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Rpublique Algrienne Dmocratique et Populaire

Ministre de lEnseignement Suprieur et de la Recherche Scientifique

Facult des Sciences de la Nature et de la Vie et Sciences de la Terre et de


lUnivers
Dpartement dAgronomie
Mmoire

Pour lObtention du Diplme Master en Agronomie


Option : Technologie des Industrie Agro-Alimentaire

Thme

Recherche de bactriocines produites par les bactries lactiques isoles du


lait de chamelle

Prsent par :

Mme : MEHIDI N BENGUELLA NASSIMA

Devant le jury:

Mr BENAMMAR CH., M.C.A Prsident


Mr BENYOUB N., M.A.A Examinateur
Mme BARKA S., M.C.A Promoteur

Anne universitaire : 2014-2015


REMERCIEMENTS

Mes profonds remerciements vont ALLAH qui ma aid pour effectuer ce travail.

Je remercie en deuxime lieu mon promoteur Monsieur S. BARKA pour la proposition de ce thme
ainsi que pour sa comprhension et pour laide quil ma prodigu

Je tiens galement remercier vivement les responsables de laboratoire sciences agronomique


universit de tlemcen de mavoir permis dutiliser le laboratoires et le matriel.

Mes remerciements sadressent galement MrRACHID. laborantin, pour son aide


prcieuse ainsi qu Mlle. Atika pour sa gentillesse et son aide.

Mes remerciements sadressent enfin mes chers adorables parents, mon mari, mes frres et
toute personne ayant particip deprs ou de loin la ralisation de ce travail.

2
Rsum

Lobjectif de ce travail est disol et didentifi des souches lactiques msophiles


ouThermophiles a partir du lait de chamelle, qui sont capable dinhib la prolifration
de bactrie pathogne StaphylococcusaureusSTA-49444 et Escherichia coli ATCC
25922 qui cause laltration des aliments. A partir de10 souches initialement isoles
et caractrises 5 avaient un rsultat positif. Nous avons aussi test le pouvoir
bactriocinognes des souches isol du lait de chamelle par la mthode des spots.
Les 5 souches ont donn des zones dinhibition lgard de la souche
cibleStaphylococcusaureus, avec des diamtres de 10mm , 10mm, 12mm, 11mm, et
10mm, pour les souches Lc1, Lc2, Lc3, Lc4,et Lb5 respectivement.et des diamtres
de 8mm , 6mm, 11mm, 13mm, et 9mm pour les mme souches lactiques.
En tenant compte de leur activit anti-bacterienne marque et leur large spectre
dactivit contre les bactries indsirables, certaines des souches isoles dans cette
tude pourraient tre des candidats potentiels utilisables dans la bioconservation des
produits alimentaires et dans la transformation biotechnologique de lait.

Mots cls : lait de chamelle, Bactries lactiques ;bactriocine ; pathogne.

5

10 5
SPOTS Staphylococcus
1010 12 11 10 Lb5 Lc4 Lc3 Lc2 Lc1
86 11 13 9 Escherichia coli

.

Escherichia coli Staphylococcus

4
Abstract ;

The main of this work is to isolate and identifie strains of lactic mesophilic or
Thermophiles from camel milk, which are able to inhibit the proliferation of
pathogenic bacterium Staphylococcus aureus STA-49444 and Escherichia coli ATCC
25922 wich spoil aliments .From 10 strains isolated and characterized initially 5 had a
positive result. We also tested their antibacterial effects of isolated strains of camel
milk by spotlights method.

The 5 strains gave zones of inhibition with respect towards strain Staphylococcus
aureus, with diameters of 10mm, 10mm, 12mm, 11mm, and 10mm, for strains Lc1,
Lc2, Lc3, LC4 and LB5 respectively .and 8mm diameter, 6mm, 11mm, 13mm and
9mm for the same lactic strains.

Taking account of their anti-bacterial effect and their broad spectrum acts against
undesirable bacteria, some strains isolated in this study could be potential candidates
for use in the food and bioconservation in biotechnology milk processing.

5
Liste des tableaux

Tableau 1: Classification des bactriocines des bactries lactiques (Cotter et al.,2005).

Tableau 02: Origine des diffrentes souches tudies.

Tableau 03: Observations culturales et morphologiques des bactries lactiques,

Tableau 04 : Les observations microscopiques et biochimiques prliminaires des souches isoles

Liste des figures

Figure 01 :Dendrogramme illustrant les relations phylogntiques delordre Lactobacillales dans la

classe des bacilli (De Vos et al., 2009).

Figure 02 : Aspect macroscopique des colonies de Bactrie lactique sur milieu MRS,

Figure 03 : Aspect macroscopique des colonies de Bactrie lactique sur milieu MRSliqide,

Figure 04 : Test la catalase,

Figure 05 : Diamtre dinhibition en mm des souches lactique en prsence dEscherichiacoli

Figure 06 : Activit antibactrienne des diffrents souches lactiques (Souche exprimentale)

Figure 07 : Diamtre dinhibition en mm des souches lactique en prsence de

Staphylococcus aureus STA 49444

Figure 08 : Activit antibactrienne des diffrents souches lactiques (Souche exprimentale

6
Liste des abrviations

% : pourcentage
C : Degr Celsius
ADN : Acide DsoxyriboNuclique
ARN : Acide Ribonuclique
BHIB: bouillon cur cervelle
cm : centimtre
CO2 : Dioxyde de carbone
DLC : Date limite de consommation
EFFCA : European Food and Feed Culture Association
FAO : Food and Agriculture Organisation (Organisation des Nations Unies pour lalimentation et
lagriculture)
g : gramme
GRAS : Generallyrecognised as safe (gnralement reconnu sans risques)
h: heure
H2O2 : leau oxygne
H2S : Sulfure d'hydrogne
LAB :Lactic acid bacteria
min: minute
ml: millilitre
mm: millimtre
MRS : de Man Rogosa Sharpe
N : normalit
NaCl: chlorure de sodium
NADH : Nicotinamide adnine dinuclotide dhydrogne
NaOH: Hydroxyde de sodium (soude)
OMS : organisation mondiale de la sant
pH: potentiel dhydrogne
QPS:QualifiedPresumption of Safety
spp. : species
T : temprature
t: tonne
UFC : unit formant colonie
UV : ultra-violet

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Table des matires

INTRODUCTION .10
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Chapitre 1 : Gnralit sur le lait de chamelle et les bactries lactiques :
1-1 Dfinition du lait de chamelle .13
1-2 Caractristiques du lait de chamelle..13
1-2-1 Caractres physiques et organoleptiques.13
1-2-1-1 Composition chimique.13
1-2-1-2 La matire grasse 14
Chapitre 2 : Les bactries lactiques..16
2-1 Dfinition et caractristiques16
2-2 Classification des bactries lactiques16
2-3 Voies mtaboliques21
2-4 Intrt des bactries lactiques.21
2-4 Dans lindustrie alimentaire.21
2-5 Dans le domaine thrapeutique..22
CHAPITRE 3 : Les bactriocines des bactries lactiques
3-1 Dfinition et caractristiques principales.24
3-2 Nomenclature...24
3-3 Nature..24
3-4 Caractristiques25
3-5 Proprits25
3-6 Classification25
3-7 Mode daction...26
3-8 Conditions de production.27
3-9 Facteurs influenant la production des bactriocines.28
3-9-1 Temprature et pH..28
3-9-2 Composition du milieu de culture...28
3-9-3 Temps dincubation.....29
3-10 Les applications des bactriocines.29
3-10-1Dans le secteur alimentaire....29
3-10-2Dans le secteur sanitaire.....31
CHAPITRE 4 : Mise en vidence et purification des bactriocines
8
4-1. Mise en vidence de lactivit bactriocinogne33
ETUDE EXPERIMENTALE
Matriel et mthodes
1 Matriel utilis.........................36
1-1 Milieux de culture...36
1-2 Produits chimiques36
2 Les souches pathognes.36
.3 Mthodologie...........................37
4 Prlvement et collection des chantillons 37
5 Isolement et purification des bactries lactiques37
5-1 Isolement et identification des souches lactiques msophiles..37
6 .Caractres biochimiques et physiologiques37
7 Pouvoir antibactrien des souches38
8 technique utilise..38

