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1.

DETERMINACIN DEL CRECIMIENTO DE POBLACIONES BACTERIANAS

El crecimiento de una poblacin o cultivo bacterianos se puede expresar en funcin


de:

aumento de masa del cultivo

aumento del nmero de clulas

Ambos tipos de expresiones son equivalentes entre s en cultivos que estn


en crecimiento balanceado (en el que todos los componentes aumentan una misma
proporcin por unidad de tiempo).

1.1 MEDIDA DE MASA BACTERIANA

1.1.1 Mtodos directos:

en estos mtodos se requieren preparaciones limpias, sin partculas extraas.

1.1.1.1 Determinacin del peso hmedo:

1. se tara un tubo de centrfuga;

2. se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante;

3. se determina el peso del sedimento.

Inconvenientes: grandes errores, debido al lquido intercelular retenido, cuya cuanta


depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del
empaquetamiento, etc.

1.1.1.2 Determinacin del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca
antes de ser pesado (105oC, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas de
peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso hmedo.

Inconvenientes: mtodo tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es


difcil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1
mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias.

1.1.1.3 Determinacin del nitrgeno total: tcnica de micro-Kjeldahl.

1.1.14 Determinacin de un componente caracterstico: peptidoglucano, ADN,


ARN, protenas, etc.

Comentarios: se suele usar en bacterias para las que otros mtodos ms fciles dan
errores debido a que forman grumos no dispersables, crecen en filamentos, etc. Se
emplean en determinaciones de crecimientos en ambientes naturales.

1.1.2 Mtodos indirectos


1.1.2.1 Medida de consumo de nutrientes o de produccin de algn metabolito
por unidad de tiempo. Ejemplos: consumo de oxgeno (QO2) y consumo de carbnico
(QCO2), determinados por el espirmetro de Warburg. Produccin de cidos.

1.1.2.2 Mtodos turbidimtricos (pticos). La base comn de estos mtodos


consiste en la medicin de la cantidad de luz dispersada o transmitida a travs de un
cultivo bacteriano.

Recordemos aqu que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que
cualquier partcula pequea suspendida en agua. La dispersin de la luz es, dentro de
ciertos lmites, proporcional a la masa del cultivo.

Medicin de luz transmitida:

A) Escala de MacFarland: Se trata de una serie de patrones de


turbidez previamente calibrados. Consiste en varios tubos de vidrio
hermticamente cerrados que contienen {1% de Cl 2Ba + cantidades
crecientes de SO4H2 al 1%}; por lo tanto, en cada tubo se origina un
precipitado de SO4Ba, origen de la turbidez. Para cada cepa bacteriana
hay que establecer la equivalencia entre la turbidez de cada tubo y la
masa o la concentracin de bacterias (en cls/ml) que genera una
turbidez similar. Se trata de una serie de patrones de turbidez
previamente calibrados. Consiste en varios tubos de vidrio
hermticamente cerrados que contienen {1% de Cl 2Ba + cantidades
crecientes de SO4H2 al 1%}; por lo tanto, en cada tubo se origina un
precipitado de SO4Ba, origen de la turbidez. Para cada cepa bacteriana
hay que establecer la equivalencia entre la turbidez de cada tubo y la
masa o la concentracin de bacterias (en cls/ml) que genera una
turbidez similar.

Inconveniente: es un mtodo poco preciso, que slo se


emplea cuando no hace falta exactitud. Ha sido
desplazado por los mtodos espectrofotomtricos.

B) Espectrofotmetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier


laboratorio de Microbiologa o Bioqumica. Mide la densidad ptica
(D.O.), es decir la absorbancia.

D.O. = A = -logT/100

donde T= transmitancia

Por supuesto, hay que realizar una curva estndar para relacionar los
valores de A con la masa bacteriana.

Comentarios: La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente


entre el tamao de la partcula y la longitud de onda incidente; la
sensibilidad de la tcnica aumenta pues a longitudes de onda (l ) cortas.
La proporcionalidad entre A y masa bacteriana slo es vlida para
>107cls/ml.

C) Nefelmetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo


sensor est situado en ngulo recto respecto de la direccin de la luz
incidente, y lo que se mide es pues, la luz dispersada directamente por
la preparacin. Posee mayor sensibilidad que el espectrofotmetro.

