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Contenido

INTRODUCCIN ................................................................................................................... 1
1. MICROBIOLOGA .......................................................................................................... 2
1.1. Los mo y sus ambientes naturales ....................................................................... 3
1.2. Efecto de los mo entre s y en sus hbitats......................................................... 3
1.3. Impacto de los mo sobre el hombre ..................................................................... 4
1.3.1. Microorganismo y agricultura ......................................................................... 4
1.3.2. Microorganismos y alimentacin ................................................................... 5
1.3.3. Microorganismos, energa y medio ambiente .............................................. 6
1.3.4. Los microorganismos y el futuro ................................................................... 6
1.4. Races histricas de la microbiologa................................................................... 7
1.4.1. Ferdinand Cohn y la ciencia de la bacteriologa ......................................... 7
1.4.2. Pasteur y el fin de la generacin espontnea .............................................. 8
1.4.3. Koch y la teora microbiana de las enfermedades infecciosas .............. 10
1.4.4. Postulados de Koch ................................................................................... 11
1.4.5. Koch y los cultivos puros .............................................................................. 13
1.4.6. Koch y la tuberculosis .................................................................................... 13
1.5. Evolucin en la escala filogentica ..................................................................... 14
1.5.1. Las especies como unidades de clasificacin .......................................... 14
1.5.2. Divisin de organismos celulares ................................................................ 16
1.5.3. Las arqueobacterias........................................................................................ 16
1.5.4. Grupos que forman a las arqueobacterias ................................................. 16
2. ESTERILIZACIN........................................................................................................ 17
2.1. Teora y prctica de la esterilizacin .............................................................. 17
2.1.1. Esterilizacin por calor .............................................................................. 18
2.1.2. Esterilizacin por tratamiento qumico ................................................... 19
2.1.3. Esterilizacin por filtracin ....................................................................... 20
3. CRECIMIENTO MICROBIANO................................................................................... 21
3.1. Definicin de crecimiento ................................................................................. 21
3.2. Naturaleza y expresin matemtica del crecimiento ................................... 21
3.3. Tiempo de generacin y velocidad especfica de crecimiento .................. 24
3.4. Medicin del crecimiento .................................................................................. 26

I
3.4.1 Medicin de la masa celular ...................................................................... 26
3.4.2. Medicin del nmero de clulas .............................................................. 27
3.5. Rendimiento ......................................................................................................... 29
3.6. Crecimiento sincrnico ..................................................................................... 29
3.7. Cultivo por lote y cultivo continuo .................................................................. 30
4. EFECTOS AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO ................ 32
4.1. Temperatura............................................................................................................. 32
4.1.1. Clases de microorganismos segn la temperatura .................................. 34
4.2. pH............................................................................................................................... 35
4.3. Efectos osmticos sobre el crecimiento microbiano ...................................... 36
4.4. Actividad de agua, smosis y halfilos.......................................................... 36
4.4.1. Solutos compatibles ....................................................................................... 37
4.5. Oxgeno................................................................................................................. 38
4.5.1. Clases de microorganismo en relacin al oxgeno ................................... 38
5. TRANSPORTE DE ELECTRONES............................................................................ 39
5.1. Complejos I a IV ...................................................................................................... 40
5.1.1. Complejo I ......................................................................................................... 40
5.1.2. Complejo II ........................................................................................................ 42
5.1.3. Complejo III ....................................................................................................... 43
5.1.4. Complejo IV ....................................................................................................... 45
5.1.5. Complejo V: ATP sintasa................................................................................ 46
Bibliografa ............................................................................................................................. 46

II
INTRODUCCIN

La presente antologa incluye temas de inters revisados en la Unidad de


Aprendizaje (UAps) de Microbiologa, del Programa Acadmico de Ing. de
Alimentos, el cual es parte de la oferta acadmica de la Unidad Profesional
Interdisciplinaria de Ingeniera Campus Zacatecas del Instituto Politcnico
Nacional (UPIIZ-IPN).

El trabajo cubre aproximadamente el 55% de los contenidos temticos incluidos


en la UAps de Microbiologa y durante seis aos, ha sido una herramienta de
apoyo para los alumnos tanto de la carrera de Ing. en Alimentos, como de Ing.
Ambiental.

La antologa incluye temas tomados de dos fuentes en el rea de la


Microbiologa: Microbiologa de Stanier y Microbiologa de Prescott; y una fuente
del rea de Bioqumica: Principios de Bioqumica de Horton. El trabajo se
presenta a la Academia de Qumico-Biolgias, esperando que su contenido sea
de utilidad para futuras generaciones de los Programas Acadmicos antes
mencionados y con la intencin futura de completar el 100% de los contenidos
temticos de la UAps de Microbiologa.

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1. MICROBIOLOGA

La microbiologa es el estudio de los microorganismos (MO), un grupo amplio y


diverso de organismos microscpicos que existen como clulas aisladas o
asociadas; tambin incluye el estudio de los virus, que son microscpicos pero
no celulares. Las clulas microbianas se distinguen pues de las clulas de
animales y plantas, en que son incapaces de vivir aisladas en la naturaleza y
solo existen formando parte de organismos multicelulares. En general, a
diferencia de los macroorganismos, los microorganismos son capaces de
realizar sus procesos vitales de crecimiento, generacin de energa y
reproduccin, independientemente de otras clulas, sean de la misma clase o de
otra diferente.

La microbiologa estudia los MO, especialmente las bacterias, un amplio grupo


de clulas con una enorme importancia bsica y aplicada. De un modo u otro,
los MO influyen en todas las formas vivas de la tierra y por tanto, la ciencia de la
microbiologa tiene una gran trascendencia.

La microbiologa gira en torno a dos temas fundamentales, uno bsico y otro


aplicado

1. Como ciencia biolgica bsica, la microbiologa proporciona algunas de


las herramientas de investigacin ms adecuadas para estudiar la
naturaleza de los procesos vitales. El avanzado conocimiento que ahora
tenemos de las bases fsicas y qumicas de la vida procede del estudio de
los MO. Se debe en parte a que las clulas microbianas comparten
muchas propiedades bioqumicas con las clulas de organismos
pluricelulares; de hecho, todas las clulas tienen mucho en comn; unido
al hecho de que las clulas microbianas pueden crecer hasta alcanzar
una elevada densidad en cultivo en el laboratorio y son fcilmente
manipulables en estudios bioqumicos y genticos, hace de ellas
excelentes modelos para el conocimiento de las funciones celulares en
organismos superiores.
2. Como ciencia biolgica aplicada, la microbiologa trata de muchos
problemas prcticos importantes en la medicina, la agricultura y la

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industria. Muchas de las enfermedades ms importantes del hombre, de
otros animales y de las plantas, son producidas por MO. Los MO tambin
desempean una funcin destacada en la fertilidad del suelo y en la
produccin de animales domsticos. Adems muchos procesos
industriales y biotecnolgicos a gran escala, como la produccin de
antibiticos o de protenas humanas, se basan en la utilizacin de MO.

1.1. Los mo y sus ambientes naturales

En la naturaleza, las clulas viven asociadas a otras en conjuntos llamados


poblaciones. Tales poblaciones se componen de grupos de clulas
relacionadas, que generalmente derivan de una nica clula parental por
divisiones celulares sucesivas. El lugar donde vive una poblacin microbiana en
un determinado ambiente se denomina hbitat. Los MO pueden encontrarse
tanto en ambientes familiares como en lugares poco comunes, como aquellos
tan extremos que se consideran inadecuados para formas de vida superiores.
Las poblaciones celulares raramente viven solas en la naturaleza, antes bien se
relacionan con otras formando las llamadas comunidades microbianas.

1.2. Efecto de los mo entre s y en sus hbitats

Las poblaciones de las comunidades microbianas se relacionan de varios modos


y tales interacciones pueden ser perjudiciales o beneficiosas. En muchos casos,
las poblaciones interaccionan y cooperan en sus funciones nutricionales con los
productos de desecho derivados de las actividades metablicas de algunas
clulas sirviendo como nutrientes para otras. Los organismos de un hbitat
tambin se relacionan con su ambiente fsico y qumico. Los hbitat tienen
caractersticas diferentes, y un hbitat que favorece el crecimiento de un
organismo puede ser daino para otro. Por tanto, la composicin de una
comunidad microbiana en un hbitat concreto est determinada en gran parte
por las caractersticas fsicas y qumicas de ese medio. En conjunto,
denominamos ecosistema a los organismos y a los componentes fsicos y
qumicos de su medio.

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1.3. Impacto de los mo sobre el hombre

Al comienzo del siglo XX las causas de muerte ms frecuentes eran las


enfermedades infecciosas; en la actualidad tales enfermedades son mucho
menos importantes. El control de las enfermedades infecciosas se ha logrado
por un conocimiento integrado de los procesos infecciosos, por la mejora de las
prcticas sanitarias y por el descubrimiento y uso de los agentes antimicrobianos;
la microbiologa tuvo sus principios como ciencia precisamente en estudios sobre
enfermedades.

Aunque vivimos en un mundo donde muchos MO patgenos estn controlados,


los MO pueden ser todava un riesgo importante para la supervivencia, Pinsese
en los individuos que mueren lentamente por infecciones microbianas como
resultado del sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), en los pacientes
de cncer cuyo sistema inmune est daado por la terapia anticancerosa o en
individuos infectados por un patgeno con resistencia mltiple. Adems, las
enfermedades microbianas constituyen la principal causa de muerte en muchos
pases subdesarrollados. Aunque la erradicacin de la viruela en el mundo ha
sido un rotundo xito para la medicina, aun mueren millones de personas al ao
por enfermedades microbianas tan difundidas como la malaria, la tuberculosis,
el clera, la enfermedad del sueo africana y sndromes diarreicos severos.

Por tanto, los MO todava constituyen serias amenazas para la existencia


humana. No obstante, hay que destacar que la mayor parte de los MO no son
perjudiciales para el hombre. De hecho, la gran mayora son en realidad
beneficiosos y llevan a cabo procesos de enorme valor para la sociedad.