RESULTATS ET DISCUSSIONS
1. Caractristiques des isolats ...41
2 Caractre microscopique .....42
3 Spectre dactivit......................42
3.1 Activit antagoniste de souches vis--vis dEscherichia coli ..42
3.2. Activit antagoniste de souches vis--vis de Staphylococcus aureus ..44
CONCLUSION

9
INTRODUCTION
Les bactries pathognes sont lorigine de diverses pathologies et intoxication alimentaires, cest pourquoi
les antibiotiques ont t utiliss pour les liminer. Ceci a conduit lmergence du phnomne
dantibiorsistance menaant la sant publique. Pour faire face ce problme les tudes sont actuellement
orientes vers la recherche de substances naturelles entre autres les bactriocines des bactries lactiques.

Les bactries lactiques sont largement utilises dans lindustrie alimentaire, en tant que starters dans les
procds de fermentations afin de rpondre aux exigences croissantes des consommateurs en produits
alimentaires moins traits et exempts de conservateurs chimiques. Leur apports bnfiques consistent
lamlioration de la qualit des produits ferments en y dveloppant certaines caractristiques
organoleptiques, sans altrer le got ni lodeur, et en augmentant leur dure de conservation. Cette
prservation est confre par la production de plusieurs mtabolites ayant une activit antimicrobienne tels
que les acides organiques, le peroxyde dhydrogne, le dioxyde de carbone, la reutrine, le diactyl et les
bactriocines (Dortu et Thonart, 2009; Moraes et al., 2010 ).

Lintrt des bactriocines des bactries lactiques rside dune part dans leur effet antimicrobien spectre
large ou troit et dautre part dans leur sret pour la sant humaine, vue leur sensibilit aux protases
digestives, et leur non toxicit pour les cellules eucaryotes. Ces substances antimicrobiennes ont la capacit
de cibler slectivement les bactries pathognes ou altrantes, sans pour autant inhiber les bactries
indispensables. Ces substances bioactives prsentent galement une grande tolrance aux variations de pH et
aux traitements thermiques. Tous ces critres suggrent que les bactriocines peuvent tre un substituant
idal des conservateurs chimiques (Dortu et Thonart, 2009).

Ce travail sinscrit dans le cadre de la recherche de bactriocines produites par les bactries lactiques
essentiellement partir de biotopes peu explors comme le lait de chamelle. Des bactries lactiques ont t
isoles de laitde chamelle crus algriens et mises en interaction avec des bactries pathognes ; pour
observer la production de bactriocines.

10
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

11
Chapitre 1 :

Gnralit sur le lait de chamelle et les bactries lactiques

Chapitre 1 : Gnralit sur le lait de chamelle et les bactries lactiques :

1-1 Dfinition du lait de chamelle :

12
Le lait de chamelle constitue depuis des temps trslointains , la principale ressource alimentaire pour les
peuplades nomade qui le consomment habituellement a ltat cru ou fermente . il est considr comme
laliment de base pour une priode annuelle prolonge ,dans la plupart de ces zone pastorales sahariennes
physico-chimique relativement similaire a celle du lait bovin , se lait se singularise nanmoins par une
teneurleve en vitamine C et en niacine et par la prsence dun puissant systme protecteur, li des taux
relativement levs en Lysozyme, en Lactoproxydase (systme LP/ SCN/ H2O2), en Lactoferrine et en
Bactriocines produites par des bactries lactiques .se si prolonge naturellement sa conservation de quelques
jours sous des temprature relativement leves. (Sboui ,2009)

1-2 Caractristiques du lait de chamelle

1-2-1 Caractres physiques et organoleptiques

Le lait de chamelleest de couleur blanche, en raison notamment de la structure et de la composition de sa


matire grasse, relativement pauvre en carotne (Sawaya et al, 1984). Il est lgrement sucr, avec un
gout acide, parfois mme sal (Abdel-Rahime, 1987) et / ou amre (Ramet, 2003). Cette variabilit dans le
gout est li au type de fourrage ingr ainsi qu la disponibilit en eau (Yagile et Etzion, 1980 ; Wangoh et
al, 1998 ) le pH du lait camelin se situe au tour de 6,6 et lacidit est de lordre de 15 Dornic. Sa densit
oscille entre 0,99 et 1,034 avec une viscosit moyenne de 2,2 centipoise (Hassane et al, 1987) et un point de
conglation variant de -0,53 -0,61C.

1-2-1-1 Composition chimique


La composition chimique globale du lait de chamelle, mme si elle fluctue selon les auteurs (donc selon les
animaux et lenvironnement considr), montre nanmoins des teneurs importante et quilibr en nutriments
de base (protines, matire grasses et lactose) avec des proportions similaires celles prsentes dans le lait
de vache. Les teneurs en protines et en matire grasse carient respectivement de 2,5 4% et de 1,1 4,6%
(avec une frquence de leve des taux suprieurs 3%), alors que la teneur en lactose fluctue 2,5 et
5,6% .(Siboukeur ,2009).
La concentrations levesobserves pour se dernier nutriment expliqueraient la saveur parfois sucre du lait
de chamelle rapporte par plusieurs auteurs (Gnan et Shereha, 1986 ; Bayoumi, 1990) .
La teneur en eau du lait camelin, qui varie selon son apport dans lalimentation, atteint son maximum
pendant la priode de scheresse. En effet il a t montr que la restriction en eau alimentaire des chamelles
se traduit par une dilution du lait: un rgime riche en eau donne un lait ayant un taux de 86% alors que dans
un rgimedficient, celui-ci slve 91% (Yagil et Etzion, 1980 ; Faye et Mulato, 1991). Cette dilution
pourrait tre leffet dun mcanisme dadaptation naturelle pourvoyant en eau les chamelons durant la
priode de scheresse.
13
Les sels minrauxprsents dans le lait de chamelle sont aussi diversifies que se rencontrs dans le lait de
vache. On y dnombre en effet des macro et des oligo-lments qui se trouvent sous forme de sels
(phosphates, chlorures et citrates) ou de mtaux divers (sodium, potassium, fer, cuivre, zincetc.).
Le lait de chamelle se singularise par sa richesse relative en vitamine B3 (niacine) et en vitamine C. mme
si des variations importantes de 25 60 mg/l) de la teneur de cette dernire dans le lait camelin sont
rapports (Farah, 1993), il nen demeure pas moins que les teneurs signales (autour de 36 mg/l selon Farah
et al, 1992) sont en moyenne 3 fois plus leves que celles prsentes dans le lait bovin, qui ne dpassent pas
22 mg/l selon Mathieu (1998). Cette caractristique est particulirementintressante, car elle permet au lait
de cette espce, par son apport important en cette vitamine, de rpondre aux besoins nutritionnels, aussi bien
du jeune chamelon que des populations locales , qui vivent dans un environnement ou lapport en ce type de
vitamine est particulirement limit.
Farah (1993) signale que le lait camelin contient des teneurs plus faible en vitamines A et E et en
certaines vitamines du groupe B (vitamine B2,B5 et B9).