1.2 MEDIDA DEL NMERO DE INDIVIDUOS

1.2.1 Mtodos directos

1.2.1.1 Cmara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos


especial con una graduacin en superficie y unas medidas muy concretas:

excavacin con 0.02 mm de profundidad;

rea de 1 mm2, dividida en un retculo de 25 cuadrados grandes;

cada cuadrado grande est subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados


pequeos.

O sea, la muestra se distribuye en 16X25 = 400 celdillas (cuadros pequeos).

La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la
plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el nmero de clulas en
varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se
anota el nmero n de clulas observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la
concentracin celular es fcil de establecer:

n x 25 x 50 x 1000 = concentracin en clulas/ml.

Ventajas: es un mtodo muy rpido

Inconvenientes: slo sirve para suspensiones relativamente concentradas


(>10x106 cls./ml). Por debajo de este valor el nmero de clulas vistas en el campo
del microscopio es muy pequeo y poco significativo estadsticamente. En bacterias
mviles, hay que inmovilizarlas previamente, con una mezcla de alcohol y agua.

1.2.1.2 Recuento en preparaciones teidas: Se dispone de un porta con una


excavacin circular (de rea At) con un volumen conocido (v). Sobre esta excavacin
se extiende la muestra con asa de siembra o con micropipeta, y se fija y tie por algn
colorante. Se observa con un microscopio dotado de un juego de ocular y objetivo que
delimitan un rea de campo (Ac). Si en dicho campo se cuentan n bacterias, la
concentracin de bacterias por mililitro ser:

nAt/Ac 1/v

1.2.1.3 Recuento proporcional de Wright: Se mezcla la suspensin bacteriana


problema con una cantidad conocida de bolitas de ltex o de hemates. La
concentracin bacteriana se deduce de la proporcin de bacterias y partculas
observadas en el mismo campo microscpico. Este mtodo se emplea ms
frecuentemente en Virologa.

1.2.1.4 Contadores electrnicos de partculas (tipo Coulter): Se hace pasar una


suspensin bacteriana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente
elctrica. Cada vez que por un orificio (30 m m dimetro) pasa una partcula (p. ej.,
bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro
electrnico, que detecta el nmero y el tamao de las partculas que van pasando. (El
tamao detectado es funcin de la intensidad del pulso de voltaje al paso de la
partcula). Recientemente se ha introducido la citometra de flujo activada por
fluorescencia (FACS). Es una sofisticada modificacin en la que las partculas a contar
se marcan previamente con un anticuerpo monoclonal u otro ligando especfico hacia
alguna molcula de superficie, unidos a su vez a un fluorocromo, una molcula que
emite fluorescencia al incidir sobre ella un haz de luz lser.

1.2.2 Mtodos indirectos:

Son mtodos que miden el nmero de bacterias viables (que no equivale al de totales).

1.2.2.1 Mtodo del nmero ms probable: Su fundamento estriba en la distribucin


de Poisson: una distribucin aleatoria de partculas en una serie de muestras iguales,
en funcin del nmero medio de partculas presentes en una suspensin.

PX = mX e-m/x!

donde x = nmero real de partculas en cada muestra y m = concentracin


(no partculas/volumen)

La tcnica consiste en sembrar alcuotas de la suspensin original problema sobre un


medio lquido o slido adecuado; tras el tiempo de incubacin adecuado se anota la
proporcin obtenida de muestras donde no se haya dado crecimiento, P0 (x = 0).
Entonces, segn la distribucin de Poisson:

P0= e--m

y por lo tanto es fcil calcular el valor de m:

m = -lnP0

1.2.2.2 Recuento de viables en placa: Como esta tcnica ser explicada al alumno
en clase, y adems la realizar en las prcticas, remitimos a las pertinentes
explicaciones "en vivo". Es una de las tcnicas de recuento ms usadas en la rutina
del laboratorio de Microbiologa.

Precauciones:

para minimizar los errores estadsticos de muestreo, se recomienda sembrar 5


placas de cada dilucin;

hay que usar pipetas nuevas en cada dilucin;

contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias.