1.3.1. Microorganismo y agricultura

En general, nuestros sistemas de agricultura dependen en muchos aspectos de


las actividades microbianas. Un gran nmero de cosechas se debe al cultivo de
miembros de un grupo de plantas llamadas leguminosas, que viven en
asociacin muy estrecha con bacterias especficas que forman estructuras en
sus races llamadas ndulos. En estos ndulos radiculares, el nitrgeno
atmosfrico (N2) se convierte por fijacin en compuestos nitrogenados que las
plantas utilizan para crecer. De este modo, las actividades de las bacterias

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contenidas en los ndulos de las races reducen la necesidad de fertilizantes
costosos para plantas. Tambin tienen gran importancia agrcola los MO que son
esenciales en el proceso digestivo de los rumiantes, como las vacas y las ovejas.
Estos animales poseen un rgano digestivo especial llamado rumen, donde los
microorganismos realizan el proceso digestivo. Sin estos microorganismos las
vacas y las ovejas no podran digerir su alimento y, por tanto, no podran
desarrollarse sobre sustancias tan pobres en nutrientes como la hierba o el heno.
Los MO tambin desempean funciones crticas en el reciclado de elementos
importantes para la nutricin vegetal, en particular del carbono, nitrgeno y
azufre. En el suelo y en el agua, los MO convierten estos elementos en formas
asimilables por las plantas. Adems de beneficios, los MO tambin acarrean
perjuicios a la agricultura. Las enfermedades microbianas de animales y plantas
tienen un importante impacto econmico.

1.3.2. Microorganismos y alimentacin

Una vez producidas las cosechas, productos agrcolas, o los animales en


explotaciones ganaderas, estos deben llegar a los consumidores con calidad
sanitaria. De ah que los MO tengan una gran importanica en la industria
alimentaria. El deterioro de los alimentos ocasiona anualmente prdidas
econmicas inmensas. Las insdustrias de enlatado, congelado y desecado de
los alimentos tienen como finalidad preparar alimentos de tal modo que no sufran
deterioro por MO. Las enfermedades transmitidas por alimentos tambin son
dignas de consideracin. Los alimentos deben estar adecuadamente preparados
y controlados para evitar la transmisin de enfermedades, ya que el alimento
apto para el consumo humano puede servir tambin para sustentar el
crecimiento de muchos MO. Sin embargo, no todos los MO tienen efectos
indeseables sobre los alimentos o sobre los consumidores. Por ejemplo, los
productos lcteos que se manufacturan en gran medida gracias a actividades
microbianas, tales como el queso, el yogurt o la mantequilla, son productos de
gran valor ecenmico. De modo similar, la col cida, los pepinillos y algunas
formas de salchichas deben tambin sus propiedades a los MO. Los alimentos
de panadera se elaboran usando levaduras. Las bebidas alcohlicas,
ampliamente difundidas en nuestra sociedad, tambin son producidas por las
levaduras.

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1.3.3. Microorganismos, energa y medio ambiente

En lo que respecta a la energa, los MO desempean funciones clave. La mayor


parte del gas natural (metano) es un producto bacteriano, derivado de las
actividades de las bacterias metanognicas. Los MO fototrofos pueden utilizar la
luz como fuente de energa para la produccin de biomasa, es decir, energa
acumulada en forma de organismos vivos. La biomasa bacteriana y los
materiales de desecho, como la basura domstica, los excedentes de cosechas
y los residuos animales, se pueden convertir en biocombustible, como el metano
y el etanol, por las actividades degradativas de los MO.

Los MO tambin se pueden usar para ayudar a eliminar la polucin originada por
las actividades humanas, un proceso que se denomina biorremediacin. Se han
aislado varios MO de la naturaleza que consumen vertidos de petrleo,
disolventes, pesticidas y otros productos txicos que contaminan el ambiente,
bien sea directamente en el sitio del vertido o bien posteriormente, cuando el
material txico ha penetrado en el suelo o alcanzado el agua subterrnea.

La enorme diversidad de los MO en la Tierra permite disponer de grandes


recursos genticos que soluciones la limpieza del medio ambiente; este es un
rea de intensa investigacin en la actualidad.

1.3.4. Los microorganismos y el futuro

La biotecnologa implica el uso de MO en procesos industriales a gran escala,


utilizando por lo general MO modificados genticamente y capaces de sintetizar
productos especficos de elevado valor comercial.

La biotecnologa depende en gran medida de la ingeniera gentica, una


disciplina que trata de la manipulacin artificial de genes y de sus productos. Los
genes procedentes de diversos organismos se pueden escindir en fragmentos y
modificarlos utilizando enzimas microbianas como instrumentos moleculares.
Mediante tcnicas de ingeniera gentica, resulta tambin posible hacer genes
completamente artificiales. Una vez que un gen deseado se ha creado o
seleccionado puede insertarse en un MO y se puede expresar alli originando el
producto gnico deseado. Por ejemplo, la insulina humana, una hormona que se
encuentra en cantidades anormalmente bajas en sujetos con diabetes, puede

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ser producida microbiolgicamente a partir del gen de la insulina humana
expresado en un MO.

La abrumadora influencia de los MO en la sociedad humana resulta clara.


Tenemos muchas razones para considerar a los MO y sus actividades. Como
dijo uno de los fundadores de la microbiologa, el eminete cientfico francs Louis
Pasteur: - En la naturaleza, el papel de lo infinitamente pequeo es infinitamente
grande-

1.4. Races histricas de la microbiologa

Aunque durante mucho tiempo se sospech la existencia de criaturas demasiado


pequeas para ser percibidas a simple vista, su descubrimiento estuvo
relacionado con la invencin del microscopio. En 1664 Robert Hooke describi
los cuerpos fructferos de mohos, pero la primera persona que vi MO con detalle
fue el holands Antonie van Leewenhoek, aficionado a construir microscopios,
quien en 1684 utiliz microscopios simples fabricados por l mismo.
Comparados con los actuales, los microscopios de Leewenhoek eran bastante
primitivos pero mediante una cuidadosa manipulacin y un buen enfoque, fue
capaz de ver MO tan pequeos como los procariotas.

1.4.1. Ferdinand Cohn y la ciencia de la bacteriologa

La microbiologa no se desarrollo como ciencia hasta que las mejoras en


microscopa permitieron una mejor observacin de las bacterias y se idearon
tcnicas bsicas de laboratorio para el estudio de los MO. El desarrollo de esas
tcnicas esenciales de laboratorio se vio favorecido por la investigacin llevada
a cabo durante el siglo XIX en torno a dos temas inquietantes. Uno de estos
temas era la cuestin de la generacin espontnea. Durante siglos, la idea de
que la materia inerte podia originar seres vivos tuvo serios defensores. La
segunda incgnita se centraba en la naturaleza de las enfermedades
infecciosas. Se saba que las enfermedades infecciosas se transmitan de un
individuo a otro pero los mecanismos de la transmisin eran desconocidos.
Aunque las respuestas a estas preguntas se suelen asociar con las figuras de
Louis Pasteur y Robert Koch, respectivamente, fue el botnico alemn Ferdinand
Cohn (1828-1898), un contemporneo de aquellos, quien fund la bacteriologa

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(estudio de las bacterias) y coloc la incipiente microbiologa en un buen punto
de partida.

Cohn se interes especialmente por las bacterias resistentes al calor, lo que le


llev a descubrir el gnero Bacillus y el proceso de formacin de esporas. Ahora
sabemos que las endosporas bacterianas son estructuras muy resistentes al
calor, de hecho las ms resistentes de todas las formas microbianas si
exceptuamos unas pocas bacterias que crecen mejor a temperaturas
notablemente elevadas. Cohn describi el ciclo de vida completo de Bacillus
(cula vegetativa-endospora-clula vegetativa) y descubri que las clulas
vegetativas, pero no las endosporas, podan morir mediante ebullicin. Estos
hallazgos de ayudaron a explicar por qu algunos cientficos anteriores, como
John Tyndall, observaron que la ebullicin era a menudo una tcnica efectiva de
esterilizacin, pero no siempre era as.

Cohn continu trabajndo con bacterias hasta su retiro, contribuyendo de muchas


maneras al desarrolllo de la bacteriologa, aportando las bases experimentales
para un esquema de clasificacin de las bacterias. En su poca Cohn fue un
entusiasta defensor de las tcnicas y las investigaciones desarrolladas por el
fundador de la microbiologa mdica Robert Koch. Tambin se debe a Cohn
haber ideado mtodos simples y efectivos para evitar la contaminacin de
medios de cultivo estriles, como el uso del algodn para cerrar los tubo y
matraces. Estos mtodos fueron usados posteriormente por Koch y le
permitieron grandes avances como el aislamiento y la caracterizacin de varias
bacterias causantes de enefermedades.

1.4.2. Pasteur y el fin de la generacin espontnea

En el siglo XIX tuvo lugar una gran polmica sobre la teora de la generacin
espontnea. La idea bsica de la generacin espontnea puede comprenderse
fcilmente. El alimento se pudre si permanece durante cierto tiempo a la
interperie. Cuando este material putrefacto se examina al microscopio se
encuentra que est repleto de bacterias. De donde provienen estas bacterias
que no se ven en el alimento fresco?. Algunos pensaban que provenan de
semillas o grmenes que llegaban al alimento a travs del aire, mientras otros
opinaban que se originaban espontneamente a partir del material inerte.

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El adversario ms ferviente de la generacin espontnea fue el qumica francs
Louis Pasteur, cuyo trabajo sobre este problema fue el ms riguroso y
convincente. En primer lugar, Pasteur demostr que en el aire haba estructuras
que se parecan mucho a los MO encontrados en el material putrefacto.
Descubri que el aire normal contiene continuamente una diversidad de clulas
microbianas que son indistinguibles de las que se encuentran en mucha mayor
cantidad en los materiales en putrefaccin. Por tanto, concluy que los
organismos encontrados en tales materiales se originaban a partir de MO
presentes en el aire. Adems postul que dichas clulas en suspensin se
depositan constantemente sobre todos los objetos, Pasteur pens que si sus
conclusiones eran correctas, entonces no debera estropearse un alimento
tratado, de tal modo que todos los organismos que lo contaminaran fueran
destruidos.

Pasteur emple el calor para eliminar los contaminantes, pues ya se saba que
el calor destruye con efectividad los organismos vivos. De hecho, otros
investigadores ya haban mostrado que si una solucin de nutrientes se
introduca en un matraz de vidrio, se sellaba y se calentaba luego hasta
ebullicin, nunca se descompona. Los defensores de la generacin espontnea
criticaban tales experimentos argumentando que se necesitaba aire fresco para
la generacin espontnea y que el aire dentro del matraz cerrado se modificaba
por el calentamiento de modo que no era capaz de permitir la generacin
espontnea. Pasteur super esta objecin de modo simple y brillante
construyendo un matraz con forma de cuello de cisne, que ahora se designa
como un matraz Pasteur (figura 1.1).

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Figura 1.1. Experimento de Pasteur con matraces de cuello de cisne. (a) Esterilizacin del contenido del matraz.
(b) Si el matraz se mantiene en posicin vertical no hay crecimiento microbiano. (c) Si los microorganismos
atrapados en el cuello alcanzan el lquido estril, crecen rpidamente.