1-2-1-2La matire grasse

Lamatire grasse laitire qui reprsente une source importante dnergie, est constitue essentiellement de
lipides et de substances lipodiques. Nanmoins des composs protiques sont prsents dans la membrane du
globule gras. Elle constitue galement, un apport important en acides gras essentielle et en vitamines
liposolubles.
Les quelques tudes consacres cette matire ont mis en vidence son apport quantitatif et qualitatif (
Glass et al, 1967 ; Hagrass et al, 1987) .
Nanmoins, pour ce dernier volet, la composition et les proprits physicochimiques et structurales de cette
matirelipidique nont fait lobjet que de quelques investigations limites

14
Chapitre 2 :
Les bactries lactiques

Chapitre 2 : Les bactries lactiques

2-1 Dfinition et caractristiques

Les bactries lactiques sont des cellules procaryotes organotrophes formant un groupehtrogne constitu
de cocci et de bacilli (Badis et al., 2005). Ce sont des bactries Gram positif dont la teneur en guanine et
cytosine (G+C) est infrieure 50%. Elles sont asporulantes, aro anarobie facultatives ou micro-
arophiles, mtabolisme fermentaire strict, acido-tolrantes et capables de crotre des tempratures
comprises entre 10C et 45C et des pH allant de 4.0 4.5. Ces bactries sont gnralement immobiles et
se caractrisent par la production dacide lactique comme produit majeur du mtabolisme. Leur division se

15
droule sur un seul plan lexception des genres : Pediococcus, Aerococcus, et Tetragenococcus. (Salminen
et al.,2004; Knig et Frhlich, 2009 ; Pringsulaka et al., 2011).

En gnral ces bactries ne possdent ni catalase, ni nitrate rductase, ni cytochrome oxydase ( lexception
de quelques souches sous certaines conditions), elles sont protolytiques, ne liqufient pas la glatine, et ne
forment plus dindole ni dhydrogne sulfureux, ces bactries sont galement incapables de fermenter le
glycrol (Dellaglio et al., 1994; Salminen et al., 2004).
En plus de lacide lactique et des autres acides organiques qui empchent le dveloppement des
microorganismes indsirables par diminution du pH du milieu, les bactries lactiques produisent dautres
mtabolites ayant des proprits antimicrobiennes tels que le peroxyde dhydrogne, le diactyl, la reutrine,
le dioxyde de carbone et les bactriocines (Dortu et Thonart, 2009).

Les bactries lactiques colonisent les habitats riches en nutriments, tels les plantes, les fruits, les produits
laitiers, les eaux et les eaux uses, les jus, ainsi que les cavits buccales, vaginales et intestinales de
lhomme, sans pour autant lui provoquer des maladies, lexception de quelques cas causs par les
streptococci et certains lactobacilli (Knig et Frhlich, 2009).

2-2 Classification des bactries lactiques

La classification phnotypique des bactries lactiques est largement base sur lamorphologie, le mode de
fermentation de glucose, la croissance diffrentes tempratures, lacapacit de croissance de hautes
concentrations de sel (6.5%, 18%), la tolrance aux pHacides, alcalins et lthanol, la configuration de
l'acide lactique produit partir de glucose,lhydrolyse de larginine, la formation dactone, etc. Les
marqueurs chimiotaxonomiquescomme la composition en acides gras et les constituants de la paroi
cellulaire peuvent aussitre utiles dans la classification (Knig et Frhlich, 2009).Lidentification des espce
de bactries lactiques peut tre ralise par lanalyse de leurprofil fermentaire des carbohydrates laide du
systme API50CH (Curk et al., 1993).
Lanalyse comparative des squences dARN ribosomal 16S a entrain des
changements importants dans la taxonomie des bactries lactiques (Salminen et al., 2004). Selon la dernire
dition de Bergeysmanual of systematicbacteriology(2009), les bactries lactiques sont classes dans le
Phylum des Firmicutes, la Classe des Bacilliet lOrdre des Lactobacillalesrenfermant trente cinq genres
rpartis sur six familles (Fig.1). Parmi ces genres, seulement douze sont utiliss dans la biotechnologie
alimentaire, il sagit de :

Aerococcus : les cellules de ce genre sont de forme ovode (1-2m de diamtre), -

16
hmolytiques, non-gazognes, arginine(-), pouvant croitre une concentration de 6.5% de NaCl, la division
se droule sur deux plans formant ainsi des ttrades. Cependant, des cellules isoles ou en paires peuvent
tre observes au milieu de la phase exponentielle.
Carnobacterium : ce genre est constitu de btonnets courts parfois incurvs isols ou en paires,
psychrotolrants, pouvant se dvelopper pH : 9 et incapables de croitre 8% de NaCl ; quelques espces
sont catalase (+) en prsence dhme.

Enterococcus : ce genre comprend des cellules ovodes isoles, en paires ou en courtes chaines,
homofermentaires. Quelques espces sont mobiles par des petits flagelles et dautrespossdent une pseudo-
catalase. Ce genre se caractrise par sa tolrance 6.5% de NaCl, au pH : 9.6 et par la croissance 10C et
45C avec une temprature optimale de croissance de 35C 37C.

Lactobacillus : les cellules de ce genre sont soit des bacilles longs parfois incurvs ou des coccobacilles
courts isols, comme elles peuvent former des chaines. Elles sont gnralement immobiles lexception de
quelques espces qui possdent des flagelles pritriches. Les souches sont acidophiles et peuvent croitre un
pH gal 5 ou moins avec un optimum de5.5 6.2. La temprature optimale de croissance est de 30C
40C, mais peuvent croitre un intervalle de temprature allant de 2C 53C. Les thermophiles sont
incapables de se dvelopper moins de 15C.
Le genre Lactobacillus peut tre divis en trois groupes : homofermentaires stricts,
htrofermentaires facultatifs et htrofermentaires stricts.

Lactococcus : les cellules de ce genre sont sphriques ou ovodes isoles, en paires, ou en chaines. De type
msophiles, leur temprature optimale varie de 10 40C mais sont incapables de se dvelopper 45C.
Celles-ci se dveloppent gnralement 4% de NaCl et un pH proche de la neutralit, leur croissance
sarrtant lorsque le pH du milieu atteint 4,5. Ce genre est un habitant typique des plantes, des animaux et de
leurs produits.

Leuconostoc : ce genre comprend 10 espces fastidieuses dans leurs exigences


nutritionnelles, les cellules sont ellipsodales sphriques gnralement allonges qui sarrangent en paires
ou en chaines, non acidophiles avec un pH optimum de croissance gal 6.5. Nanmoins, certains
leuconostocs peuvent croitre mme un pH de 4,5. La temprature optimale est comprise entre 20C et
30C mais la croissance peut aussi avoir lieu mme 5C. Les leuconostocs sont des htrofermentaires
obligatoires. Sur un milieu concentr en saccharose, certaines souches produisent des dextranes
extracellulaires.

17
Oenococcus : les cellules sont immobiles, asporulantes de forme ellipsodale sphrique, avec un
arrangement en paires ou en chaines, non hmolytiques et gnralement non protolytiques. Elles exigent un
milieu riche en acides amins et en facteurs de croissance, leur pH optimum tant de 6 6,8 et la
temprature optimale de 20C 30C.

