizan de forma idntica a los realizados para S. aureus.
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Deteccin de Salmonella sp. (Prueba de Ausencia-Presencia).
Para la determinacin de Salmonella, siga las instrucciones a continuacin, as como, las instrucciones del tutor:
- Preenriquecimiento no selectivo. Proceda a pesar 25g de la muestra y suspndalos en 225mL de Agua Peptonada
Tamponada, incube a 37C/18-24h.
- Enriquecimiento selectivo. Pipetee 1mL del preenriquecimiento no selectivo a tubos con 10mL de caldo Rapapport
Vassiliadis, Selenito-Cistina y/o caldo Tetrationato. Incube a 43C/24h.
- Aislamiento diferencial sobre medios slidos. De los tubos de enriquecimiento selectivo, tome una asada y realice unas
estras por duplicado sobre la superficie de placas de agar los siguientes agares: Desoxicolato, Xilosa-Lisina-Desoxicolato
(XLD), Salmonella-Shigella (SS), Bismuto-Sulfito (BS), Rambach, Hektoen y/o Bilis- Rojo de Fenol-Lactosa-Sacarosa (BPLS), e
incube a 37C/24h.
- Confirmacin bioqumica de las colonias sospechosas. De cada uno de los medios de aislamiento diferencial con colonias
tpicas de Salmonella spp., tome un mnimo de tres y simbrelas sobre placas de agar nutritivo, incube a 37C/18-24h y
partiendo de estas cajas, realice la confirmacin en las pruebas: SIM, TSI, LIA, Citrato de Simmons, Caldo Urea, RM-VP, KCN,
caldo Rojo de Fenol + 0.5% de Dulcitol y al 1% de Lactosa o Sacarosa y, proceda a incubar a 37C/24h.
- Si las anteriores pruebas resultan tpicas de Salmonella spp., proceda a realizar confirmacin serolgica de las colonias
sospechosas.
- Resultados: Si todos los resultados coinciden con Salmonella spp., informe: Presencia de Salmonella spp., en 25 gramos o si
es el caso contrario reporte Ausencia de Salmonella spp., en 25 gramos.
CONSULTA.
1. Mencione y explique las pruebas de plataforma que se aplican a la leche cruda.
BIBLIOGRAFA.
Arthey, D., y Ashurst, P.R. 1997. Procesado de Frutas. Traduccin de Justino Burgos Gonzlez, Catedrtico Tecnologa de los
Alimentos, Facultad de Veterinaria, Universidad de Zaragoza, Espaa. Editorial Acribia S.A. 273 p.
Baker, F. J., y Breach, M. R. 1990. Manual de tcnicas de Microbiologa Mdica. Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa. 676 p.
Carrascal Camacho, A, K. Pez Morales, A., y Burbano Rosero, M. 2003. Manual de Laboratorio: Microbiologa de Alimentos.
Pontificia Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias, departamento de Microbiologa, Bogot. 171 p.
Food and Drug Administration (2009) [en lnea]. USA: Department of Health & Human Services FDA. [consultado ene., 2011].
Disponible en internet:
< http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualBAM/default.htm>
ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis Microbiolgico. Vol. 1, 2 edicin, Editorial Acribia. Zaragoza,
Espaa, 1984.
INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TCNICAS Y CERTIFICACIN. Bebidas no alcohlicas. Bebidas Gaseosas o

Carbonatadas. NTC2740. Bogot D. C.: El Instituto, 2009. 17 p.
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INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TCNICAS Y CERTIFICACIN. Bebidas no alcohlicas. Bebidas Gaseosas o

Carbonatadas. NTC2740. Bogot D. C.: El Instituto, 2009. 17 p.
INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TCNICAS Y CERTIFICACIN. Helados y mezclas para helados. NTC1239. Bogot D.
C.: El Instituto, 2002. 18 p.
INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TCNICAS Y CERTIFICACIN. Leche Pasteurizada. NTC506. Bogot D. C.: El
Instituto, 2002. 11 p.
INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TCNICAS Y CERTIFICACIN. Microbiologa de Alimentos y Alimentos para Animales.
Mtodo horizontal para el recuento de Clostridium Sulfito Reductores e Identificacin de Clostridium perfringens. Tcnica de
recuento de colonias. NTC4834. Bogot D. C.: El Instituto, 2000. 15 p.
INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TCNICAS Y CERTIFICACIN. Microbiologa de Alimentos y productos para