1.4.3. Koch y la teora microbiana de las enfermedades infecciosas

La demostracin de que los MO podan causar enfermedades impuls el


desarrollo inicial de la ciencia de la microbiologa. En realidad, ya en el siglo XIX
se pensaba que se poda transmitir algo de una persona enferma a una sana,
y producris en esta ltima la enfermedad de la primera. Muchas enfermedades
parecan diseminarse por la poblacin y se llamaban contagiosas mientras que
el agente desconocido que causaba la diseminacin fue llamado contagio. Tras
el descubrimiento de los MO, se sospechaba que estos pudieran ser
responsables de enfermedades, pero faltaban las pruebas definitivas.

El mdico Robert Koch (1843-1910), en su trabajo inicial estudi el carbunco,


una enfermedad del ganado que en ocasiones tambin afecta al hombre. Esta
enfermedad est causada por una bacteria formadora de endosporas, Bacillus
anthracis, y la sangre de un animal con carbunco est llena de clulas de esta

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bacteria. Mediante cuidadosos estudios de microscopa, Koch puso de
manifiesto que la bacteria estaba siempre presente en la sangre de los animales
enfermos. Sin embargo, la mera asociacin de la bacteria con la enfermedad no
demostraba que la bacteria fuera la causa de la enfermedad; por el contrario,
podra ser un efecto de la enfermedad. Por eso, Koch demostr que era posible
tomar una pequea cantidad de sangre de un ratn enfermo, inyectarla en un
segundo ratn y provocar en ste la enfermedad y la muerte. Tomando sangre
de este segundo animal e inyectndola en otro, obtena de nuevo los sntomas
caractersticos de la enfermedad.

Repitiendo experimentos de este tipo, Koch demostr por microscopa que la


sangre del animal enfermo contena gran cantidad de la bacteria formadora de
endosporas.

Koch llev este experimento aun ms lejos. Tambin demostr que la bacteria
poda ser cultivada en caldos nutritivos fuera del animal y que, incluso despus
de muchas resiembras o transferencias de cultivo, la bacteria poda causar la
enfermedad an cuando se reinoculaba a un animal. Es decir, la bacteria
procedente de un animal enfermo y la mantenida en cultivo inducan los mismos
sntomas de la enfermedad tras su inoculacin. Basndose en ste y en otros
experimentos, Koch formul los siguientes criterios, conocidos en la actualidad
como postulados de Koch, para demostrar que un tipo concreto de MO es el
agente etiolgico de una enfermedad especfica.

1.4.4. Postulados de Koch


1. El organismo debe estar siempre presente en los animales que sufran la
enfermedad y no en individuos sanos.
2. El organismo debe cultivarse en cultivo axnico o puro fuera del cuerpo
del animal.
3. Cuando dicho cultivo se inocula a un animal susceptible, debe iniciar en
l los sntomas caractersticos de la enfermedad.
4. El organismo debe aislarse nuevamente de estos animales
experimentales y cultivarse nuevamente en el laboratorio, tras lo cual
debe mostrar las mismas propiedades que el MO original.

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Los postulados de Koch se resumen en la figura 1.2. estos postulados no slo
permitieron demostrar que organismos especficos originan enfermedades
especficas, sino que impulsaron el desarrollo de la microbiologa haciendo
hincapi en la importancia de la utilizacin de los cultivos en el laboratorio.
Usando estos postulados como gua otros investigadores revelaron
posteriormente la causa de muchas enfermedades importantes del hombre y
de los animales. A su vez, estos descubrimientos condujeron al
establecimiento de tratamientos adecuados para la prevencin y cura de
muchas enfermedades infecciosas, amplindose de este modo las bases
cientficas de la medicina clnica.

Figura 1.2. Los postulados de Koch para demostrar que un determinado microorganismo causa una
enfermedad especfica.

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1.4.5. Koch y los cultivos puros

Para relacionar un microorganismo determinado con un proceso especfico,


como el caso de una enfermedad, el MO debe ser primero aislado en un cultivo;
es decir, el cultivo debe ser axnico o puro. Este concepto fue recogido por Koch
en la formulacin de sus famosos postulados y desarroll varios mtodos
ingeniosos para obtener bacterias en cultivo puro.

Koch empez estos estudios de forma rudimentaria, usando nutrientes slidos


como la superficie de una rebanada de patata para cultivar bacterias, pero pronto
diseo mtodos ms fiables, muchos de los cuales aun se usan en la actualidad.
Koch observ que cuando se expona al aire la superficie de un nutriente slido
se desarrollaban colonias bacterianas que tenan formas y colores
caractersticos. Dedujo que cada colonia se originaba a partir de una sola clula
bacteriana que haba caido sobre la superficie, haba encontrado los nutrientes
apropiados y se haba multiplicado; es decir, cada colonia representaba un
cultivo axnico o puro. Koch se dio cuenta de que este descubrimiento supona
un sencillo procedimiento para obtener cultivos puros. Como muchos MO no
crecen en rebanadas de patata, Koch ide caldos nutritivos ms uniformes y
reproducibles solidificados con gelatina y ms tarde con agar. Actualmente el
agar es el agente solidificante ms usado en los laboratorios de microbiologa
para obtener y mantener cultivos puros de muchos MO, especialmente bacterias.

1.4.6. Koch y la tuberculosis

El mayor logro de koch en la bacteriologa mdica est relacionado con la


tuberculosis. Cuando Koch comenz este estudio (1881), una de cada siete
muertes en humanos era debida a la tuberculosis. Aunque en aquel tiempo se
sospechaba que la tuberculosis era una enfermedad contagiosa, el organismo
responsable de la enfermedad no se haba visto, ni en los tejidos de enfermo ni
en cultivo. Desde el principio de su estudio sobre la tuberculosis, el objetivo de
Koch fue detectar el agente causante de la enfermedad y para ello emple todos
los mtodos que haba desarrollado previamente: microscopa, tincin de tejidos,
aislamiento en cultivo puro e inoculacin en animales.

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Ahora sabemos que el bacilo de la tuberculosis Mycobacterium tuberculosis, es
muy difcil de teir debido a que posee grandes cantidades de lpidos en su
superficie. Pero Koch dise un procedimiento para teir M. tuberculosis en
muestras de tejidos usando azul de metileno alcalino y un segundo colorante
(marrn Bismark) que tea solo tejido. El mtodo de Koch fue el precursor de
la tincin de Ziehl-Nielsen usada hoy para teir bacterias cido-alcohol
resistentes como M. tuberculosis

1.5. Evolucin en la escala filogentica

La ciencia de la clasificacin de los seres vivos recibe el nombre de taxonoma y


atiende a dos aspectos; el primero de ellos es identificar y describir, de la forma
ms completa posible, las unidades taxonmicas bsicas, las especies; el
segundo es desarrollar un sistema para ordenar y catalogar estas unidades

1.5.1. Las especies como unidades de clasificacin

El concepto de especie es complejo. En trminos generales, una especie


constituye un grupo de individuos (o de poblaciones clonales, en el caso de los
microorganismos) que presentan un grado elevado de semejanza fenotpica,
siendo, al mismo tiempo, claramente diferenciable de los integrantes de otros
conjuntos del mismo tipo general.

Cada conjunto de individuos muestra un cierto grado de diversidad fenotpica


interna a causa de la variacin gentica. Por lo tanto, es la capacidad de
apreciacin cientfica la que permite decir que grado de similitud fenotpica puede
justificar el dividir un determinado conjunto en dos o ms especies; o dicho de
otra forma, que grado de diversidad interna es admisible dentro de una especie.

En el caso de plantas y animales que representan reproduccin sexual una


especie puede definirse en trminos genticos y evolutivos. Mientras que sea
posible el cruce al azar entre los individuos de una poblacin capaz de
reproduccin sexual, el conjunto de genes propio de esa especie sufre una
redistribucin continua, de forma que las nuevas mutaciones, que determinan la
variacin fenotpica, se dispersan dentro del conjunto de la poblacin. Puede
darse una evolucin de esta poblacin en respuesta a cambios ambientales, pero
la evolucin tendr lugar con un grado razonable de uniformidad. Una evolucin

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divergente, que pueda dar lugar a la aparicin de una nueva especie, tendr
lugar solamente cuando una fraccin de esta poblacin se separe del resto,
quedando aislada, desde el punto de vista de la reproduccin y relegada a unas
condiciones ambientales distintas. Este aislamiento, probablemente tiene lugar,
en primera instancia, por razones geogrficas; ciertos tipos de barreras fsicas
(sistemas montaosos, masas de agua) pueden interponerse entre dos sectores
de una poblacin que inicialmente era continua.

El concepto de especie surgido del estudio de plantas y animales es inaplicable


a la mayor parte de los microorganismos, por su carcter aploide y su
reproduccin, predominantemente asexual. Una especie microbiana no puede
considerarse como una comunidad de reproduccin ya que las dos clulas hijas,
resultantes del proceso de divisin de una clula bacteriana, estn aisladas una
de otra desde el punto de vista de la reproduccin siendo libres de evolucionar
de manera divergentes. Este aislamiento gentico se reduce, en cierto grado,
por lo procesos de recombinacin sexual y parasexual que tienen lugar en
microorganismo eucariticos, y por especiales mecanismos de recombinacin
caractersticos de las bacterias. Pero es muy difcil valorar la significacin
evolutiva de estos procesos de recombinacin, porque se desconoce la
frecuencia con que se dan en la naturaleza. En las bacterias, el problema se
complica an ms por la transferencia de plsmidos, que es relativamente
inespecfica, y permite intercambios de material gentico entre bacterias
marcadamente diferentes en cuanto a su constitucin gentica.

Puesto que la dinmica de la evolucin microbiana es tan distinta de la de


animales y plantas, no hay una base terica para sumir que la evolucin
microbiana ha llevado a discontinuidades fenotpicas que justifiquen el
establecimiento de especies. Sin embargo, la experiencia de los taxnomos
microbianos ha demostrado que, cuando se estudian a fondo, muchas cepas de
un grupo microbiano determinado pueden distribuirse en una serie de
agrupamientos (clusters) discontinuos; estos agrupamientos de cepas son los
que en taxonoma microbiana se definen como ESPECIES. Una mayor
profundizacin en la dinmica de la evolucin microbiana podra permitir llegar a
una definicin normal de especie microbiana; en tal caso, es probable que fuera
muy distinta de la definicin de especie aplicable en caso de plantas y animales.
15
En las poblaciones bacterianas, los cambios mutacionales tienen lugar con tal
rapidez que sera absurdo distinguir unas especies de otras basndose en un
nmero reducido de caracteres, controlados por genes independientes. Por ello,
la mejor definicin aplicable a la especie bacteriana sera: un grupo de cepas
que mostrando entre si un grado elevado de semejanza fenotpica general,
difieren en muchas caractersticas de otros grupos de cepas relacionadas.