Pediococcus : ce genre est reprsent par neuf espces ayant un mtabolisme


homofermentaire. Il rassemble des cellules immobiles de forme sphrique parfois ovodes, isoles ou en
paires qui se divisent dans deux directions perpendiculaires formant ainsi les ttrades mais jamais les
chaines. Certaines espces produisent une catalase ou une pseudocatalase. Les cellules sont acidophiles mais
non halophiles et crossent pH : 5 mais pas pH : 9, la temprature optimale de croissance varie de 25C
35C.

Streptococcus : les cellules de ce genre sont immobiles, sphriques ou ovodes qui ont un diamtre infrieur
2m avec une disposition en paires ou en chaines longues. Lafermentation des carbohydrates produit
principalement de lacide lactique mais il ny a pas deproduction de gaz. Le peptidoglycane est du groupe A
et leur temprature optimale de croissance est 37C. Elles sont incapables de se dvelopper 15C et pH:
9.6. Beaucoup despces sont commensales ou parasites de lhomme et des animaux et certaines sont
hautement pathognes.

Vagococcus : les cellules sont ovodes isoles, en paires ou en chaines. La plupart des espces sont mobiles
par des flagelles pritriches. Elles sont capables de croitre 10C mais non 45C sans production de gaz ni
darginine dihydrolase (ADH).

Tetragenococcus : ce genre rassemble des cellules immobiles, sphriques ou ovodes avec un diamtre de
0.5-1.0 m formant des ttrades aprs leur division dans deux directions perpendiculaires; comme elles
peuvent tre isoles ou en paires. Le mtabolisme des ttragenococci est homofermentaire. Ils ne produisent
pas de CO2 partir de glucose comme ils sont incapables de rduire les nitrates ni dhydrolyser larginine.
Leur temprature optimale de croissance se situe entre 25C et 35C et ne peuvent pas croitre 10C et
45C.

Weissella : les cellules de ce genre sont ovodes ou de courts btonnets extrmits rondes qui sassocient
en paires ou en courtes chaines. Elles sont immobiles et htrofermentaires. La temprature optimale de
croissance est de 15C, mais quelques espces peuvent crotre entre 42C et 45C.
Parmi tous ces genres cits, seulement cinq (Aerococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostocet
Pediococcus) rpondent aux caractristiques gnrales dune bactrie lactiquetypique (Salminen et al.
2004).
18
Fig.1. Dendrogramme illustrant les relations phylogntiques de
lordre Lactobacillales dans la classe des bacilli (De Vos et al., 2009).

19
2-3 Voies mtaboliques

En se basant sur la voie emprunte et le produit final de la fermentation, les bactries lactiques sont divises
en deux groupes (fig.2):

- Homofermentaires : toutes les bactries lactiques ( lexception des genres : Leuconstoc,Oenococcus,


Weissellaet certains membres du genre Lactobacillus ) entravent la voie de la glycolyse pour dgrader les
hexoses (ex : glucose). Aprs son transfert vers la cellule, le glucose subit une phosphorylation pour se
transformer en fructose qui est son tour phosphoryl en fructose 1-6 di-phosphate puis cliv en
dihydroxyactone phosphate et glycraldhyde phosphate (GAP), ces deux derniers sont convertis en
pyruvate.

Le pyruvate est dans une dernire tape rduit en acide lactique qui est le produit unique: cest la
fermentation homolactique. Dans les conditions dfavorables telles la limitation du glucose, ces bactries
produisent galement lacide formique, lacide actique, lthanol et/ou le CO2 par la voie de fermentation
des acides mixtes (Mozzi et al., 2010)

- Htrofermentaires : ce groupe de bactries lactiques utilise la voie des pentoses


phosphate (ou 6-phosphogluconate) qui consiste une dshydrognation du glucose, aprs sa
phosphorylation, pour donner le 6-phosphogluconate qui subira une dcarboxylation. Le pentose rsultant
est cliv en glycraldhyde phosphate (GAP) qui suit la voie de la glycolyse donnant lacide lactique et
lactyle phosphate qui sera rduit en thanol. En raison de la production de CO2, dthanol ou de lactate
en plus de lacide lactique, cette fermentation est appele htrolactique (Salminen et al., 2004).

2-4 Intrt des bactries lactiques


20
Les bactries lactiques jouent un rle important que ce soit dans lindustrie alimentaire ou dans le domaine
thrapeutique.

2-4 Dans lindustrie alimentaire :


les bactries lactiques sont impliques dans la fermentationet la bioconservation de diffrents aliments.
Ainsi, les souches de Lactobacillus bulgaricus,Sterptococcusthermophilussont utilises pour la production
du yaourt, des fromages et des laits ferments (Yateem et al., 2008). Le vin, les poissons, les viandes, les
charcuteries, le pain au levain entre autres sont aussi des produits de fermentation par des bactries lactiques
(Badis et al., 2005). Lutilisation de ces dernires a pour but lamlioration des caractristiques
organoleptiques des produits ferments et laugmentation de leur dure de conservation sans lutilisation de
conservateurs chimiques grce aux substances
antimicrobiennes quelles secrtent (Dortu et Thonart, 2009). Les souches utilises en industrie alimentaire
doivent rpondre certains critres : absence de pathognicit ou activit toxique, capacit damliorer les
caractristiques organoleptiques, capacit de dominance, facilit de culture et de conservation, et
maintenance des proprits dsirables durant le stockage (Marth et Steele, 2001).

2-5 Dans le domaine thrapeutique :

tant des probiotiques, les bactries lactiques apportent des bnfices lhte en confrant une balance de la
microflore intestinale, et en jouant galement un rle important dans la maturation du systme immunitaire
(Yateem et al.,2008). Diffrentes tudes ont dmontr le rle prventif aussi bien que curatif de ces bactries
sur plusieurs types de diarrhes (Mkrtchyan et al., 2010). Dautres ont cit leur capacit de diminuer les
allergies lies aux aliments grce leur activit protolytique (El-Ghaish et al.,2011). Uehara et al., (2006)
ont dmontr la capacit des souches de Lactobacillus crispatus, utilises sous forme de suppositoires pour
empcher la colonisation du vagin par les bactries pathognes et de prvenir ainsi les rechutes chez les
femmes qui souffrent dinflammations frquentes et rptes de la vessie.

21
CHAPITRE 3 :
Les bactriocines des bactries lactiques

22
CHAPITRE 3 : Les bactriocines des bactries lactiques

3-1 Dfinition et caractristiques principales

La dfinition qui tait la plus accepte donne aux bactriocines est celle de Klaenhammer qui les dfinit en
tant que protines ou complexes de protines ayant une activit bactricide contre les espces troitement
lies la souche productrice (Dortu et Thonart, 2009 ; Xie et al., 2011). Cependant, des tudes rcentes ont
dmontr quil existe certaines qui sont actives galement contre des bactries Gram ngatif (Mami et al.,
2008 ; Gong et al.,2010 ; Naghmouchi et al ., 2010). Ces substances protiques biologiquement actives
sontsynthtises au niveau du ribosome et codes par des gnes, leur scrtion dans le milieu extracellulaire
tant confre par un systme de transfert (Glvez et al., 2007; Riley et Chavan, 2007; Khalil et al., 2009 ;
Tabasco et al., 2009 ).
Les bactriocines se diffrent par leur poids molculaire, leurs proprits
biochimiques, leur origine gntique, ainsi que par leur spectre et mode daction (BenOmar et al ., 2006 ;
Dortu et Thonart, 2009 ; Ruiz-Barba et al ., 2010).