1.2.2.3 Determinacin de la proporcin clulas viables/clulas totales: Si se est


interesado en conocer esa proporcin se recurre a una tcnica de microcultivos en
cubreobjetos: hay que seguir peridicamente la evolucin del crecimiento de clulas
individuales y determinar la proporcin de aquellas clulas no viables (visibles al
microscopio, pero incapaces de crecer).
1.2.2.4 Recuento sobre filtros de nitrocelulosa: Se usa para suspensiones diluidas
de bacterias. Se hace pasar un gran volumen de suspensin a travs de una
membrana de nitrocelulosa estril, que retiene las bacterias. Posteriormente, el filtro se
deposita sobre la superficie de un medio de cultivo slido. Las colonias se forman
sobre el filtro y se cuentan, deducindose la concentracin original en funcin del
volumen de suspensin que se hizo pasar por el filtro.

2. CRECIMIENTO BALANCEADO (= EQUILIBRADO)

Una poblacin de bacterias que se encuentre en un medio adecuado en el que se


mantienen constantes todos sus parmetros nutricionales y ambientales, crece de
forma tal que el incremento por unidad de tiempo de masa celular, n o de clulas, ADN,
ARN, protenas, etc., es un valor constante y similar en cada caso:

D M/M = D N/N = D [ADN]/[ADN] = D [protenas]/[protenas] = ... = K

As pues, durante este crecimiento, de tipo exponencial o logartmico, el cultivo se


comporta como una reaccin autocataltica de primer orden:

velocidad de aumento del componente = K{cantidad del componente}

Tambin se puede decir que el no de clulas, la masa celular u otros componentes se


duplican en un mismo lapso de tiempo determinado.

Este tipo de crecimiento se denomina balanceado o equilibrado. Se caracteriza,


pues, por ser el crecimiento en el que

todos los constituyentes celulares se duplican en un mismo tiempo, o dicho de


otra manera:

aquel en el que estos constituyentes aumentan proporcionalmente por un


mismo factor en la unidad de tiempo. Este factor es el coeficiente
exponencial de crecimiento (m ), que es caracterstico para cada cepa
bacteriana en cada medio determinado.

2.1 Expresin matemtica del crecimiento balanceado:

Para deducirla vamos a aprovechar la definicin emprica anterior, atendiendo por un


lado al aumento de la masa celular, y por otro al incremento del nmero de individuos.

En funcin del aumento de masa celular:

Podemos decir que

[(dM/M)/dt] = m

por lo tantodM = Mmdt

Si integramos, resulta:

M/M0 = em (t-t0)

Aplicando logaritmos neperianos:


Tenemos que ln[M/M0] = m (t-t0) frmula{14.1}

De aqu se puede deducir que el coeficiente m es

m = lnM/M0 /(t-t0) frmula{14.2}

En funcin del aumento del nmero de clulas. Supongamos que partimos de una
clula. Tras una divisin (generacin celular), tendremos 2, tras dos divisiones
tendremos 4, luego 8, etc:

serie geomtrica. 1, 2, 22, 23, 24, ... 2n (donde n es es nmero de generaciones


transcurridas).

Si en vez de partir de una clula partimos de N 0 clulas iniciales, la expresin se


convierte en:

N = N02n ; por lo tanto:

N/N0 = 2n ; . frmula {14.3}

Por otro lado, el nmero de generaciones se puede calcular fcilmente teniendo en


cuenta el tiempo transcurrido y conociendo el tiempo medio de generacin (g):

Es n = (t-t0)/g

Sustituyendo esta expresin en la frmula {14.3} tenemos:

N/N0 = 2(t-t0)/g

Apliquemos logaritmos neperianos:

Obtenemos que lnN/N0 = [(t-t0)/g ] ln2 (frmula 14.4)

Ahora bien, como estamos ante un crecimiento balanceado, las dos expresiones
matemticas {14.1} y {14.4} que hemos deducido (la de la seccin A, basada en masa,
y la de la seccin B, basada en nmero de individuos) son equivalentes:

Por lo tanto, lnM/M0 = lnN/lnN0

m = lnM/M0 /(t-t0) = [(t-t0)/g ] ln2

m = ln2/g = 0.693/g (expresado en h--1)

Esta es la expresin matemtica del coeficiente del crecimiento balanceado, en


funcin del tiempo medio de generacin (g).