1.5.2. Divisin de organismos celulares

Los organismos celulares se dividen en tres grupos:

1. Eucariontes. Entre los cuales se encuentran las levaduras y las algas.


2. Eubacterias (Escherichia coli)
3. Arqueobacterias (Hallobacterium halobium)

1.5.3. Las arqueobacterias

Las arqueobacterias forman un grupo heterogneo que se encuentra


filogenticamente muy distante de las eubacterias. De entre sus caractersticas
distintivas se encuentran:

Poseen membranas lipdicas que contienen cadenas laterales


isoprenoide con enlace ter en contraste con los hidrocarburos con enlace
ster de todos los dems sistemas biolgicos.
Diferencias substanciales con respecto a la estructura en subunidades de
su RNA polimerasa.
Carencia en todos los casos de cido murmico como constituyente de la
pared celular de peptidoglicano, a diferencia de las eubacterias con pared,
en las cuales la presencia de cido murmico es prcticamente universal
Carecen de ribotimina en el tRNA.
Utilizan metionil-tRNAmet en lugar de fromilmetionil-tRNAfmet como tRNA
iniciador.
Son sensibles a la toxina diftrica.

1.5.4. Grupos que forman a las arqueobacterias

En base a sus propiedades metablicas o ecolgicas, podemos distinguir tres


grupos de arqueobacterias:

16
1. Metangenos
2. Halfilos
3. Termoacidfilos

Los metangenos se distinguen por su metabolismo de energa nico en el cual


el metano es un producto final prominente. Los halfilos y los termoacidfilos se
distinguen por sus hbitats: ambientes de elevada salinidad para los primeros,
alta temperatura y bajo pH para los ltimos.

Evolucin en la escala filogentica Eubacterias Bacterias verdes no sulfurosas


Bacterias prpuras Cianobacterias Flavobacterias Termotogales Gram positivas
Arqueobacterias Metanognicas Extremfilas (temperatura y cloruro de sodio).

2. ESTERILIZACIN
2.1. Teora y prctica de la esterilizacin

La esterilizacin es un tratamiento que deja el objeto tratado libre de todo


organismo vivo. Puede lograrse mediante exposicin a agentes letales fsicos o
qumicos o, en el caso especial de las disoluciones, por filtracin.

Para entender la base de la esterilizacin por agentes letales es necesario


describir brevemente la cintica de la muerte de una poblacin microbiana. El
nico criterio vlido de muerte en el caso de un microorganismo es la prdida
irreversible de la capacidad de reproducirse. Esto se determina generalmente
mediante mtodos cuantitativos de siembra en placa, en los que los
supervivientes se detectan porque forman colonias. Caundo una poblacin
microbiana pura se expone a un agente letal, la cintica de la muerte es casi
siemre exponencial: el nmero de supervivientes disminuye en prograsin
geomtrica con el tiempo. Esto refleja el hecho de que todos los miembros de la
poblacin son ingualmente sensibles; la probabilidad determina el tiempo que se
requiere, de hecho, para la muerte de un individuo dado. Si en un sistema de
coordenadas se representa el logaritmo del nmero de supervivientes en funcin
del tiempo de exposicin, se obtiene una lnea recta: su pendiente negativa
define la tasa de mortalidad.

17
La tasa de mortalidad nos dice solamente que fraccin de la poblacin inicial
sobrevive a un determinado periodo de tratamiento. Para determinar el nmero
real de sobrevivientes es preciso conocer, adems, el tamao inicial de la
poblacin. De acuerdo con esto, para establecer los procedimientos de
esterilizacin ha que tener en concideracin dos factores: la tasa de mortalidad
y el tamao de la poblacin inicial.

En la prctica de la esterilizacin, la poblacin microbiana que ha de ser


destruida es casi siempre mixta. Como los MO difieren ampliamente en su
resistencia a los agentes letales, los factores que se hacen significativos son el
tamao de la poblacin inicial y la tasa de mortalidad de los miembros ms
resistentes de la poblacin mixta. Estos son casi siempre las endosporas
altamente resistentes de ciertas bacterias. Por consiguiente, para asegurarse de
la fiabilidad de los mtodos de esterilizacin, los objetos que se utilizan son
suspensiones de esporas de resistencia conocida.

Teniendo en cuenta la cintica de la muerte microbiana, podemos formular el fin


prctico de la esterilizacin mediante un agente letal de una manera ligeramente
ms refinada: la probabilidad de que el objeto tratado contenga siquiera un
superviviente debe ser infinitamente pequea. Por ejemplo, si queremos
esterilizar un litro de medio de cultivo, esta meta puede lograrse para todos los
fines prcticos si el tratamiento no deja ms que un sobreviviente por cada 10 6
litros. Bajo tales circunstancias, la probabilidad de fallo es ciertamente muy
pequea. Los procedimientos rutinarios de esterilizacin se plantean siempre de
forma que proporcionen un amplio margen de seguridad.

2.1.1. Esterilizacin por calor

El calor es el agente letal ms ampliamente utilizado para la esterilizacin. Los


objetos pueden ser esterilizados por calor seco, aplicado en un horno en
atmsfera de aire o por calor hmedo, que proporciona el vapor caliente. De
esteos dos mtodos, la esterilizacin por calor seco requiere una duracin e
intensidad mucho mayores porque la conduccin del calor es menos rpida en
aire seco que en aire hmedo. Adems, las bacterias pueden sobrevivir en
estado de desecacin completa y en este estado, la resistencia intrnseca al calor
de las clulas vegetativas bacterianas est enormemente aumentada, casi hasta

18
el nivel caracterstico de las esporas. Por consiguiente, la tasa de muerte es
mucho ms baja para las clulas desecadas que para las hidratadas.

El calor seco se usa principalmente para esterilizar material de vidrio y otros


materiales slidos estables al calor. Los objetos se envuelven en papel o se les
protege de otra forma de la contaminacin posterior y son expuestos a una
temperatura de 170C durante 90 minutos en un horno.

El vapor debe ser utilizado para la esterilizacin por calor de disoluciones


acuosas. El tratamiento suele llevarse a cabo en un recipiente metlico llamado
autoclave, que puede llenarse de vapor a una presin superior a la atmosfrica.
La esterilizacin puede lograrse as a temperaturas que estn
considerablemente por encima del punto de ebullicin del agua. Las autoclaves
de laboratorio se emplean generalmente a una presin de vapor de 1 atmsfera
por encima de la presin atmosfrica, lo cual corresponde a una temperatura de
120C. Incluso las esporas que sobreviven despus de varias horas sometidas
a ebullicin, mueren rpidamente a 120C. Los volmenes pequeos de lquido
(hasta 3 L) pueden ser esterilizados exponindolos durante 20 minutos; si hay
que esterilizar volmenes mayores, debe alargarse el tiempo de tratamiento.

La temperatura de 120C dentro de la autoclave se conseguir, a la presin


indicada, solamente si la atmsfera consta nicamente de vapor. Por lo tanto, al
iniciar la operacin debe ser expulsado todo el aire que originalmente estaba en
el recinto de la autovlave y ser reemplazado por vapor, esto se logra mediante el
uso de una vlvula de vapor que permanece abierta mientras est saliendo aire
a travs de ella, pero que se cierra cuando la atmsfera est saturada de vapor
de agua. Si queda algo de aire seco dentro de la cmara de esterilizacin, la
presin parcial del vapor ser ms baja que la indicada en el manmetro y la
temperatura ser, por consiguiente, inferior. Por esta razn, una autoclave debe
estar siempre equipada con un medidor de presin y un medidor de temperatura.
La temperatura del interior de la cmara de esterilizacin puede vigilarse
incluyendo entre los objetos que se van a esterilizar papeles indicadores
especiales, que cambian de color si el tratameinto trmico ha sido adecuado.

2.1.2. Esterilizacin por tratamiento qumico

19
Muchas de las sustancias usadas para preparar medios de cultivo son
demasiado lbiles frente al calor para ser esterilizadas en la autoclave. Para tales
sustancias resulta extremadamente til un mtodo qumico fiable de
esterilizacin. El requerimeinto esencial para un agente qumico esterilizante es
que sea voltil as como txico, de manera que pueda ser fcilmente eliminado
del objeto esterilizado despus del tratamiento. El mejor candidato disponible es
el xido de etileno, un lquido que hierve a 10.7C. puede aadirse a las
disoluciones en forma lquida (a una concentracin final aproximada de 0.5 a 1.0
por ciento) a una temperatura de 0 a 4C, o bien puede usarse como gas
esterilizante a temperaturas por encima de su punto de ebullicin. Sin embargo,
es qumicamente inestable y se descompone en disolucin acuosa dando
etilenglicol, que no es voltil y puede tener efectos no deseables. Adems, el
xido de etileno es explosivo y txico para los seres humanos, por lo que es
preciso adoptar precauciones especiales para su manejo. Por estas razones la
esterilizacin con xido de etileno no se ha convertido en procedimiento de rutina
en el laboratorio. Se usa, sin embargo, en la industria para la esterilizacin de
placas de petri y de otros objetos de plstico que se funden a temperaturas
superiores a los 100C.

2.1.3. Esterilizacin por filtracin

El principal mtodo de laboratorio usado para esterilizar disoluciones de


materiales termolbiles es la filtracin a travs de filtros capaces de retener los
MO. La accin de estos filtros es casi siempre compleja. Los MO quedan
retenidos en parte por el pequeo tamao de los poros del filtro y en parte por
adsorcin a las paredes de los poros durante su paso a travs del filtro. La
importancia de la adsorcin est indicada por el hecho de que un filtro puede
retener eficazmente MO aun cuando el tamao medio del dimetro de los poros
sea algo mayor que el tamao medio de las clulas que son retenidas. La
esterilizacin por filtracin est sometida a una principal limitacin terica. Como
los virus van en tamao hasta las dimensiones de las grandes molculas de
protena, no quedan necesariamente retenidos en los filtros que pueden
apoderarse de los MO celulares ms pequeos. Por consiguiente, nunca es
posible tener certeza de que por los mtodos de filtracin que dejan una
disolucin libre de bacterias, se van a eliminar tambin los virus.

20
3. CRECIMIENTO MICROBIANO
3.1. Definicin de crecimiento

En cualquier sistema biolgico, el crecimiento puede ser definido como el


aumento ordenado de todos los componentes qumicos. El aumento de masa,
por s solo, podra no indicar un crecimiento real, ya que las clulas podran estar
incrementando su contenido nicamente de productos de reserva, por ejemplo
el glucgeno. En un medio adecuado, y al cual se han adaptado perfectamente,
las bacterias se encuentran en un estado de crecimiento equilibrado. Durante un
periodo de crecimiento equilibrado, una duplicacin de la biomasa va
acompaada de una duplicacin de todas las dems propiedades medibles de
la poblacin, por ejemplo, protenas, RNA, DNA y agua intracelular. En otras
palabras, los cultivos en crecimiento equilibrado mantienen una composicin
qumica constante. La existencia del crecimiento equilibrado simplifica la tarea
de medir la velocidad de crecimiento de un cultivo bacteriano; como la velocidad
de crecimiento de todos los componentes de una poblacin es la misma, la
medida de cualquier componente basta para determinar la velocidad de
crecimiento.