3-2 Nomenclature :
La nomination des bactriocines est attache soit au genre ou lespce de la premire souche productrice
en ajoutant le suffixe cine pour indiquer le pouvoir ltale ; par exemple: la plantaricine est la bactriocine
produite par Lactobacillus plantarum(Karthikeyan et Santhosh, 2009).
Chez les bactries Gram positif, une souche peut produire plusieurs bactriocines. En effet les
bactriocines qui prsentent une lgre modification dans les squences dacides aminsconserves par
rapport leur prpeptide naffectant pas leur structure secondaire ni leur spectre daction ni limmunit de la
souche productrice sont considres comme tant des variantes naturelles. A titre dexemple, les nisines Z,
Q et U sont des variantes naturelles de la nisine A dcouverte en premier lieu (Riley et Chavan, 2007).

3-3 Nature :
les bactriocines des bactries lactiques sont des protines ou des complexes de protines constitues
gnralement de 30 60 acides amins. Ces substances peuvent tre des protines simples comme elles

23
peuvent tre associes une partie lipidique ou glucidique. Certaines dentre elles renferment des acides
amins inhabituels tels la lanthionine et la - mthylelanthionine (Kotelnikova et Gelfand, 2002 ; Ammor et
al., 2006).

3-4 Caractristiques :
les bactriocines des bactries lactiques ressemblent certains peptides antimicrobiens des eucaryotes
(Riley, 2009). Celles-ci sont gnralement petites, cationiques (excs en rsidus lysyl et arginyl),
amphiphiles et thermostables. Leur poids molculaire est relativement petit (2-6 kDa) ce qui leur permet
daccder aux cellules cibles et permabiliser la membrane en se liant des rcepteurs de surface (Moll et
al., 1999; Gillor et al ., 2008; Anthony et al ., 2009; Simova et al ., 2009 ; Hartmann et al., 2011 ; Todorov
et al ., 2011). Cessubstances antagonistes, produites par la plupart des bactries lactiques, se diffrent
desantibiotiques du fait quelles sont synthtises au niveau du ribosome et leur spectre daction est
relativement troit, alors que les antibiotiques sont gnralement des mtabolitessecondaires et possdent un
spectre daction plus large (Ghrairi et al., 2008).

3-5 Proprits :
certains critres des bactriocines produites par les bactries lactiques justifient leur choix comme
bioconservateurs (Glvez et al., 2007 ; Thakur et Roy, 2009) :
- Considres comme GRAS (GenerallyRecognized As Safe) ;
- inactives et non toxiques contre les cellules eucaryotes ;
- gnralement thermostables et tolrantes aux variations du pH ;
- possdent un spectre dactivit relativement large ;
- mode daction gnralement bactricide (membrane cytoplasmique) ;
- dterminants gntiques cods par les plasmides ;
- sensibilit aux protases et digestibilit dans le tractus intestinal.

3-6 Classification
La classification rcente des bactriocines (cite dans le tableau 1) est celle de Cotter et al. (2005) qui est
une modification de la classification originale propose par Klaenhammer(1993). Selon cette classification,
les bactriocines des bactries lactiques sont divises en deux classes majeures en fonction de la prsence ou
non dacides amins soufrs inhabituels (lanthionine, -mthyl lanthionine, dhydroalanine et
dhydrobutyrine) forms par modifications post-traductionnelles. Les bactriocines qui les renferment
appartiennent la classe des lantibiotiques. Ces derniers sont des peptides thermostables de taille infrieure
5kDa subdiviss en deux types : ceux un seul peptide comme la nisine, et ceux qui exigent deux peptides
pour avoir une activit comme la lacticine 3147.

24
La deuxime classe renferme des peptides thermostables de taille infrieure 10kDa contenant un
(pdiocine PA1) ou deux peptides (lactacine F). Certains ont une structure cyclique (entrocine AS 48),
quatre sous-classes sont cites : a, b, c et d (Dortu et Thonart, 2009).
Daprs Cotter et al. (2005), les bactriolysines ne font pas partie des bactriocines.

3-7 Mode daction


Bien que toutes les bactriocines partagent le mme site daction qui est la membrane cytoplasmique, leur
mode daction semble tre diffrent (Dortu et Thonart, 2009):

Les lantibiotiques tel que la nisine, portant une structure cationique et amphiphile allonge, interagissent
avec la membrane des cellules cibles soit en se liant au lipide II (un prcurseur de peptidoglycanes)
empchant ainsi la synthse de la paroi cellulaire conduisant la mort de la cellule, soit en utilisant ce lipide
comme une molcule dappui pour sinsrer dans la membrane et y former des pores causant la dstruction
de la cellule suite la dissipation du potentiel membranaire et lefflux des petites molcules (ions, ATP,
acides amins, etc). La mersacidine tue la cellule en interfrant avec ses ractions enzymatiques comme la
synthse de la paroi (Gillor et al., 2008 ; Dortu et Thonart, 2009).

Linsertion des bactriocines de la classe II dans la membrane est confre par la structure -hlice
amphiphile, cette insertion induit la permabilisation de la membrane et par consquent la mort cellulaire
suite lcoulement des molcules faible poids molculaire.

Les bactriolysines par ailleurs ont un mode daction compltement diffrent bas sur lhydrolyse des
liaisons peptidiques des peptidoglycanes (Cotter et al., 2005).

25
Tableau 1: Classification des bactriocines des bactries lactiques (Cotter et al.,2005).

3-8 Conditions de production


Dans leur lutte pour survivre et se nourrir, les bactries lactiques produisent de nombreuses substances
antimicrobiennes entre-autres les bactriocines, qui servent darmes permettant aux bactries lactiques de
dominer les microorganismes comptitifs. Ces bactriocines peuvent tre dgrades sous laction des
protases de la souche productrice ou tre adsorbes sa surface (Moll et al., 1999 ; Dortu et Thonart,
2009).

Les conditions optimales pour la croissance peuvent ltre galement pour la production des
bactriocines.Yang et Ray (1994) et Castro et al . (2011) ont dmontr que les conditions conduisant une
forte densit cellulaire favorisent la production de bactriocine par Lactobacillus sakei. Cependant, il a t
not par Verluyten et al. (2004) que des conditions dfavorables la croissance permettent de stimuler la
production des bactriocines par Lactobacillus curvatus.
La prsence des microorganismes comptitifs dans le milieu stimule la production des bactriocines.
Tabasco et al. (2009) ont dmontr que Lactobacillus acidophilusLa-5 augmente la production de lactacine
B quand cette souche sent la prsence de cellules cibles vivantes ; lutilisation de ces mmes cellules cibles
aprs chauffage navait aucun impact sur cette production. De mme une co-culture de Lactobacillus
26
plantarumNC8 avec Enterococcusfaeciuma augment sa production de bactriocine (Ruiz-Barba et al.,
2010).

3-9 Facteurs influenant la production des bactriocines


Lutilisation des bactriocines lchelle industrielle en ncessite de grandes quantits. Ceci ne peut tre
atteint quen connaissant et optimisant les facteurs influenant leur production tels que : la temprature, le
pH, le milieu utilis, etc. Ces conditions de culture affectent fortement la production de bactriocines.

3-9-1 Temprature et pH
La temprature et le pH sont des facteurs importants quon doit prendre en considration quand la
production de bactriocines. Celle-ci est gnralement optimale des tempratures et des pH infrieurs
ceux optimaux pour la croissance (Hquet et al., 2007 ; Dortu et Thonart, 2009 ; Sharma et al., 2010).