En un medio ideal, sin limitacin de nutrientes, este coeficiente es m = m mx, o sea, el


mximo valor posible del coeficiente para esa cepa en ese medio. Es decir, es un
crecimiento balanceado no restringido.

En un medio donde exista algn nutriente limitante (o sea, cuya concentracin est
por debajo del lmite de eficiencia de las permeasas), el crecimiento balanceado es de
tipo restringido, de modo que el coeficiente real de crecimiento es inferior al mximo,
segn la frmula emprica siguiente:

m =m mx [S]/(KS + [S])

donde [S] es la concentracin del nutriente limitante; K S es la constante de saturacin,


equivalente a la concentracin de nutriente para la que el coeficiente es semimximo.

Como se puede ver, la tasa de crecimiento (medida por m ) es una funcin hiperblica
de la concentracin del sustratro (nutriente) limitante (ver grfico). Este sustrato puede
ser una fuente de C y/o de energa, fuente de N, de P, un factor de crecimiento, etc.

Ejemplos de KS:

o la KS para la glucosa en E. coli es 110-6M

o la KS para el triptfano en esta bacteria es 210--7 M

Estos bajos valores se deben a la alta afinidad de las permeasas


membrana hacia los sustratos, lo cual es una adaptacin
evolutivamente adquirida de las bacterias a los medios muy
diluidos en nutrientes en los que normalmente viven. (Por el contrario,
los medios de laboratorio donde se suelen cultivar las bacterias suelen
ser ms concentrados).

Como veremos en el apartado 4, en la naturaleza, y en los sistemas de cultivo


cerrados que habitualmente se emplean en laboratorio, tarde o temprano el
crecimiento balanceado suele terminar, debido a que se agotan los nutrientes o se
acumulan sustancias de desecho.

3. CULTIVO CONTINUO

Es un cultivo balanceado mantenido por tiempo indefinido por un sistema de flujo que
se compone de:

una cmara de cultivo de volumen constante,

a la que llega un suministro de nutrientes,

y de la que se eliminan o separan los productos txicos de desecho (por un


dispositivo de rebosadero).

Una vez que el sistema alcanza el equilibrio, el nmero de clulas y la concentracin


de nutrientes en la cmara permanecen constantes, y entonces se dice que el sistema
est en estado estacionario, con las clulas creciendo exponencialmente.

Los parmetros a tener en cuenta son:

flujo (f), medido en ml/h

volumen de la cmara de cultivo (v, en ml)

densidad celular en la cmara (x)


factor de dilucin D = f/v (en h --1). El inverso de este factor de dilucin es el
tiempo medio de residencia (1/D= TMR)

Existe una prdida de clulas por el rebosadero: -dx/dt = xD

El crecimiento bruto es dx/dt = xm

Por lo tanto, el crecimiento neto es dx/dt = xm - xD = x(m - D)

Si logramos que el coeficiente de crecimiento (m ) se haga igual al factor de dilucin


(D), entonces dx/dt = 0, y por lo tanto la concentracin de clulas se hace constante
(x= x). El cultivo se encuentra entonces en estado dinmico de equilibrio. Las
prdidas de clulas por drenaje se compensan con las ganancias por crecimiento.

Existen dos tipos de procedimientos para obtener cultivos continuos:

de control interno: turbidostato;

de control externo: quimiostato.

3.1 Turbidostato

Permite cultivos continuos con un coeficiente m cercano al m mx, trabajando a valores


altos de D. Ello lo logra ajustando los valores de densidad celular de modo que ningn
factor nutricional se haga limitante.

Se dice que es un sistema de control interno porque es la misma concentracin de


bacterias la que regula el flujo de entrada y de salida (por medio de un mecanismo
electrnico basado en la medicin y control de la densidad ptica del cultivo).

Para el mecanismo de su funcionamiento, por favor atender la explicacin en clase y


consultar el esquema suministrado en la Fig.

Inconvenientes:

es difcil de manejar y ajustar;

si las bacterias tienen tendencia a adherirse a superficies (paredes internas del


aparato), los resultados de medida de la D.O. quedan falseados
(infravalorados).

Aplicaciones: se emplea bastante en el estudio de los factores que incrementan o


disminuyen la tasa de crecimiento.