3.2. Naturaleza y expresin matemtica del crecimiento

Un cultivo microbiano en crecimiento equilibrado imita una reaccin


autocataltica de primer orden; es decir, la velocidad de aumento de bacterias en
un tiempo dado es proporcional al nmero o masa de bacterias presentes en ese
tiempo.

Velocidad de aumento de clulas = k (nmero o masa de clulas)

La constante de proporcionalidad, k es un ndice de la velocidad de crecimiento


y, por ello, se denomina constante de velocidad de crecimiento. Dado que
suponemos que el crecimiento es equilibrado, k tambin relaciona la velocidad
de crecimiento de cualquier componente celular determinado con la cantidad de
ese componente, lo que en trminos matemticos es:


= , =kX, = kZ

21
Donde N es el nmero de clulas/mL, X es la masa de clulas/mL, Z es la
cantidad de cualquier componente celular/mL, t es el tiempo y k es la constante
de velocidad de crecimiento. Estas ecuaciones describen adecuadamente el
crecimiento de la mayora de los cultivos de bacterias unicelulares.

Las poblaciones de bacterias que crecen de modo que se cumplen estas


ecuaciones se dice que estn en la fase exponencial o logartmica de crecimiento
(figura 3.1).

Las poblaciones microbianas raramente mantienen un crecimiento exponencial


a altas velocidades durante largo tiempo. La razn es evidente si se consideran
las consecuencias del crecimiento exponencial. Una sola bacteria con un peso
aproximado de 10-12 g y un tiempo de generacin de 20 minutos producir tras
48h de crecimiento exponencial una descendencia de 2.2X10 31g, es decir, unas
4000 veces el peso de la tierra.

El crecimiento de las poblaciones bacterianas est limitado normalmente por el


agotamiento de los nutrientes disponibles o por la acumulacin de productos
txicos del metabolismo. Como consecuencia, la velocidad de crecimiento
disminuye y el crecimiento llega a detenerse. En este punto se dice que el cultivo
est en la fase estacionaria. La transicin entre la fase exponencial y la
estacionaria implica un periodo de crecimiento desequilibrado, durante el cual
los diversos componentes celulares son sintetizados a diferentes velocidades.
En consecuencia, las clulas en la fase estacionaria tienen una composicin
qumica diferente a la de las clulas en fase exponencial. La composicin celular
en la fase estacionaria depende del factor limitante especfico del crecimiento. A
pesar de esto, pueden hacerse algunas generalizaciones:

Las clulas en la fase estacionaria son ms pequeas que en la fase


exponencial (dado que la divisin celular continua despus que el
incremento de masa se ha detenido)
Son ms resistentes a agentes fsicos (calor, frio, radiaciones) y qumicos
adversos.

Fase de muerte. Las clulas bacterianas mantenidas en un estado en el que no


hay crecimiento llegan a morir. La muerte es consecuencia de varios factores;

22
uno importante es el agotamiento de las reservas celulares de energa. Al igual
que el crecimiento, la muerte es una funcin exponencial y de aqu que en una
representacin semilogartmica la fase de muerte venga representada por una
disminucin lineal del nmero de clulas viables a lo largo del tiempo. La
velocidad de muerte de las bacterias es muy variable y depende tanto del
ambiente como del organismo en concreto.

Fase de latencia. Las clulas trasferidas de un cultivo en fase estacionaria en un


medio fresco de igual composicin experimentan un cambio de composicin
qumica antes de ser capaces de iniciar el crecimiento. Este periodo de ajuste
denominado fase de latencia, tiene una duracin muy variable.

NOTA: Fase lag = fase de latencia

Figura 3.1. Curva generalizada de crecimiento de un cultivo bacteriano

23
3.3. Tiempo de generacin y velocidad especfica de crecimiento

Durante la fase exponencial cada microorganismo se divide a intervalos


constantes. La poblacin ser el doble en un periodo especfico llamado tiempo
de generacin o tiempo de duplicacin.

Supongamos que se inocula un medio con una clula que se divide cada 20
minutos (tabla 3.1). La poblacin ser de dos clulas despus de 20 minutos, 4
clulas despus de 40 minutos y as sucesivamente. Debido a que la poblacin
es duplicada en cada generacin, el incremento en la poblacin es siempre 2 n.

Donde n es el nmero de generaciones

Tabla 3.1. Un ejemplo de crecimiento exponencial

Tiempo Nmero 2n Poblacin Log10Nt


de Divisin (N0X2n)
0 0 20=1 1 0.000
20 1 21=2 2 0.301
40 2 22=4 4 0.602
60 3 23=8 8 0.903
80 4 24=16 16 1.204
100 5 25=32 32 1.505
120 6 26=64 64 1.806

Estas observaciones pueden ser expresadas como ecuaciones para el tiempo


de generacin.

No=Poblacin inicial

Nt=Poblacin en un tiempo t

n=Nmero de generaciones en un tiempo t

De acuerdo a los resultados de la tabla

Nt=No X 2n

24
Resolviendo para n (nmero de generaciones) aplicando logartmos

logNt = logN0+nlog2

Despejando n

0 0
n= esto es igual a
2 0.301

Ahora, la velocidad de crecimiento durante la fase exponencial se puede


expresar por una constante () velocidad especfica de crecimiento o velocidad
de crecimiento medio.

=Nmero de generaciones por unidad de tiempo

0
= = 0.301

El tiempo de duplicacin o tiempo de generacin (td) se puede calcular

Si la poblacin se duplica t=td entonces:

Nt=2N0

Sustituyendo 2N0 en la ecuacin de

log(20)0 2+00
= =
0.301 0.301

1
=

El tiempo de generacin es el recproco de la velocidad especfica de crecimiento

td=1/

El tiempo de duplicacin puede determinarse directamente de una curva de


crecimiento y la velocidad especfica de crecimiento se calcula a partir del valor
de td.

O bien td puede calcularse a partir de las ecuaciones anteriores.

25
3.4. Medicin del crecimiento

Para seguir el curso del crecimiento es necesario efectuar mediciones


cuantitativas. El crecimiento exponencial es por lo general equilibrado, de modo
que para poder determinar la velocidad de crecimiento puede utilizarse la
medicin de cualquier propiedad de la biomasa. Las propiedades que
habitualmente se usan son la masa celular y el nmero de clulas.

3.4.1 Medicin de la masa celular

Peso seco. La nica manera directa de medir la masa celular es determinar el


peso seco del material celular en un volumen fijo del cultivo. Para ello, hay que
separar las clulas del medio, secarlas y pesarlas. Tal determinacin requiere
mucho tiempo y es relativamente poco sensible. Es difcil medir 1mg con un
equipo ordinario y sin embargo, este peso seco puede representar el equivalente
a 5000 millones de bacterias.

Mtodo ptico. La tcnica ms adecuada para medir la masa celular de los


microorganismos unicelulares es un mtodo ptico que consiste en medir la
cantidad de luz difractada por una suspensin clulas. Esta tcnica se basa en
el hecho de que las partculas pequeas difractan la luz, dentro de ciertos lmites,
de manera proporcional a su concentracin. Cuando un haz luminoso pasa a
travs de una suspensin bacteriana, la reduccin en la cantidad de luz
transmitida a consecuencia de la difraccin es pues una medida de la masa
bacteriana presente. Estas mediciones se realizan normalmente con un
fotmetro o un espectrofotmetro.

Un espectrofotmetro est equipado con un prisma o una red de difraccin que


permite la iluminacin de la muestra con luz de un margen estrecho y ajustable
de longitudes de ondas; un fotmetro tiene filtros intercambiables que permiten
pasar un margen relativamente amplio de longitudes de onda. Estos
instrumentos miden en unidades de absorbancia (A); la absorbancia se define
como el logaritmo del cociente entre la intensidad de luz incidente sobre la
suspensin I0) y la de la luz transmitida por la suspensin (I):

26
A=log (I0/I)

Estos instrumentos son adecuados para estimar concentraciones celulares y,


cuando se calibran con suspensiones bacterianas de concentracin conocida,
constituyen un mtodo exacto y rpido de determinar el peso seco bacteriano
por unidad de volumen del cultivo.

Las mediciones realizadas en un espectrofotmetro tienen significado cuando se


usan conjuntamente con una curva estndar. Como la difraccin es
inversamente proporcional a la cuarta potencia de la longitud de onda de la luz
que se difracta, la sensibilidad de las mediciones incrementa notablemente si se
utiliza luz de longitud de onda ms corta; en general, sin embargo, el lmite
inferior de sensibilidad del mtodo se alcanza cuando las suspensiones
bacterianas contienen unos 10 millones de clulas por mililitro. Para medir con
mayor sensibilidad las luz difractada existen instrumentos denominados
nefelmetros, que poseen un dispositivo sensor de luz colocado en ngulo recto
respecto al haz de luz incidente, por lo que pueden medir directamente la luz
difractada.

3.4.2. Medicin del nmero de clulas

Cmaras de recuento. El nmero de organismos unicelulares de una


suspensin puede determinarse microscpicamente contando las distintas
clulas que hay en un pequeo volumen medido con exactitud. Esta operacin
se lleva a cabo habitualmente en unos portaobjetos especiales denominados
cmaras de recuento. Estas cmaras van marcadas con cuadros de rea
conocida y admiten una fina capa de lquido de profundidad conocida entre el
portaobjetos y el cubreobjetos. Ello permite conocer exactamente el volumen de
lquido correspondiente a cada cuadrado de la cmara. El cmputo directo se
denomina recuento total de clulas e incluye tanto las clulas viables como las
no viables, ya que, al menos en el caso de las bacterias, no se puede distinguir
unas de otras por examen microscpico.

Contador de Coulter. Se hace pasar una parte pequea de la suspensin al


interior de un tubo de vidrio a travs de un orificio muy pequeo. Este orificio

27
cierra un circuito elctrico establecido, a travs del lquido de suspensin, entre
un electrodo del interior y otro del exterior del tubo.

