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1.1.1.2 Determinacin del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca
antes de ser pesado (105oC, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas de
peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso hmedo.
Comentarios: se suele usar en bacterias para las que otros mtodos ms fciles dan
errores debido a que forman grumos no dispersables, crecen en filamentos, etc. Se
emplean en determinaciones de crecimientos en ambientes naturales.
Recordemos aqu que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que
cualquier partcula pequea suspendida en agua. La dispersin de la luz es, dentro de
ciertos lmites, proporcional a la masa del cultivo.
D.O. = A = -logT/100
donde T= transmitancia
Por supuesto, hay que realizar una curva estndar para relacionar los
valores de A con la masa bacteriana.
La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la
plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el nmero de clulas en
varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se
anota el nmero n de clulas observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la
concentracin celular es fcil de establecer:
nAt/Ac 1/v
Son mtodos que miden el nmero de bacterias viables (que no equivale al de totales).
PX = mX e-m/x!
P0= e--m
m = -lnP0
1.2.2.2 Recuento de viables en placa: Como esta tcnica ser explicada al alumno
en clase, y adems la realizar en las prcticas, remitimos a las pertinentes
explicaciones "en vivo". Es una de las tcnicas de recuento ms usadas en la rutina
del laboratorio de Microbiologa.
Precauciones:
[(dM/M)/dt] = m
Si integramos, resulta:
M/M0 = em (t-t0)
En funcin del aumento del nmero de clulas. Supongamos que partimos de una
clula. Tras una divisin (generacin celular), tendremos 2, tras dos divisiones
tendremos 4, luego 8, etc:
Es n = (t-t0)/g
N/N0 = 2(t-t0)/g
Ahora bien, como estamos ante un crecimiento balanceado, las dos expresiones
matemticas {14.1} y {14.4} que hemos deducido (la de la seccin A, basada en masa,
y la de la seccin B, basada en nmero de individuos) son equivalentes:
En un medio donde exista algn nutriente limitante (o sea, cuya concentracin est
por debajo del lmite de eficiencia de las permeasas), el crecimiento balanceado es de
tipo restringido, de modo que el coeficiente real de crecimiento es inferior al mximo,
segn la frmula emprica siguiente:
m =m mx [S]/(KS + [S])
Como se puede ver, la tasa de crecimiento (medida por m ) es una funcin hiperblica
de la concentracin del sustratro (nutriente) limitante (ver grfico). Este sustrato puede
ser una fuente de C y/o de energa, fuente de N, de P, un factor de crecimiento, etc.
Ejemplos de KS:
3. CULTIVO CONTINUO
Es un cultivo balanceado mantenido por tiempo indefinido por un sistema de flujo que
se compone de:
3.1 Turbidostato
Inconvenientes:
3.2 Quimiostato
las bacterias tenderan a crecer a mayor velocidad que su dilucin debida a adicin de
medio fresco; por lo tanto, en un principio aumentara la concentracin de bacterias.
Pero este incremento no podra continuar indefinidamente. Pero el crecimiento
tampoco se detendra. De hecho, tras un cierto tiempo, el cultivo alcanzara un nuevo
estado estacionario de equilibrio, en el que la tasa de crecimiento se hace
proporcional a la tasa de adicin de medio fresco. En este caso, el cultivo
crece exponencialmente, pero a tasas m <m mx. Sigue creciendo exponencialmente
porque la tasa de dilucin del cultivo es una funcin exponencial del tiempo.
D = factor de dilucin
La frmula nos dice que sabiendo Y, K S y m mx se puede fijar la densidad celular (x)
simplemente ajustando dos parmetros del aparato:
S= KSD/(m mx- D)
Esta frmula nos dice que el efecto principal de cambiar el flujo (D) es alterar la
concentracin S de sustrato limitante en el cultivo, lo que a su vez afecta a la tasa
especfica de crecimiento (m ).
La densidad del cultivo es muy similar en un amplio margen de tasas de dilucin (D).
Este margen es el ms adecuado para hacer estudios en el quimiostato. En cambio, el
valor de tiempo de generacin (g) vara ampliamente. O sea, el quimiostato puede
obtener tasas de crecimiento muy diferentes, sin que se afecte la densidad celular.
seleccin de mutantes
estudios ecolgicos.
En los sistemas cerrados (que pueden ser lquidos o slidos), no existe aporte
continuo de nutrientes, ni drenaje de clulas ni de sustancias de desecho.
si las clulas estn daadas por algn agente, el lag tambin es largo,
ya que necesitan un tiempo para la reparacin de los daos.
Pero aun cuando la inoculacin se hace desde un cultivo previo en fase logartmica,
cuyo medio sea idntico al medio fresco, se observa siempre una fase lag. )Por qu?:
temperatura
pH
las clulas son ms pequeas, debido a que existe divisin celular despus de
que se haya detenido el incremento de masa;
el citoplasma se condensa;
Supongamos que inoculamos una bacteria en un medio lquido provisto de dos fuentes
de carbono (p. ej., glucosa y lactosa), de las cuales una (en este ejemplo, la glucosa)
es usada preferencialmente. Si representamos la cintica del crecimiento poblacional
segn hemos aprendido en el apartado anterior, obtenemos una curva como la de la
figura siguiente:
Obsrvese que se dan dos fases de crecimiento exponencial separadas por una
breve fase intermedia estacionaria. Esta modalidad de crecimiento con dos fases
exponenciales se conoce con el nombre de crecimiento diuxico.
La bacteria usa en primer lugar slo la fuente preferencial de C (en este caso, la
glucosa, que suele ser la fuente preferencial en muchos heterotrofos), sin "tocar" la
otra fuente. Una vez que agota la primera fuente, se dispone a usar la segunda (ej.:
lactosa), pero tarda un tiempo hasta que sintetiza los enzimas
catablicos necesarios para degradar esa segunda fuente. Cuando las bacterias han
logrado niveles de esos enzimas adecuados, se restablece el crecimiento exponencial,
aunque, como se puede constatar en el grfico, con una pendiente menor (lo que
significa que esta fuente alternativa permite una tasa m menor que la preferencial).
Pero esta explicacin an es "superficial": nos queda por estudiar su base gentica y
molecular, que postergaremos hasta el captulo primero de la seccin de Gentica
bacteriana.
La densidad de cada colonia es muy alta (del orden de 10 7 clulas para una colonia de
unos 5 mm). Esto se debe a que en el medio slido, a diferencia del lquido, las
bacterias no pueden dispersarse, y durante mucho tiempo este medio slido permite
un aporte continuo de nutrientes (por difusin desde el entorno de la colonia, hacia
ella), y eliminacin continua de productos de desecho (por difusin desde la colonia
hacia fuera). Por lo tanto, se parece a un cultivo continuo, excepto que no hay drenaje
de clulas.
tamao (relativo)
forma general
color
consistencia, etc.