3.2 Quimiostato

Para introducirnos al funcionamiento del quimiostato, partamos de la observacin de lo


que pasara en el turbidostato si desconectamos el fotmetro y ajustamos la bomba 1
para que vierta medio fresco al cultivo a una tasa (flujo) menor que el que mantiene
la m cercana a la m mx:

las bacterias tenderan a crecer a mayor velocidad que su dilucin debida a adicin de
medio fresco; por lo tanto, en un principio aumentara la concentracin de bacterias.
Pero este incremento no podra continuar indefinidamente. Pero el crecimiento
tampoco se detendra. De hecho, tras un cierto tiempo, el cultivo alcanzara un nuevo
estado estacionario de equilibrio, en el que la tasa de crecimiento se hace
proporcional a la tasa de adicin de medio fresco. En este caso, el cultivo
crece exponencialmente, pero a tasas m <m mx. Sigue creciendo exponencialmente
porque la tasa de dilucin del cultivo es una funcin exponencial del tiempo.

La m submxima viene determinada en el quimiostato por la tasa de dilucin (D). La


cintica sigue siendo exponencial, ya que en el nuevo estado estacionario de equilibrio
la tasa de crecimiento compensa a la tasa de dilucin, que como sabemos, es una
funcin exponencial.

Ventajas del quimiostato en comparacin con el turbidostato:

En un quimiostato, los microorganismos pueden cultivarse a una amplia variedad de


tasas de crecimiento exponencial, mientras que, como vimos, en el turbidostato se
cultivan en un rango estrecho de valores de m cercanos al m mx.

El quimiostato permite crecimientos balanceados restringidos debido a que existe un


nutriente o sustrato presente en una concentracin suficientemente baja como para
limitar la densidad de poblacin.

SR es la concentracin de nutriente en el reservorio, y determina el valor de S, que es


la concentracin de nutriente limitante en el recipiente de cultivo.

La tasa de adicin de ese sustrato determina la tasa de crecimiento.

As pues, el quimiostato tambin permite elegir la densidad de clulas a la que se


quiere trabajar.

Expresin matemtica del quimiostato:

x = concentracin celular en equilibrio

Y = constante de rendimiento en el medio empleado (masa de microorganismo


formada/masa de sustrato consumida)

SR= concentracin del sustrato limitante en el reservorio

D = factor de dilucin

KS= constante de saturacin respecto del sustrato limitante

La frmula nos dice que sabiendo Y, K S y m mx se puede fijar la densidad celular (x)
simplemente ajustando dos parmetros del aparato:

SR (concentracin del sustrato o nutriente limitante en el reservorio)

D (coeficiente de dilucin, regulable por el flujo)


Por otro lado, se puede demostrar tambin que la concentracin de sustrato limitante
en equilibrio en la cmara de cultivo es:

S= KSD/(m mx- D)

Esta frmula nos dice que el efecto principal de cambiar el flujo (D) es alterar la
concentracin S de sustrato limitante en el cultivo, lo que a su vez afecta a la tasa
especfica de crecimiento (m ).

Vase la grfica compleja en el esquema, bajo el dibujo del quimiostato. Algunos


comentarios (atindase la explicacin del profesor):

La densidad del cultivo es muy similar en un amplio margen de tasas de dilucin (D).
Este margen es el ms adecuado para hacer estudios en el quimiostato. En cambio, el
valor de tiempo de generacin (g) vara ampliamente. O sea, el quimiostato puede
obtener tasas de crecimiento muy diferentes, sin que se afecte la densidad celular.

En cambio, a altas tasas de dilucin la concentracin microbiana cambia rpidamente,


y en un margen estrecho el cultivo puede drenarse totalmente (DC: dilucin crtica).

A muy bajas diluciones (DM) el quimiostato no funciona si el nutriente limitante es la


fuente de energa. Ello se debe a que en esas condiciones, la fuente de energa slo
se usa para reacciones de mantenimiento de la integridad celular, pero no queda para
el crecimiento. A este valor lo llamamosenerga de mantenimiento. Los procesos
relacionados con esta energa de mantenimiento son el potencial de membrana, el
transporte de solutos y la renovacin de protenas.

Aplicaciones del cultivo continuo en quimiostato:

Aportan una fuente continua de clulas en fase exponencial, lo que se aplica


a procesos industriales de fermentacin (produccin de bebidas alcohlicas, de
antibiticos, de aminocidos, etc).