Leffet de ces deux facteurs a fait lobjet de plusieurs tudes. Ainsi, la production de bactriocine par
Leuconostoclactistait optimale 30C et pH variant de 6.5 7 ; nanmoins, elle est diminue dune faon
remarquable 37C et pH 5.5 et 8.0 (Dhakur et Roy, 2009). La production de pdiocine LB-B1 par
Lactobacillus plantarumLB-B1 tait optimale 37C et pH : 6 (Xie et al. 2011).

EnterococcusfaeciumPC4.1 atteint son maximum de production 30C et pH : 6 (Hadji- Sfaxi et al. 2011).
La production de lacidocine 8912 par Lactobacillus acidophilustait maximise 30C (Ahmed et al.
2010).
3-9-2 Composition du milieu de culture
La composition du milieu de culture en particulier la source et la teneur de carbone etdazote influence
considrablement la production de bactriocines. Vu leurs exigencesnutritionnelles, les bactries lactiques
requirent plusieurs composants tels que : les facteurs de croissance, les peptones, lextrait de levure, les
hydrolysats de protines et lextrait de viande. Ces composants ont un impact positif sur le rendement en
bactriocines (Dortu et Thonart, 2009).

De nombreux milieux de culture complexes ont t utiliss pour lisolement des


bactries lactiques bactriocinognes tels le MRS (Elmoualdi et al., 2008 ; Khalil et al., 2009 ; Moraes et al.,
2010 ; Xie et al., 2011; Abrams et al., 2011 et Castro et al., 2011), le BHI (Ammor et al., 2006 ; Ghrairi et
al., 2008), et le M17 (Hadji-Sfaxi et al., 2011). Toutefois, lElliker constitue le milieu le plus appropri pour
amliorer le rendement des bactriocines (Thakur et al ., 2009).
Il a t signal que la production des bactriocines peut tre maximise en fortifiant le milieu de culture par
lajout dextrait de levure (Benkerroum et al., 2000 ; Labioui et al., 2005 ; Elmoualdi et al., 2008 ; Sarika et
al., 2010).
27
Todorv et Dicks (2005) ont dmontr que le taux de bactriocines ST461BZ et
ST462BZ produites par Lactobacillus rhamnosusa significativement augment en ajoutant au milieu le
K2HPO4 et le KH2PO4 respectivement.

3-9-3 Temps dincubation


La synthse des bactriocines prend lieu au cours de la phase exponentielle et au dbut de la phase
stationnaire. Au del de cette priode une diminution du taux de bactriocines a t observe suite la
digestion de ces dernires par les enzymes protolytiques libres par la cellule productrice. De ce fait,
plusieurs tudes ont t ralises pour optimiser la priode dincubation; Gong et al. (2010) ont dmontr
que la production de la plantaricine MG par Lactobacillus plantarumatteint sa valeur maximale aprs 28H
dincubation. La production maximale de bacALP7 par P. pentosaceusest observe aprs 16H dincubation
et diminue de prs de la moiti aprs 21H (Pinto et al., 2009).

3-10 Les applications des bactriocines


Considres en tant que GRAS (GenerallyRecognized As Safe) et vu leur
abondance et leur pouvoir antimicrobien gnralement bactricide, les bactriocines des bactries lactiques
trouvent leur utilisation dans diffrents domaines o elles empchent le dveloppement de bactries
pathognes et nuisibles (Albano et al.,2007)

3-10-1Dans le secteur alimentaire


Lutilisation des bactriocines dans les produits alimentaires a connu une forte
progression. Du fait que ces substances sont naturelles, sres (non toxiques pour les cellules eucaryotes et
facilement digestibles dans le tractus intestinal), tolrantes aux traitements thermiques et aux variations du
pH et agissant des faibles concentrations, leur application conduit une prolongation de la dure de
conservation des produits alimentaires (Gautam et Sharma, 2009).

Ces molcules bioactives sont incorpores dans les aliments soit directement sous forme purifie ou semi-
purifie (nisine) ou sous forme de concentr (pdiocine) soit indirectement en appliquant la souche
productrice dans le produit alimentaire (production insitu), comme elles peuvent tre immobilises par
encapsulation ou adsorption. A lheure actuelle, seule la nisine est accepte comme additif (Ghalfi et al.,
2006 ; Dortu et Thonart, 2009).

Benkerroum et al. (2000) ont dmontr la capacit des bactriocines produites par Lactococcuslactisde
diminuer le nombre de Listeria monocytogenesajoute exprimentalement au Jben Marocain. Aprs
contamination du Jben avec 107et 104 UFC.ml-1, il a t constat que la bactriocine entraine une rduction

28
du nombre de contaminants de 2.7 log aprs 30H dans le premier cas et la compltement limin aprs 24H
dans le deuxime.

La nisine produite par Lactococcuslactisest utilise dans la production des fromages pour prvenir la
fermentation de lacide lactique en acide butyrique par le genre Clostridium,ce qui affecte la saveur et la
texture des produits. La nisine est aussi capable dinhiber les genres : Bacillus, Staphylococcus, Listeria et
Clostridium en particulier Clostridiumtyrobutyricumresponsable de la production de gaz dans les fromages
semi solides (Walstraetal., 2006). Cette bactriocine est utilise galement dans la fabrication des : fromages
pasteuriss, produits liquides base doeuf, sauces, laits frais, bires et conserves (Glazer et Nikaido, 2007).

Etant un milieu riche, la viande est sujette des contaminations par les
microorganismes pathognes et altrants tels que Listeria monocytogenes, Brochothrixthermosphactaet
Clostridium estertheticum(Jones et al., 2008). Hquet et al. (2007) ontdmontr que la sakacine G produite
par Lactobacillus sakeia diminu le nombre de Listeria innocuade 3 log moins de 1 log dans les jambons
cuits conservs 4C. Ben Hammou etal . (2010) ont russi appliquer la nisine en combinaison avec le
NaCl pour contrler ledveloppement de Listeria monocytogenesdans les saucisses du mouton.
Albano et al. (2009) ont utilis Pediococcusacidilacticiproductrice de la bactriocine PA-1 pour inhiber un
cocktail de souches de Listeria innocuadans les saucisses base de viande fermente, ceci ayant permis une
rduction remarquable de ces souches.
Pinto et al. (2009) ont mis en vidence la capacit des bactriocines bacALP7 et
bacALP57 produites par Enterococcusfaeciumet Pediococcuspentosaceusde rduire le taux de Listeria
monocytogeneset Listeria innocuadans les fruits de mer.

3-10-2Dans le secteur sanitaire


Lusage des bactriocines nest pas restreint au domaine alimentaire. Celles-ci
servent aussi comme agents de thrapie naturelle alternatifs aux antibiotiques (Smaoui, 2010). Suite
lmergence du phnomne dantibiorsistance manifest par plusieurs bactries pathognes (parmi
lesquelles certaines sont rsistantes plusieurs antibiotiques la fois) qui menace la sant publique, les
tudes sont actuellement orientes vers la recherche de nouvelles substances antibiotiques naturelles pouvant
rsoudre ce problme (Mkrtchyanet al., 2010).