La deteccin se basa en las diferencias de conductividad entre las bacterias y


el lquido de suspensin (que conduce bien la electricidad). La conductividad
disminuye cada vez que una bacteria pasa a travs del orificio; esto es detectado
y registrado electrnicamente. El aparato puede evaluar la magnitud y duracin
de los cambios de conductividad, por lo que puede registrar tanto el nmero
como la distribucin de tamaos de una poblacin celular. Los orificios que se
usan para contar bacterias tienen 30 micrmetros de dimetro. Por consiguiente,
el lquido de la suspensin debe estar escrupulosamente libre de partculas
extraas (por ejemplo, polvo), ya que las ms pequeas seran contadas como
clulas y las mayores obturaran el orificio.

Recuento en placa. El cmputo de organismos unicelulares puede tambin


realizarse por recuento en placa, ya que las clulas viables, separadas unas de
otras por dispersin sobre o dentro de un medio de agar, dan lugar al crecer a
colonias independientes visibles macroscpicamente; si se preparan diluciones
de una poblacin bacteriana y se siembra con ellas un medio adecuado puede
calcularse el nmero de clulas viables en la poblacin inicial contando el
nmero de colonias que se desarrollan despus de incubar las placas y
multiplicado dicho valor por el factor de dilucin.

Este mtodo de cmputo se denomina recuento viable, ya que en contraste con


el recuento microscpico directo y con el recuento electrnico, mide solo aquellas
clulas que son capaces de crecer en el medio empleado.

Medicin de un constituyente celular. Algunas veces, a causa del tipo de


crecimiento (las clulas pueden formar filamentos o grupos difcilmente
dispersables), o de la complejidad del medio, resulta muy poco prctico medir la
masa o el nmero de clulas. En estos casos, el crecimiento puede medirse
calculando la cantidad de un constituyente celular determinado por ejemplo:

Protenas
Pptidogicano
DNA, RNA

28
ATP

Con frecuencia, tales mediciones son tambin el mtodo ms prctico de calcular


la masa y el crecimiento microbianos en un ambiente mineral.

3.5.Rendimiento

La cantidad neta de crecimiento de un cultivo bacteriano es la diferencia entre la


masa celular (o nmero de clulas) utilizada como inculo y la masa celular (o
nmero de clulas) presente en el cultivo cuando se llega a la fase estacionaria.
Cuando el crecimiento est limitado por un nutriente determinado, existe una
relacin lineal fija entre la concentracin inicial de dicho nutriente y el crecimiento
neto resultante.

La masa de clulas producida por unidad de nutriente limitante es, por


consiguiente, una constante (Y) conocida como rendimiento. El valor de Y puede
calcularse a partir de mediciones del crecimiento total mediante la ecuacin:

Donde:

X=peso seco/mL de las clulas cuando el cultivo entra en la fase estacionaria

X0= peso seco/mL inmediatamente despus de la inoculacin

C= concentracin del nutriente limitante

3.6.Crecimiento sincrnico

El crecimiento de poblaciones bacterianas no permite concluir nada sobre el tipo


de crecimiento de las distintas clulas, ya que en la mayora de los cultivos
bacterianos el tamao celular, y por tanto, la edad celular estn distribuidos al
azar. Para obtener informacin sobre el tipo de crecimiento de las distintas
bacterias, debe recurrirse a los cultivos sincrnicos, es decir, a cultivos
compuestos por clulas que se encuentran todas en la misma etapa del ciclo

29
celular. Las mediciones llevadas a cabo en tales cultivos equivalen a las
realizadas en las mismas clulas.

Los cultivos sincrnicos de bacterias pueden obtenerse mediante diversas


tcnicas. La sincrona puede ser inducida por manipulacin, generalmente
cclica, de las condiciones ambientales. En determinadas bacterias esto se
consigue, o bien por cambios repetitivos de temperatura o bien suministrando
nutrientes a cultivos que acaban de entrar en la fase estacionaria.

Una poblacin sincrnica puede ser seleccionada a partir de una poblacin


aleatoria mediante la separacin fsica de las clulas que estn en la misma
etapa del ciclo celular. Esto se puede conseguir por filtracin diferencial o por
centrifugacin.

3.7.Cultivo por lote y cultivo continuo

Cultivo por lote. Es un sistema cerrado en el cual se suministra una


concentracin de nutrientes que al agotarse marcan el final del proceso.

Cultivo continuo. Es un sistema abierto, en el cual las condiciones ambientales


se mantienen constantes a travs del suministro de nutrientes y la remocin de
cultivo. El crecimiento se mantiene en la fase exponencial.

Existen dos tipos de sistemas utilizados en el cultivo continuo: quimiostato y


tubidiostato

Quimiostato (figura 3.2). Este sistema est diseado de tal forma que se pueda
suministrar medio fresco al cultivo a la misma velocidad que se retira medio que
contiene microorganismos (cultivo).

El medio de cultivo utilizado en un quimiostato contiene un nutriente


esencial en cantidades limitantes.
Debido a la presencia del nutriente limitante la velocidad de crecimiento
est determinada por la velocidad a la cual se alimenta medio fresco.
La densidad celular depende de la concentracin del nutriente limitante.

La velocidad del intercambio de nutriente es expresada como velocidad de


dilucin (D)

30
D=f/V

Donde:

f=velocidad de flujo (mL/h)

V=volumen del cultivo (mL)

Figura 3.2. Sistema de cultivo continuo: Quimiostato

Si la velocidad de dilucin aumenta a valores elevados se puede presentar el


lavado del cultivo (figura 3.3).

31
Figura 3.3. Velocidad de dilucin y crecimiento microbiano

Turbidiostato. Tiene una fotocelda que mide la absorbancia o turbidez del


cultivo.

La velocidad de flujo de medio fresco al cultivo es regulada


automticamente para mantener la densidad celular (turbidez).
El medio de cultivo contiene todos los nutrientes en exceso.
Opera mejor a altas velocidades de dilucin ya que ninguno de sus
nutrientes es limitante.

4. EFECTOS AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO


Las actividades de los microorganismos se ven afectadas por las condiciones
qumicas y fsicas del medio. El conocimiento de los efectos ambientales nos
permite explicar la distribucin de los microorganismos en la naturaleza y hace
posible disear mtodos que controlen o potencien las actividades microbianas.
Se pueden considerar muchos factores ambientales, pero hay cuatro factores
que tienen una funcin destacada en el control del crecimiento microbiano: la
temperatura, el pH, la disponibilidad de agua y el oxgeno.

4.1. Temperatura

La temperatura es uno de los factores ms importantes que afectan al


crecimiento y a la supervivencia de los microorganismos. A temperaturas muy

32
fras o muy calientes los microorganismos no crecern. Pero los valores
absolutos de estas temperaturas mnimas o mximas varan mucho entre
microorganismos diferentes y, por lo general, reflejan el rango de temperatura
media de su hbitat natural.

Temperaturas cardinales

La temperatura ejerce dos tipos de efectos opuestos sobre los organismos vivos.
A medida que se eleva la temperatura, las reacciones qumicas y enzimticas de
la clula son ms rpidas y el crecimiento se acelera. Sin embargo, por encima
de cierta temperatura algunas protenas particulares pueden sufrir daos
irreversibles. En consecuencia, dentro de un cierto margen, un aumento de
temperatura supone un incremento en el crecimiento y en el metabolismo hasta
un punto que tienen lugar las reacciones de inactivacin. Por encima de tal punto,
las reacciones celulares caen rpidamente a cero. As para cada organismo
existe una temperatura mnima por debajo de la cual no es posible el crecimiento,
una temperatura ptima a la que se produce el crecimiento ms rpido, y una
temperatura mxima por encima de la cual no es posible el crecimiento. La
temperatura ptima est siempre ms cerca de la mxima que de la mnima.
Estas tres temperaturas, se denominan temperaturas cardinales o
fundamentales.

La temperatura mxima de crecimiento de un microorganismo determinado


refleja probablemente la inactivacin de una o ms protenas en la clula. Sin
embargo, los factores que determinan la temperatura mnima de crecimiento de
un organismo no son tan claros. La membrana citoplasmtica debe estar en un
estado fluido para su correcto funcionamiento y tal vez la temperatura mnima de
crecimiento sea resultado de la congelacin de esas funciones de la membrana
en cuanto al transporte de nutrientes o a la formacin del gradiente de protones.

33
Figura 4.1. Efecto de la temperatura sobre la velocidad de crecimiento y consecuencias moleculares para la clula

4.1.1. Clases de microorganismos segn la temperatura

Se pueden distinguir cuatro grupos de microorganismos con relacin a su


temperatura ptima: psicrfilos, con temperaturas ptimas bajas; mesfilos,
con temperaturas ptimas moderadas; termfilos, con temperaturas ptimas
muy elevadas; e hipertermfilos, con temperaturas ptimas muy elevadas. Los
mesfilos se encuentran en animales de sangre caliente y en medios acuticos
y terrestres de latitudes templadas y tropicales. Los psicrfilos y los termfilos se
encuentran en ambientes muy fros o calientes, respectivamente. Los
hipertermfilos son tpicos de ambientes concretos extremadamente calientes
como fuentes termales, gisers y fuentes hidrotermales submarinas.

34
Figura. 4.2. Clases de microorganismos segn la temperatura

4.2. pH

Cada organismo tiene un rango de pH ptimo bien definido. La mayora crece en


un margen de pH de 2-3 unidades. La mayora de los ambientes naturales tienen
un valor de pH entre 5 y 9, y los organismos con pH ptimos de este orden son
los ms comunes. Solo unas cuantas especies pueden crecer por debajo de 2
o por encima de 10. Los organismos que crecen mejor a bajo pH constituyen un
tipo de extremfilos llamados acidfilos. El grupo de los hongos son ms
acidfilos que las bacterias. Muchos hongos crecen de forma ptima a pH 5 o
inferior e incluso algunos crecen bien a pH 2. Algunas bacterias tambin son
acidfilas. De hecho, algunas de estas bacterias son acidfilas estrictas,
incapaces de crecer a pH neutro.

El factor crtico ms importante para el carcter acidfilo estricto es la estabilidad


de la membrana citoplasmtica. Cuando el pH es neutro, la membrana
citoplasmtica de las bacterias muy acidfilas efectivamente se disuelve y las
clulas se lisan, lo que sugiere que para que la membrana citoplasmtica sea
estable se requieren altas concentraciones de iones hidrgeno.

Unos cuantos extremfilos presentan un pH ptimo de crecimiento muy elevado,


a veces tan alto como pH 10; se denominan alcalfilos. Los microorganismos
alcalficos se encuentran por lo general en hbitat muy bsicos como lagos y
suelos muy carbonatados. Sin embargo, los procariotas alcalficos mejor

35
estudiados han sido bacterias aerbicas no marinas, muchas de las cuales son
especies de Bacillus.