En el quimiostato, el crecimiento a bajas concentraciones de sustrato permite estudiar:

aspectos fisiolgicos (por ejemplo, catabolismo del sustrato limitante);

seleccin de mutantes

estudios ecolgicos.

4. CULTIVO EN SISTEMAS CERRADOS

En los sistemas cerrados (que pueden ser lquidos o slidos), no existe aporte
continuo de nutrientes, ni drenaje de clulas ni de sustancias de desecho.

En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento balanceado no restringido


dura slo unas cuantas generaciones, debido al agotamiento de nutrientes y/o a la
acumulacin de desechos.

NOTA:En la naturaleza no es normal ver crecimientos balanceados


indefinidos. Hgase el alumno una idea de lo que es el crecimiento
exponencial indefinido de una bacteria a travs de los siguientes datos:
si una sola bacteria (que pesa 10--12 gramos) pudiera crecer sin
restriccin, con un tiempo de generacin de 20 minutos, al cabo de 48
horas la poblacin derivada pesara nada menos que 2,2 10 31 gramos,
equivalente a 4000 veces el peso de nuestro planeta.

4.1 CURVA DE CRECIMIENTO EN UN SISTEMA CERRADO EN MEDIO LQUIDO

El crecimiento en un sistema cerrado consta de varias fases, que pasamos a


comentar:

Fase de retardo (fase "lag"): Es el perodo de tiempo durante el que el inculo se


adapta a las condiciones del medio fresco sobre el que se ha sembrado. Se trata
de un perodo de ajuste metablico. Su duracin depende de varios factores:

tamao del inculo;

bondad del inculo (estado metablico previo del inculo):

si el inculo procede de clulas en fase estacionaria de un cultivo


anterior, la fase lag es larga. Ello se debe a que los contenidos en
coenzimas y otros constituyentes de las clulas son bajos, y las clulas
deben reponerlos en el medio fresco.

si las clulas estn daadas por algn agente, el lag tambin es largo,
ya que necesitan un tiempo para la reparacin de los daos.

si las clulas del inculo se tomaron de un cultivo previo en fase


logartmica, el lag es ms corto.

medio del que procede el inculo:

si el medio es similar al medio fresco, el lag es ms corto;

si el medio del inculo era un medio rico y el medio fresco es ms


pobre, la fase de retardo se hace ms larga, porque las bacterias
necesitan un tiempo adicional para activar la sntesis de las enzimas
biosintticas que estaban reprimidas en el medio rico.

Pero aun cuando la inoculacin se hace desde un cultivo previo en fase logartmica,
cuyo medio sea idntico al medio fresco, se observa siempre una fase lag. )Por qu?:

necesidad de neutralizar sustancias txicas en el medio fresco;

porque se produce dilucin de ciertos metabolitos intracelulares al inocular las


bacterias en el medio nuevo; por lo tanto, hasta que no se vuelva a alcanzar
una concentracin de esos metabolitos adecuada para el crecimiento, ste no
"arranca".

Ejemplo: Supongamos que inoculamos una bacteria heterotrfica en un


medio ligeramente cido, sometido a aireacin: en un principio, se
produce dilucin de CO2, por lo que se retardan reacciones de
carboxilacin que requieren este CO2, y se produce un retardo.
Fase de transicin, de crecimiento acelerado, que conduce a ...

Fase de crecimiento exponencial (= fase logartmica). La fase 2 se debe a que


cada clula entra en la fase exponencial con desfase respecto de sus compaeras.
Ello demuestra que las clulas del inculo no estn todas en las mismas condiciones
fisiolgicas.

Durante la fase logartmica se da un crecimiento balanceado no restringido


durante unas pocas generaciones (normalmente menos de 10). El tiempo de
generacin (g) es caracterstico para cada especie o cepa, en cada medio concreto:

El valor del tiempo de generacin (g) depende de:

composicin del medio

temperatura

pH

osmolaridad (tonicidad), etc.

Los microorganismos heterotrofos suelen crecer ms rpidamente en los medios


complejos, ricos, que en los medios sintticos, y dentro de estos ltimos, mejor con
glucosa que con otras fuentes de carbono.

Fase de aceleracin negativa, de crecimiento desequilibrado, que conduce a...