alimentacin animal. Requisitos generales y directrices para anlisis microbiolgicos. NTC4092. Bogot D. C.: El Instituto,
2009. 76 p.
INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TCNICAS Y CERTIFICACIN. Productos lcteos. Crema de leche. NTC930. Bogot
D. C.: El Instituto, 2008. 13 p.
INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TCNICAS Y CERTIFICACIN. Productos lcteos, Leche cruda. NTC399. Bogot D.
C.: El Instituto, 2002. 7 p.
INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TCNICAS Y CERTIFICACIN. Productos lcteos. Leche condensada azucarada
(concentrada). NTC879. Bogot D. C.: El Instituto, 1996. 5 p.
INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TCNICAS Y CERTIFICACIN. Productos lcteos. Leche evaporada. NTC733. Bogot
INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TCNICAS Y CERTIFICACIN. Productos lcteos. Leches fermentadas. NTC805.
Bogot D. C.: El Instituto, 2009. 17 p.
INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TCNICAS Y CERTIFICACIN. Productos lcteos. Mantequilla. NTC734. Bogot D. C.:
El Instituto, 1996. 7 p.
INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TCNICAS Y CERTIFICACIN. Productos lcteos. Quesos. NTC750. Bogot D. C.: El
Instituto, 2009. 16 p.
INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TCNICAS Y CERTIFICACIN. Productos lcteos. Queso fundido. NTC4225. Bogot
INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TCNICAS Y CERTIFICACIN. Productos lcteos. Leche en polvo. NTC1036. Bogot
INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TCNICAS Y CERTIFICACIN. Productos lcteos modificados. Leches en polvo
modificadas. NTC1343. Bogot D. C.: El Instituto, 1978. 3 p.
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INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TCNICAS Y CERTIFICACIN. Productos lcteos. Leche lquida saborizada. NTC2740.
Bogot D. C.: El Instituto, 2004. 12 p.
INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TCNICAS Y CERTIFICACIN. Productos lcteos. Leche UAT (UHT) Ultra alta
temperatura, larga vida y leche Ultrapasteurizada. NTC3856. Bogot D. C.: El Instituto, 2004. 12 p.
Manual de Medios de Cultivo Merck. Editorial Merck Alemana. 1994.
MINISTERIO DE SALUD PBLICA. 1998. Decreto 476: Por el cual se modifica parcialmente el Decreto 2437 del 30 de agosto de
1983 y se dictan otras disposiciones. Bogot D.C. Repblica de Colombia. Diario Oficial No. 43.259, del 16 de marzo de 1998.
5 p.
MINISTERIO DE SALUD PBLICA. 1998. Manual de tcnicas de anlisis para control de calidad microbiolgico de alimentos para
consumo humano. INVIMA, Divisin Laboratorio de Alimentos y bebidas alcohlicas, Seccin de Microbiologa de Alimentos.
Bogot D. C. 111 p.
Pascual Anderson, M. A., y Caldern y Pascual, V. 2000. Microbiologa Alimentaria. Metodologa analtica para alimentos y
bebidas. 2 Ed. Daz de Santos S. A. 441 p.
FECHA DE
Enero de 2011
PRCTICA N 5
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ANEXO A. Criterios microbiolgicos para leche y algunos derivados lcteos.
Anlisis de rutina Anlisis especiales y/o espordicos
Producto Norma
Aerobios Mohos y Bacillus Salmonella
Coliformes E. coli S. aureus E.C.S.R Otros
mesfilos levaduras cereus spp.
Leche cruda (en hato). NTC 399 700000 - - - - - - - -