Cuando se considera para cada microorganismo particular el requerimiento de


un pH especfico para el crecimiento, hay que tener en cuenta que el pH ptimo
representa solo el pH del medio extracelular; el pH intracelular debe permanecer
prximo a la neutralidad para evitar la destruccin de las macromolculas
celulares que son sensibles al cido o al lcali. En los acidfilos o alcalficos
extremos, el pH intracelular puede variar algunas unidades respecto a la
neutralidad, pero en la mayora de los microorganismos cuyo pH ptimo para el
crecimiento est entre 6 y 8, el citoplasma permanece neutro o muy prximo a la
neutralidad.

4.3. Efectos osmticos sobre el crecimiento microbiano

El agua es el solvente de la vida. Todos los organismos necesitan agua y la


disponibilidad de agua es un factor importante que en la naturaleza determina el
crecimiento de microorganismos. La disponibilidad de agua no solo es funcin
del contenido del contenido en agua que est presente en un medio, es decir, de
la humedad o sequedad de un determinado hbitat, sino que tambin depende
de la concentracin de solutos, como sales, azcares y otras sustancias que
puedan estar presentes en el agua. Esto se debe a que las sustancias disueltas
tienen una cierta afinidad por el agua que hace que el agua asociada a los solutos
no est disponible para los microorganismos.

4.4. Actividad de agua, smosis y halfilos

La disponibilidad de agua se expresa en trminos fsicos como actividad de agua.


La actividad de agua, abreviadamente aw, es el cociente entre la presin de vapor
del aire en equilibrio con una sustancia o solucin y la presin de vapor del agua
pura a la misma temperatura. Los valores de a w varan entre 0 y 1.

El agua difunde desde una regin con alta concentracin de agua (baja
concentracin de solutos) hasta una regin con menor concentracin de agua
(mayor concentracin de solutos) por el proceso denominado smosis. En la
mayora de los casos, el citoplasma de una clula tiene una concentracin de
solutos mayor que el medio, por lo que el agua tiende a entrar al interior de la

36
clula, dicindose entonces que existe un balance de agua positivo. Sin
embargo, cuando una clula est en un medio con baja actividad de agua, existe
una tendencia del agua a salir de la clula.

En la naturaleza, los efectos osmticos tienen inters principalmente en hbitat


con altas concentraciones de sales. El agua de mar contiene aproximadamente
un 3% de NaCl adems de pequeas cantidades de otros minerales y elementos.
Los microorganismos marinos generalmente tienen una dependencia especfica
del ion sodio adems de tener un crecimiento ptimo al valor de actividad de
agua propio del agua de mar. Tales microorganismos se llaman halfilos. El
crecimiento de los halfilos requiere al menos algo de NaCl, pero el ptimo vara
con el organismo; as, se usan los trminos halfilos discretos y halfilos
moderados, para describir a los halfilos con requerimientos bajos (1-6%) y
moderados (6-15%) de NaCl, respectivamente.

La mayora de los microorganismos son incapaces de existir en ambientes con


actividad de agua muy baja y mueren, o se deshidratan y pasan a un estado de
latencia, en tales circunstancias. Los organismos halotolerantes pueden soportar
alguna reduccin en el valor a w del medio, pero generalmente crecen mejor en
ausencia de solutos aadidos. Por el contrario, algunos organismos se
desarrollan con muy baja actividad de agua, y estos son de gran inters, no solo
desde el punto de vista de su adaptacin a la vida en estas condiciones sino
tambin desde el punto de vista aplicado en la industria alimentaria, donde
solutos como la sal y la sacarosa se emplean frecuentemente como
conservantes para inhibir el crecimiento microbiano. Los organismos capaces de
crecer en ambientes muy salinos se llaman halfilos extremos y, segn las
especies, requieren 15-30% de NaCl para su crecimiento ptimo. Los
organismos capaces de crecer en ambientes con alta concentracin de azcares
se denominan osmfilos, y aquellos capaces de crecer en ambientes muy secos
(por la falta de agua) se llaman xerfilos.

4.4.1. Solutos compatibles

Cuando un organismo crece en un medio con baja actividad de agua solo puede
obtener agua del ambiente incrementando su concentracin interna de solutos.
Tal aumento puede llevarse a cabo aumentando el bombeo de iones inorgnicos

37
hacia el interior de la clula a partir del medio ambiente, o bien sintetizando o
concentrando un soluto orgnico.

El soluto utilizado en el interior de la clula para ajustar la actividad de agua del


citoplasma no debe inhibir los procesos bioqumicos celulares; tales compuestos
se llaman solutos compatibles. En los microorganismos existen diferentes
solutos compatibles. Todas estas sustancias son muy solubles en agua y se
trata de azcares o alcoholes derivados de azcares, de otro tipo de alcoholes,
de aminocidos o derivados de aminocidos o bien de iones potasio (de KCl).
Los solutos compatibles los sintetiza directamente el microorganismo o en
algunos casos los acumula del medio. La concentracin intracelular de los
solutos compatibles depende del nivel de los solutos externos, y para cada
organismo la cantidad mxima que pueden sintetizar o acumular es una
caractersitca gentica; esto origina que diferentes organismos puedan tolerar
diferentes rangos de potencial de agua.

4.5. Oxgeno

Como los humanos tienen necesidad absoluta de oxgeno molecualr (O 2) para


vivir, resulta fcil suponer que todas las formas de vida requieren tambin O 2.
Sin embargo, esto no es cierto y muchos microorganismos pueden (y algunos
deben) vivir en ausencia de O2. El oxgeno es poco soluble en agua y puede
consumirse rpidamente debido a las actividades respiratorias de los
microorganismos en los hbitats acuticos y hmedos (especialmente cuando
contienen abundancia de materia orgnica).

4.5.1. Clases de microorganismo en relacin al oxgeno


Los microorganismos son muy variados en cuanto a la necesidad o tolerancia
del oxgeno y se pueden dividir en varios grupos dependiendo del efecto del
oxgeno. Los aerobios son especies capaces de crecer a tensiones de oxgeno
normales (el 21% del aire es O 2) y muchos, incluso, pueden tolerar
concentraciones ms elevadas de oxgeno (oxgeno hiperbrico). Los
microaerfilos, por el contrario, son aerobios que pueden usar el O2 solo cuando
est presente a niveles ms bajos que en el aire, normalmente a causa de su
limitada capacidad para respirar o porque contienen alguna molcula sensible al
oxgeno, como por ejemplo alguna enzima lbil en presencia de oxgeno. Muchos

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aerobios son facultativos, lo que significa que en condiciones nutritivas y de
cultivo apropiadas pueden crecer tanto en condiciones aerbicas como
anaerbicas.

Algunos microorganismos n pueden respirar O 2; tales organismos se llaman


anaerobios. Existen dos clases de anaerobios: los anaerobios aerotolerantes,
que toleran el oxgeno y crecen en su presencia aunque no pueden usarlo, y los
anaerobios estrictos que son inhibidos o incluso mueren en presencia de
oxgeno.

Figura 4.1. (a) El oxgeno penetra solo una corta distancia en el tubo, de modo que los aerobios estrictos solo
crecen en la superficie; (b) Los anaerobios, como son sensibles al oxgeno, solo crecen lejos de la superficie;
(c) Los aerobios facultativos son capaces de crecer tanto en presencia como en ausencia de oxgeno crecen
por todo el tubo; (d) Los microaerfilos crecen apartndose de la zona ms txica; (e) Los anaerobios
aerotolerantes crecen por todo el tubo.

5. TRANSPORTE DE ELECTRONES

En la membrana interna de las mitocondrias, o en la membrana plasmtica de


las bacterias, se encuentran cuatro conjuntos oligomricos de protenas. Cada
complejo cataliza una parte separada del proceso de transduccin de energa. A
esos complejos se les asignan los nmeros I al IV. El complejo V es la ATP
sintasa.

39
5.1. Complejos I a IV
Los complejos de transporte de electrones se pueden difundir en forma
independiente en la membrana, pero tienden a formar grandes estructuras a
travs de interacciones dbiles mutuas. Los cuatro complejos enzimticos
contienen una gran variedad de centros xido-reduccin. Pueden ser cofactores,
como FAD, FMN o ubiquinona (Q). Otros centros tienen grupos de Fe-S,
coenzimas de protena como los citocromos, con contenido de hemo, y protenas
con cobre. El flujo de electrones se efecta por reduccin y oxidacin de esos
centros redox y el flujo va desde un agente reductor hacia un agente oxidante.

Los electrones pasan a travs de los componentes de una cadena de transporte


de electrones en direccin de mayor potencial de reduccin. Los potenciales de
reduccin de cada centro redox estn entre los del NADH, reductor enrgico
fuerte, y los del oxidante terminal, O 2. Las coenzimas mviles, ubiquinona (Q) y
citocromo c, sirven como eslabones entre distintos complejos de la cadena de
transporte de electrones. Q transfiere electrones de los complejos I o II al
complejo III. El citocromo c transfiere electrones del complejo III al complejo IV.
El complejo IV usa los electrones para reducir O 2 a agua.

5.1.1. Complejo I
El complejo I cataliza la transferencia de dos electrones desde NADH hasta Q.
El nombre sistemtico de esta enzima es NADH:ubiquinona oxidorreductasa. Es
una enzima muy complicada. Sus versiones procariotas contienen 14 cadenas
diferentes de polipptidos. Las formas eucariotas tienen 14 subunidades
homlogas, ms otras 20 a 32 subunidades, dependiendo de la especie. Es
probable que las unidades eucariticas adicionales estabilicen al complejo y
eviten fugas de electrones.

La estructura del complejo tiene forma de L. El componente unido a la membrana


consiste en subunidades mltiples que se extienden por la membrana. Este
mdulo contiene una actividad transportadora de protones. Un componente
mayor entra a la matriz mitocondrial, o al citoplasma en las bacterias. Este brazo
contiene una actividad terminal de NADH deshidrogenasa y FMN. El mdulo
conector est formado por subunidades mltiples con ocho o nueve grupos de
Fe-S.

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Las molculas de NADH en la superficie interna de la membrana donan
electrones al complejo I. Los electrones se pasan de dos en dos as como unin
hidruro (H-, dos electrones y un protn). En el primer paso de la transferencia de
electrones, el in hidruro es transferido a FMN y se forma FMNH 2. A continuacin
se oxida el FMNH2 en dos pasos a travs de una semiquinona intermedia. Los
dos electrones son transferidos uno por uno al siguiente agente oxidante, un
grupo de hierro-azufre.