Les bactriocines de la classe IIa prsentent un groupe important de peptides


antimicrobiens qui peuvent tre utiliss en mdecine avec les antibiotiques dans le traitement des maladies
infectieuses ou comme des agents antiviraux. Ces molcules ont une activit inhibitrice contre les bactries
Gram positif nuisibles et pathognes comme Bacillus cereus,Clostridium perfringens, Staphylococcus
aureus et Listeria monocytogenes(Drider et al .,2006).
29
Xie et al. (2011) ont rapport que le Koumiss (produit chinois base de lait ferment) est efficace dans le
traitement de la tuberculose et des maladies cardiovasculaires et contribue lamlioration de limmunit, et
que ces proprits sont attribues aux bactriocines produites par les bactries lactiques indignes. Dembl
et al. (1998) ont dmontr que lesbactriocines produites par le genre Lactobacillus contribuent la
protection du vagin contrediffrentes bactries pathognes telles : Escherichia coli, Serratiamarcescens,
Shigellaboydii, Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Listeria innocuaet Staphylococcus aureus.

Tong et al. (2010) ont dmontr que la nisine participe dans la prvention et le
traitement des caries dentaires en inhibant les microorganismes en cause. La nisine est aussi utilise dans le
traitement des ulcres gastriques vu sa stabilit aux pH acides et son activit contre Helicobacter pylori. Les
bactriocines LA-1, YIT9029 et DCE471 produites par Lb. johnsonii, Lb. caseiet Lb.
amylovorusrespectivement manifestent galement une activit inhibitrice contre Helicobacter
pylori(Smaoui, 2010). Des tudes rcentes ont dcouvert le rle des bactriocines produites par
Lactobacillus salivariusdans la rduction de colonisation du caecal des volailles par Campylobacter(Nazef
et al.,2008).

30
CHAPITRE 4:
Mise en vidence et purification des bactriocines

CHAPITRE 4 : Mise en vidence et purification des bactriocines

4-1. Mise en vidence de lactivit bactriocinogne


Les mthodes de dtection des souches lactiques productrices de bactriocines sont bases sur la diffusion
de ces substances protiques dans un milieu de culture solide ou semisolidepralablement inocul par une
souche indicatrice (Elmoualdi et al., 2008). Certaines bactriocines, comme la streptocine STH1, sont
produites uniquement en milieu liquide (Rileyet Chavan, 2007).

31
a- Test des spots (spot on the lawn)
Cest une mthode permettant la recherche dantagonisme de plusieurs souches la fois, cet antagonisme
peut tre soit direct (simultan) ou indirect (diffr).
- Antagonisme direct : il consiste raliser sur une glose un tapis de la souche indicatrice, une culture
frache de la souche test est ensuite ensemence sur ce tapis sous forme de spots.Aprs incubation, les boites
sont examines pour les zones dinhibition. La densit du tapis cellulaire est un facteur dterminant dans
cette mthode (Tagg et al., 1976 ; Riley et Chavan, 2007).

- Antagonisme diffr : dans cette mthode, une prculture de la souche test est ensemencesur glose sous
forme de spots, une incubation est alors ralise permettant le dveloppement des colonies. Une glose
molle (0.75% dagar) inocule par un certain volume de la souche indicatrice est ensuite verse au dessus.
Linhibition se traduit par lapparition des halos dinhibition (2mm) autour des souches productrices
(Mami et al., 2008).
La bactrie test peut tre tue par chauffage ou par chloroforme avant de verser la glose molle. Cependant,
le chloroforme peut inactiver les substances inhibitrices. Pour viter ce problme, une modification de cette
mthode consiste ensemencer la souche indicatrice sur la face oppose par rapport la souche test et
prsente galement lavantage dexclure leffet des bactriophages (Tagg et al., 1976).

b- Mthode des puits (Berecka et al., 2009).

c- Mthode des disques (Berecka et al., 2009).

d- Mthode de plaques de glose (Berecka et al., 2009).

e- Mthode des microplaques (Simova et al.,2009).

32
ETUDE EXPERIMENTALE

33
Matriel et mthodes

Matriel et mthodes

1 Matriel utilis

34
1-1 Milieux de culture
- MRS ; (De Man, Rogosa et Sharpe) bouillon et glose (Fluka)
- BHIB: bouillon cur cervelle
-chapman

1-2 Produits chimiques


- Ethanol 96% (Sigma-Aldrich)
- Eau oxygne (10v)
- Kit coloration Gram (Sigma)
- HCL 0.02M
- NaOH 4M
- Agar-agar (Fluka)

2 Les souches pathognes


Il sagit de Staphylococcus aureus STA 49444, Escherichia coli ATCC 25922,provenant du
laboratoire espagnol Laboratoire de Scurit Alimentaire par les Bactries Lactiques et les
Probiotiques (SEGABALP), Universit de Madrid, Espagne.

Tableau 02: Origine des diffrentes souches tudies.

Souches Origine

E.coli Laboratoire de Scurit Alimentaire par


ATCC 25922 les Bactries Lactiques et les
Probiotiques (SEGABALP), Universit
de Madrid, Espagne

Staphylococcus aureus Laboratoire de Scurit Alimentaire par


les Bactries Lactiques et les
Sta-49444
Probiotiques (SEGABALP), Universit
de Madrid, Espagne

3 Mthodologie
La slection des souches de bactries lactiques ayant une activit anti-bacterienne partir
des laits tests a t ralise par le procd dantagonisme diffr en utilisant la mthode des
spotsdite sur tapis cellulaire.
35
4 Prlvement et collection des chantillons :

Les souches lactiques utilise dans notre travaille ont t isoles partir dunchantillon de lait de chamelle
provient de la rgion de tibelbala, Tindouf (espce : camelusdromados ; age 6 ans de couleur marron).
Le prlvement seffectue en soutirant une quantit suffisante du liquide dans un flacon strile. Il faut
nettoyer la source de prise (le prlvement a t fait aseptiquement aprs que les mamelles ont t dsinfect
pas leau tide contenants de leau de javel 2%), en suite lchantillon est mis dans un flacon strile et
conserver 4C jusqu sont utilisation.

5 Isolement et purification des bactries lactiques

5-1 Isolement et identification des souches lactiques msophiles

Lisolement est ralis sur milieu MRS solide, milieu adapt la recherche spcifique des
souches lactiques. Les cultures sont incubes 24 72 heures 30C dans des botes de Ptri
lobscurit. La purification est effectue par quatre repiquages successifs dtalement en milieu
MRS solide. La conservation se fait sur milieu MRS inclin +4C en tubes essais lobscurit.
Lidentification est tablie en se basant sur des caractres morphologiques et divers caractres
biochimiques : catalase, temprature de croissance et production de gaz carbonique.

6 .Caractres biochimiques et physiologiques

Lactivit catalytique

permet la dgradation de leau oxygne en oxygne et eneau. Elle est mise en vidence en
mulsionnant la culture bactrienne tester dans unesolution frache deau oxygne 10
volumes. Un dgagement gazeux abondant sousforme de mousse, traduit la dcomposition de
leau oxygne sous laction de lenzyme tester.

7 Pouvoir antibactrien des souches

Les nombreuses mthodes dcrites pour la dtection de souches lactiques productrices de


bactriocines sont bases sur le principe que ces substances protiques peuvent diffuser dans un
milieu de culture solide ou semi solide quon inocule pralablement avec une souche cible (les
souches cible utilises dans notre protocole exprimentale sont Staphylococcus aureus, E.coli,).
36
La production de substances actives est dtecte par le pouvoir inhibiteur du micro-organisme
test sur la croissance du germe cible. Les souches de bactries lactiques aprs culture sur milieu
MRS 30C sont testes pour leur pouvoir antibactrien suivant la mthode de diffusion en milieu
glos (Tagget Mac Given, 1971).