Leche con sabores pasteurizada. MS. Res. 02310/86 50000-10000 11-40 <3 - - - - - -
Leche condensada. MS. Res. 023186 10000-30000 <3 <3 200-500 100-200 - - - -
Leche en polvo. MS. Dec. 2437/83 10000-3000 <3 <3 200-1000 <100-100 100-1000 100-1000 0 -
50000-
Leche pasteurizada. MS. Dec. 2437/83 11-93 <3 - - - - - -
100000
Leche UHT envasada e higienizada. MS. Dec. 476/98 20000-30000 <10-23 <3 - - - - - Ea/an* <10-20
Leche UHT larga vida y mediana. MS. Dec. 476/98 100-200 <3-11 <3 - - - - - Ea/an* <10-10
Queso fresco. MS. Res. 01804/89 - * <3 100-500 1000-3000 - - 0 -
Queso fundido. MS. Res. 01804/89 30000-50000 20-93 <3 100-200 100-200 100-500 100-500 0 -
Queso semi madurado, madurado. MS. Res. 01804/89 - - <3 - 500-1000 - - 0 -
Yogurt / kumis. MS. Res. 02310/83 - 20-93 <3 200-500 - - - - -
Postre de leche pasteurizado. MS. Res. 02310/89 5000-10000 20-50 <3 200-500 100-200 100-1000 100-500 0 -
Crema de leche pasteurizada. MS. Res. 02310/86 - 75-150 <3 100-200 100-200 - - 0 -
Mantequilla. MS. Res. 02310/86 - 75-150 <3 500-1000 100-200 - - 0 -
Arequipe. MS. Res. 02310/86 500-2000 11-40 <3 10-100 100-200 - - - -
100000-
Helados (con leche). MS. Res. 01804/84 93-150 <3 - 100-200 - - 0 -
150000
* Ea = Esporas aerobias; an = Esporas anaerobias.
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PRCTICA N 2
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AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE
Clostridium perfringens
VERSIN
CURSO DE MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS 2
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
PGINA 19
VERSIN
2
PRCTICA N 5
ANLISIS MICROBIOLGICO DE LECHES Y DERIVADOS LCTEOS

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

PRCTICA N 5
ANLISIS MICROBIOLGICO DE LECHES Y DERIVADOS LCTEOS

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

FECHA DE
Enero de 2011

E. Práctica 5 Análisis de Leches y Derivados Lácteos UNAL

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PRCTICA N 5

Tabla 1. Composicin media de la leche de vaca.

Tabla 2. Fuentes de contaminacin que ocasionan la alteracin y presencia de patgenos en la leche

Contaminacin de la leche posterior al ordeo

Definiciones de algunos derivados lcteos.

Mantequilla. Es el producto graso obtenido exclusivamente de leche o nata de vaca, higienizadas.

Otros: Arequipe, leches saborizadas, helados, kumis, etc.

MICROBIOLOGA DE LOS DERIVADOS LCTEOS.

- Stomacher o licuadora que permita una buena homogenizacin.

- Cajas con agar Mossel o Selectivo para B. cereus.

Tcnica de Siembra en Placa Profunda para el recuento de E.C.S.R.

- Prepare diluciones iguales a 10-1, 10-2 y 10-3 a partir de la muestra.

Prueba de confirmacin de las colonias para Clostridium perfringens.

Tcnica del Nmero Ms Probable.

Contine al igual que el procedimiento de siembra en placa profunda.

N: Nmero total de UFC de Clostridium perfringens por gramo o mililitro de la muestra.

b: Nmero de colonias identificadas como positivas de acuerdo al criterio microbiolgico.

Anlisis de Staphylococcus aureus coagulasa positivos.

Recuento en placa en superficie.

- Preparar diluciones iguales a 10-1, 10-2 y 10-3.

Tcnica del Nmero Ms Probable (NMP), para S. aureus.

b) Determinacin de Termonucleasa (Desoxirribonucleasa). Los mtodos ms usuales para la determinacin de S. aureus en

b: Nmero de colonias identificadas como positivas de acuerdo al criterio microbiolgico.

Anlisis de Bacillus cereus.

Recuento en placa en superficie.

- Preparar la serie de diluciones decimales.

- Incubar a 30+/- 1C/24-48h.

- Tincin de Gram y de esporas.

Tcnica del Nmero Ms Probable (NMP), para B. cereus.

- Preparar la serie de diluciones decimales hasta 10-3.

Deteccin de Salmonella sp. (Prueba de Ausencia-Presencia).

1. Mencione y explique las pruebas de plataforma que se aplican a la leche cruda.

INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TCNICAS Y CERTIFICACIN. Bebidas no alcohlicas. Bebidas Gaseosas o

INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TCNICAS Y CERTIFICACIN. Bebidas no alcohlicas. Bebidas Gaseosas o

INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TCNICAS Y CERTIFICACIN. Microbiologa de Alimentos y productos para

Manual de Medios de Cultivo Merck. Editorial Merck Alemana. 1994.

ANEXO A. Criterios microbiolgicos para leche y algunos derivados lcteos.

Anlisis de rutina Anlisis especiales y/o espordicos

Leche cruda (en hato). NTC 399 700000 - - - - - - - -

* Ea = Esporas aerobias; an = Esporas anaerobias.

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