FMN +H+ , +H- FMNH2 -H+,-e- FMNH -H+, -e- FMN

El FMN es un transductor que convierte la transferencia de dos electrones desde


las deshidrogenasas unidas a NAD en la transferencia de un electrn para el
resto de la cadena de transporte de electrones. En el complejo I, el cofactor
FMNH2 transfiere electrones a grupos de hierro-azufre enlazados en secuencia.
Hay al menos ocho grupos de Fe-S colocados dentro del mismo brazo del
complejo I que contiene la actividad de la NADH deshidrigenasa. Los grupos de
Fe-S proporcionan un canal para electrones que los dirige hacia la parte del
complejo enlazada a la membrana, donde la ubiquinona (Q) acepta electrones,
uno por uno, que pasan por un anin intermedio de semiquinona (*Q -) antes de
llegar a su estado totalmente reducido, el ubiquinol (QH 2).

Q +e- *Q- +e-, +2H+ QH2

Q y QH2 son cofactores liposolubles. Permanecen dentro de la bicapa lipdica y


pueden difundirse libremente en dos dimensiones. El sitio de unin de Q en el
complejo I est dentro de la membrana. Una de las razones para la complicada
cadena de transporte de electrones dentro del complejo I es llevar electrones
desde un ambiente acuoso a un ambiente hidrofbico en el interior de la
membrana.

A medida que los electrones atraviesan el complejo I, se transfieren dos protones


(uno que se origina en el in hidruro del NADH y otro del interior) al FMN para
formar FMNH2.Estos dos protones, o sus equivalentes, se consumen en la
reduccin de Q a QH2. As, se toman dos protones del interior y se transfieren a
la QH2. No se liberan al exterior en las reacciones del complejo I (despus, la

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QH2 se vuelve a oxidar por el complejo III, y entonces los protones son liberados
al exterior.

En el complejo I, hay cuatro protones translocados a travs de la membrana por


cada par de electrones que pasan de NADH a QH 2. stos no incluyen a los
protones que se requieren en la reduccin de ubiquinona.

5.1.2. Complejo II
El complejo II es la succinato:ubiquinona oxidorreductasa, y tambin se llama
complejo de succinato deshidrogenasa. Cataliza una de las reacciones del ciclo
del cido ctrico. El complejo II acepta electrones de succinato, e igual que el
complejo I, cataliza la reduccin de Q a QH2.

El complejo II contiene tres enzimas multisubunidad ednticas, que se asocian


para formar una estructura trimrica que est firmemente incrustada en la
mambrana. Su forma general se parece a un hongo con su cabeza (el
sombrerillo) entrando al interior del compartimento de la membrana. Cada una
de las tres enzimas succinato deshidrogenasa tiene dos subunidades que
forman la cabeza, y una o dos subunidades (dependiendo de la especie) que
forman el tallo (el pie del hongo) unido a la membrana. Una de las subunidades
de la cabeza contiene el sitio de unin con el sustrato, y una flavina adeninina
dinucletido (FAD) unida en forma covalente. La otra subunidad de la cabeza
contiene tres grupos Fe-S.

La secuencia de reacciones para la transferencia de dos electrones de succinato


a Q comienza con la reduccin del FAD por un ion hidruro. A ella le siguen dos
transferencias de un electrn, de la flavina reducida a la serie de tres grupos de
hierro-azufre.

En las reacciones catalizadas |por el complejo II se libera muy poca energa libre.
Eso quiere decir que el complejo no puede contribuir en forma directa al
gradiente de concentracin de protones a travs de la membrana. Ms bien
suministra electrones de la oxidacin de succinato, a medio camino en la
secuencia de transporte de electrones. Q puede aceptar electrones del complejo
I o II, y donarlos al complejo III, y por consiguiente al resto de la cadena de
transporte de electrones.

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5.1.3. Complejo III
El complejo III es ubiquinol: citocromo c oxidorreductasa, que tambin se llama
complejo citocromo bc. Esta enzima cataliza la oxidacin de molculas de
ubiquinol (QH2) en la membrana, y la reduccin de una molcula mvil e
hidrosoluble de citocromo c en la superficie externa. El transporte de electrones
a travs del complejo III se acopla en la transferencia de H + a travs de la
membrana por un proceso llamado ciclo Q.

La reaccin comienza cuando QH2 (del complejo I o del complejo II) se une al
sitio Q0 de la subunidad de citocromo b. QH2 se oxida a la semiquinona, y pasa
un solo electrn al complejo Fe-S adyacente en la subunidad de ISP. De all, el
electrn se transfiere al grupo hemo del citocromo c 1 esta transferencia se facilita
por el movimiento del grupo de

La cabeza de la ISP. En la posicin de aceptacin de electrones, el grupo de Fe-


S es adyacente al sitio Q0, y en la posicin de donacin de electrones, ese grupo
est cerca del grupo c1-hemo. El citocromo c se reduce por transferencia de un
electrn, de la subunidad de citocromo c 1 unido a la membrana, del complejo III.

En esta reaccin, el aceptor terminal de electrones es el citocromo c. Esta


molcula sirve como portador mvil de electrones, pasando electrones al
complejo IV, el siguiente eslabn de la cadena. El papel del citocromo c reducido
es parecido al de la QH2, que lleva electrones del complejo I al complejo III.

La oxidacin de la QH2, en el sitio Q0 es un proceso de dos etapas, y en cada


una se transfiere un solo electrn. La trayectoria de los electrones a partir del
segundo paso, oxidacin de la semiquinona intermedia, sigue una ruta distinta a
la del primer electrn. En este caso, el electrn pasa en secuencia a dos hemo
tipo b dentro de la parte de la membrana en el complejo. El primer grupo hemo
(bL) tienen menor potencial de reduccin, y el segundo hemo (b H) tiene mayor
potencial de reduccin.

El hemo bH es parte del sitio de Q1, donde se reduce una molcula de Q a QH 2


en una reaccin de dos pasos que implica una semiquinona intermedia. Se
transporta un solo electrn desde b L (en el sitio Q0) a bH (en el sitio Q1) y a Q,
para producir la semiquinona. Despus se transfiere un segundo electrn para

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reducir la semiquinona a QH2. El segundo electrn viene de la oxidacin de una
segunda molcula de QH2 en el sitio Q0. La segunda oxidacin de QH2 tambin
da como resultado la reduccin de una segunda molcula de citocromo c, ya que
los dos electrones de la segunda QH2 van por caminos separados. El resultado
neto es que la oxidacin de dos molculas de QH 2 en el sitio Q0 produce dos
molculas de citocromo c reducido y regenera una molcula de QH 2 en el sitio
Q1.

Durante la oxidacin de dos molculas de QH2 en el sitio Q0 se producen cuatro


protones. Esos protones son liberados al exterior del compartimento de la
membrana, y contribuyen al gradiente de protones que se forma durante el
transporte de electrones asociado a la membrana. Los protones se originan en
el compartimento interior. Quiz hayan sido tomados en las reacciones
catalizadas por el complejo I o el complejo II, o se pudieron haber derivado de
protones tomados en el interior de la membrana durante reduccin de Q en el
sitio Q1 del complejo III.

El mecanismo de traslocacin de protones se llama ciclo Q. la estequiometria de


la reaccin completa es la siguiente:

Q0: 2QH2 + 2 cit c(Fe3+) 2Q + 2cit c(fe2+) + 2e- + 4H+ ext

Q1: Q + 2H+ int + 2e- QH2

QH2 + 2cit c(Fe3+) + 2H+ int Q + 2 cit c(Fe2+) + 4H+ ext

As para cada par de electrones que pasa por el complejo III, desde QH 2 al
citocromo c, hay cuatro protones traslocados a travs de la membrana. Se
reducen dos molculas de citocromo c,y esos portadores mviles transportan a
un electrn, cada uno, al complejo IV. En realidad hay dos molculas de QH2 que
se oxidan (cediendo cuatro electrones), pero dos de esos electrones se reciclan
y regeneran una molcula de QH2.

La reaccin completa catalizada por la ubiquinona: citocromo c oxidorreductasa


(el complejo III) incluye al ciclo Q y la traslocacin de protones a travs de la
membrana. Se puede decir que esta reaccin es una de las ms importantes y
fundamentales en todo el metabolismo.

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5.1.4. Complejo IV
El complejo IV es la citocromo c oxidasa. Este complejo cataliza la oxidacin de
molculas de citocromo c reducido producidas por el complejo III. En la reaccin
se incluye una reduccin, con cuatro electrones, del oxgeno molecular (O 2) para
formar agua (2H2O), y la traslocacin de cuatro protones a travs de la
membrana.

El citocromo c se une a la subunidad II y transfiere un electrn al sitio Cu A. El par


de tomos de cobre en ese sitio puede aceptar y donar un electrn cada vez, en
forma muy parecida a un grupo de Fe-S. la reduccin completa de O2 requiere
cuatro electrones. As, cuatro molculas de citocromo c deben unirse y transferir,
uno tras otro, un solo electrn, cada uno al centro redox Cu A.

Los electrones se transfieren uno tras otro del sitio CuA al grupo prosttico hemo
a en la subunidad I. de ah se transfieren al centro binuclear hemo a 3-CuB. el
primer paso de la reduccin de oxgeno molecular en el centro binuclear consiste
en la descomposicin rpida del oxgeno molecular. Un tomo de oxgeno se
une al tomo de hierro del grupo de hemo a3 y el otro se une al tomo de cobre.
La protonacin que sigue, y la transferencia de electrn, da como resultado la
liberacin de una molcula de agua del sitio del cobre, seguida por la liberacin
de una segunda molcula de agua del ligando de hierro. La reaccin total
requiere la toma de cuatro protones de la superficie interna de la membrana.

O2 + 4e- +4H+ int 2H2O

Las reacciones de la citocromo c oxidasa se acoplan a la transferencia de


protones a travs de la membrana. Un protn se trasloca por cada electrn que
pasa del citocromo c al producto final (H 2O). Los protones se mueven por un
canal en el complejo IV y ese movimiento est impulsado por cambios de
conformacin en la enzima cuando se reduce el oxgeno. La estequiometria de
la reaccin completa catalizada por el complejo IV es:

4cit c 2+ +O2 + 8H+ int 4cit c 3+ + 2H2O + 4H+ ext

El complejo IV contribuye al gradiente de protones que impulsa la sntesis de


ATP. Se traslocan dos protones por cada par de electrones que pasan por este
complejo. Recurdese que el complejo I transfiere cuatro protones por cada par
de electrones, y que el complejo III tambin trasloca cuatro protones por cada
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par de electrones. Entonces por cada molcula de NADH que se oxida, el
sistema de tranporte de electrones asociado a membrana bombea diez protones,
que atraviesan la membrana.

5.1.5. Complejo V: ATP sintasa


El complejo V es la ATP sintasa. Cataliza la sntesis de ATP a partir de ADP + Pi
es una reaccin impulsada por el gradiente de protones generado durante el
transporte de electrones asociado a membrana.

Bibliografa
Horton, R., Laurence, M., Scrimgeour, G., Perry, M., & Rawn, D. (s.f.). Principios de Bioqumica
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