8 technique utilise

La recherche de leffet des bactriocines produites par les bactries lactiques est ralise par la
mthode de la double couche.

Les souches Staphylococcus et E.coli sont ensemences sur milieu CHAPMAN et BHIB liquide est
incubes 18 heures 37C, tandis que les bactries lactiques sont ensemences en spot sur MRS
solide tamponn. Leffet des acides organiques, notamment des acides lactique et actique est
limin, en neutralisant le surnageant par une solution de NaOH 0,1N pH 6,5., elles sont
incubes 30C entre 24 h et 72 h.
Aprs incubation les E.coli et Staphylococcus sont inocules dans du BHIB et CHAPMAN semi
solide et les boites de MRS sont inondes par les souches tudier et laisser incubes 24 h
37C, on note lapparition dun halo autour des Puits, le pouvoir antagoniste est exprim par la
moyenne de deux diamtres perpendiculaires.

37
CHAPITRE 6
RESULTATS ET DISCUSSION

RESULTATS ET DISCUSSIONS

1. Caractristiques des isolats :


Sur milieu solide :
Des talements sur boites de Ptri du milieu MRS solide dans des conditions de culture en
anarobiose et lobscurit ont t choisis de manire slectionner les bactries lactiques. La
38
temprature d'incubation utilise est de 30C afin de favoriser la slection de bactries
msophiles 45 a fin de favorise la slection des bactries thermophiles. Les colonies
apparaissent aprs 72h de culture 30C sur MRS solide et aucun prolifration 45.
Ce sont des bactries msophiles, des colonies de petite taille environ 0, 1 1 mm de diamtre,
blanches, lisses, rondes et bombes.(kihal, 1996 ; carr et al, 2002) (figure 4).
La dtermination des caractres morphologiques et biochimiques des souches isoles nous a
permis didentifier 5 souches .Les souches isoles nommes Lc1, Lc2, Lc3, Lc4 et Lb5 montrent
lexamen microscopique quelles sont gram positif, catalase ngative et ne produisent pas de gaz
en milieu MRS liquide munie de cloche de durham.

Figure 02: Aspect macroscopique des colonies de Bactrie lactique sur milieu MRS

Sur milieu liquide :

Lacroissance des bactries apparait sous forme de trouble dans le milieu MRS liquide, cette
trouble est concentr au fon la recherche des conditions anarobiques de ces
bactries. (kihal, 1996 ; carr et al, 2002) (figure 4).

39
Figure 03: Aspect macroscopique des colonies de Bactrie lactique sur milieu MRSliqide

2 Caractre microscopique :

Aprs effectuer lexamen de la recherche de la catalase et la coloration de gram, toute les


bactries gram positif et catalase ngatif sont prsumes comme bactries lactique.
Lobservation microscopique nous a permis de voir des cellulesovode ou coccobacille ; dont le
mode dassociation est toujours en chaines incurves de nombre paires.(kihal, 1996 ; carr et
al, 2002)

40
Figure 04: Test la catalase

Souches Examen Macroscopique Examen Microscopique


Dimensions Forme Couleur Consistance Gram Forme

Lc1, Lc2, Lc3, Lc4 1,1< < 1 sphre blanchtre normale + Coque
Lb5 0,8< < 1 ronde Crme Pteuse + btonnet

Tableau 03: Observations culturales et morphologiques des bactries lactiques

Caractristiques des souches Cocci Lactobacille


Lc Lb

Gram
+ +

Catalase
- -

Dgagement de Gaz - -

Tableau 04: Les observations microscopiques et biochimiques prliminaires des souchesisoles

3Spectre dactivit

3.1Activit antagoniste de souches vis--vis dEscherichia coli ATCC 25922 :


Les diffrentes souches slectionnes Lc1, Lc2, Lc3, Lc4 et Lb5 isoles 30 C prsentent un
spectre dactivit trs proche vis--vis du germe cible test Escherichia coli ATCC 25922.Les
zones dinhibition sont claires avec des bordures bien distinctes, le diamtre dinhibition est
41
variable et varie de 6 mm 13 mm (Figure 05). Linhibition est note positive lorsquelle est
suprieure 8 mm (Schillingeret Lucke, 2001),

14 13
diametre d'inhibition (mm)

12 11

10 9
8
8
6
6

2
0
0
Lc1 Lc2 Lc3 Lc4 Lb5

souches lactiques

Figure 5: Diamtre dinhibition en mm des souches lactique en prsence dEscherichiacoli

Figure 6 : Activit antibactrienne des diffrents souches lactiques (Souche exprimentale)

42
3.2. Activit antagoniste de souches vis--vis de Staphylococcus aureus STA 49444:

Les diffrentes souches slectionnes Lc1, Lc2, Lc3, Lc4 et Lb5 isoles 30 C prsentent un
spectre dactivit trs proche vis--vis du germe cible test Staphylococcus aureus STA 49444.
Les zones dinhibition sont claires avec des bordures bien distinctes, le diamtre dinhibition est
variable et varie de 10 mm 12 mm (Figure 04). Linhibition est note positive lorsquelle est
suprieure 8 mm (Schillingeret Lucke, 2001),

12,5
d 12
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11,5
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(

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n
9
Lc1 Lc2 Lc3 Lc4 Lb5

souches lactiques

Figure 7: Diamtre dinhibition en mm des souches lactique en prsence de


Staphylococcus aureus STA 49444

Figure 8: Activit antibactrienne des diffrents souches lactiques (Souche exprimentale)


43
CONCLUSION

44
CONCLUSION

La bioprservation consiste inoculer un produit par des bactries slectionnes pour leur
aptitude inhiber le dveloppement de germes indsirables, sans modifier les qualits
organoleptiques et sanitaires de ce produit. Les bactries lactiques sont de bons candidats pour
cette technologie car elles produisent souvent une large gamme de composs inhibiteurs (acides
organiques, peroxyde d'hydrogne, diactyle, bactriocines, reutrine). Avec la mthode de (Tagg
et al., 1976 ); appliqu dans ce travail, nous avonsslectionn des souches de bactries lactiques
partir du lait de chamelle, en utilisant le milieu MRS.

Aprs effectuer les testes physiologiques et biochimiques nous avons pu isol 5 souches
msophiles (Lc1, Lc2, Lc3, Lc4, et Lb5) .les souches sont catalase ngatif et gram positif.
On a observ les zones dinhibition formes par nos souches lgard des bactries pathognes.
Contre Staphylococcus aureus STA 49444, les souches (Lc1, Lc2, Lc3, Lc4 et Lb5) montrent un
diamtre dinhibition variant de 10 et 12 mm.

Les mmesouches lactiques isoles prsentent aussi une activit bactricide contre
Escherichia coli ATCC 25922 avec une zone dinhibition variant de 6 et 13 mm .
Les rsultats prsents dans ce mmoire permettent au moins de fournir un ordre dide plus clair
sur le potentiel antimicrobien des souches slectionnes qui reprsentent une voie davenir pour
la production des substances antimicrobiennes utilises dans la bioconservation des aliments et la
fermentation.

Lanalyse des proprits biochimiques et physiologiquesde cette substance activit inhibitrice


est ncessaire et peut servir de base pour orienter les futurs travaux de recherches sur la
production de bactriocines diffrentes chelles destines des applications potentielles dans
les produits laitiers sous forme dadditif, soit dinoculum bactrien producteur de bactriocines au
cours du processus de fabrication et en tant que conservateur naturel pour inhiber la croissance
des microorganismes indsirables dans les aliments.

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