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Recuento total en placa de microorganismos

aerobios mesfilos y el mtodo de Breed


I. INTRODUCCIN

El anlisis de los alimentos est catalogado por diversas tcnicas y mtodos para
determinar microorganismos que se encuentran viables en los alimentos ya sean slidos
como las carnes, verduras y frutas, o lquidos ya sea leche y jugos de frutas; entre estos
mtodos tenemos la numeracin de microorganismos aerobios mesfilos, la cual nos
permite determinar cuntos microorganismos contaminantes presenta un alimento sobre su
superficie o en su interior. (1)

La cuenta en placa es la tcnica comnmente utilizada cuando se requiere investigar el


contenido de microorganismos viables en un alimento. (2)

Otra tcnica comnmente empleada para determinar el nmero de microorganismos es la


el mtodo del nmero ms probable. Esta proporciona una estimacin estadstica de la
densidad microbiana presente con base a que la probabilidad de obtener tubos con
crecimiento positivo disminuye conforme es menor el volumen de muestra inoculado. (2)

En general, el recuento de la flora aerobio mesfila es una prueba para conocer las
condiciones de salubridad de algunos alimentos; mientras que el mtodo de Breed es un
mtodo para el conteo de clulas totales (Viables y no viables).
II. OBJETIVOS

Cuantificar la microflora mesfila aerobia de la muestra dada en prctica.


Practicas los mtodos directos para la obtencin de microorganismos utilizando
el mtodo de recuento de colonias en placa y el RMD.
Determinar si la muestra dada en clase est en condiciones aptas para el consumo
humano.
Determinar cuntos microorganismos presenta la muestra que analizamos.

III.MATERIALES

A. Material biolgico.
Muestra liquida.
B. Material de laboratorio
Medio de cultivo: Agar PCA
Diluyente: Agua peptonada.
Pipetas
Placas Petri
Mechero
Lminas portaobjetos
Tubos de ensayo
Regla
Estufa
Cocina elctrica
Microscopio ptico.

IV. PROCEDIMIENTO
1. Recuento en placa
De la muestra madre dada en clase sacamos 1 ml y lo diluimos en 9 ml de
agua peptonada en el tubo de ensayo, ya previamente rotulado (10-1) y
homogenizar.
Luego del tubo 10-1 extraemos 1ml y lo diluimos en 9 ml de agua peptonada
en el tubo de ensayo 10-2
A partir de estas diluciones decimales, depositar, con pipeta estril, 1 ml de
cada dilucin en placas Petri estriles, en presencia del mechero.
Aadir a cada placa unos 15 ml del agar Brees previamente licuado y
atemperado (+/- 47C), en presencia del mechero.
Homogenizar inmediatamente sobre la mesa de trabajo, haciendo
movimientos circulares con la placa, a favor y en contra del sentido de las
agujas del reloj y en forma de cruz, evitando al mismo tiempo que el medio
impregne la tapa. Dejar solidificar el agar de las placas sobre una superficie
horizontal.
Cuando se ha solidificado perfectamente envolver las placas en papel estril
y llevarlas a la estufa a temperatura ambiente.
Transcurridos el tiempo de incubacin (cerca de 72 horas), se cuentan las
colonias en aquellas placas que muestren entre 30 y 300 colonias aisladas.
Las colonias contadas se irn marcando para evitar contarlas de nuevo.
2. Recuento mnimo directo
En la lmina portaobjetos delimitar en el envs un cuadrado con un rea
de 1cm2 en el centro.
Depositar en la otra cara de la lmina portaobjeto, con una pipeta estril,
0.01 ml en el centro del cuadrado, en presencia del mechero.
Extender por toda el rea del cuadrado el 0.01 ml con el asa
bacteriolgica al mismo tiempo que se lo fija con calor con ayuda del
mechero.
Colorear con el colorante Cristal violeta, esperar que se impregne el
colorante a la muestra por unos minutos y lavar con el debido cuidado de
no botar la muestra secar la lmina al calor.
Llevar la lmina al microscopio y observar a inmersin.
Contar la cantidad de clulas presentes en el campo, luego cambiar de
campo y contar nuevamente hasta llegar al mnimo de 150 clulas y
sacar el promedio dividindolo entre el nmero de campos contados.
3. Determinar el factor microscpico.
Colocar una lmina portaobjeto mtrica y observar al microscopio a
inmersin.
Determinar el dimetro del campo microscpico a inmersin.
V. RESULTADOS.
1. Para recuento en placa

En las tres placas sembradas (de la muestra, 10-1), se obtuvo un crecimiento de colonias
bacterianas mayores a 300. Por lo que se hizo no un recuento de colonias estndar, sino, un
recuento estimado.

En la placa 10-2 se cont un total de 584 colonias, a este lo multiplicamos por su factor
de dilucin, lo cual nos dar como resultado el recuento total de grmenes por mililitro.

584* 10-2 = 58000 UFC/ ml (Redondeando)


2. Mtodo de Breed
Determinar el factor microscpico (FM)
Dimetro del campo de inmersin es: 0.18mm
rea del campo microscpico: .r2
.r2 = * (0.09mm)2
=0.025446mm2
El factor microscpico (FM) por volumen (mililitro) =

2
100 mm
2
r

100 mm 2 100 mm 2
r 2 = 0.025446 mm2
= 3929.89
Promedio de clulas por campo:

= 42+30+15+36+32= 155
Promedio: 155 5= 31
Clculo del nmero de bacterias por mililitro= FM*V*
FM*V* = 3923.89*100*31
=1282659 bacterias por mililitro.
El nmero 100 es porque nosotros queremos el nmero de
bacterias por mililitros y durante la prctica usamos 0.01 ml; para
que quede representado por mililitros tenemos que multiplicar
por 100.