Fase estacionaria: Esta fase se caracteriza porque el coeficiente neto de


crecimiento se hace nulo(m = 0), pero an existe crecimiento. Lo que ocurre es
que el crecimiento bruto se equilibra con las muertes celulares.

En este perodo se agotan nutrientes especiales y se acumulan sustancias de


desecho. Incluso el pH del medio empieza a hacerse inadecuado para el crecimiento
celular.

Si la bacteria crece en un medio complejo, la fase 4 de transicin (de aceleracin


negativa) puede ser relativamente larga, debido a que va recurriendo a fuentes
alternativas (p. ej., puede recurrir a aminocidos como fuente de C una vez agotados
los hidratos de carbono).

En la fase estacionaria an existen reacciones metablicas, pero el metabolismo


general es diferente al de la fase logartmica:

las clulas son ms pequeas, debido a que existe divisin celular despus de
que se haya detenido el incremento de masa;

el citoplasma se condensa;

en las bacterias Gram-negativas aumenta el volumen relativo del periplasma;

el nucleoide se condensa, por sustitucin de ciertas protenas que se unen a


ADN;
la membrana citoplsmica se hace menos fluida;

suelen ser ms resistentes a agentes fsicos (temperatura, estrs osmtico) y


qumicos;

existe un cambio en el patrn de expresin gentica: se desconectan cientos


de genes que haban estado expresndose durante la fase exponencial,
mientras que se activan unos 50-100 genes que antes estaban reprimidos
(genes de fase estacionaria); estos genes se transcriben mediante la
holoenzima de la ARN-polimerasa dotada de la subunidad s38 (=sS).

existe reciclado de ciertos materiales intracelulares;

baja el contenido en ARN.

Fase de transicin hacia ...

Fase de muerte exponencial: Se da muerte y lisis masiva, exponencial, del cultivo.


Se debe aagotamiento de reservas de energa. Algunas veces las clulas aparecen
grandes, hinchadas, distorsionadas (formas "fantasmas", "ghost"). La pendiente de
esta parte de la curva depende de las especies (por ejemplo, en bacterias entricas es
suave, mientras que en Bacillus es ms acentuada).

4.2 CRECIMIENTO DIUXICO

Supongamos que inoculamos una bacteria en un medio lquido provisto de dos fuentes
de carbono (p. ej., glucosa y lactosa), de las cuales una (en este ejemplo, la glucosa)
es usada preferencialmente. Si representamos la cintica del crecimiento poblacional
segn hemos aprendido en el apartado anterior, obtenemos una curva como la de la
figura siguiente:

Obsrvese que se dan dos fases de crecimiento exponencial separadas por una
breve fase intermedia estacionaria. Esta modalidad de crecimiento con dos fases
exponenciales se conoce con el nombre de crecimiento diuxico.

Bases del crecimiento diuxico:

La bacteria usa en primer lugar slo la fuente preferencial de C (en este caso, la
glucosa, que suele ser la fuente preferencial en muchos heterotrofos), sin "tocar" la
otra fuente. Una vez que agota la primera fuente, se dispone a usar la segunda (ej.:
lactosa), pero tarda un tiempo hasta que sintetiza los enzimas
catablicos necesarios para degradar esa segunda fuente. Cuando las bacterias han
logrado niveles de esos enzimas adecuados, se restablece el crecimiento exponencial,
aunque, como se puede constatar en el grfico, con una pendiente menor (lo que
significa que esta fuente alternativa permite una tasa m menor que la preferencial).

Pero esta explicacin an es "superficial": nos queda por estudiar su base gentica y
molecular, que postergaremos hasta el captulo primero de la seccin de Gentica
bacteriana.

4.3 CRECIMIENTO EN SISTEMAS CERRADOS EN MEDIOS SLIDOS


Un medio slido es una solucin nutritiva (como el lquido), pero incorporado a un
gel, que le da consistencia.

Los tipos de gelificantes usados para los medios slidos:

agar-agar (o simplemente, agar): es el ms comnmente empleado;

gelatina (inconveniente de que se lica a temperaturas relativamente bajas);

silicagel (o gel de slice): tedioso de preparar. Uso casi exclusivo para


quimioautotrofos.

Los medios slidos se suelen inocular mediante asa de siembra o esptula,


diseminando las bacterias sobre su superficie libre, en recipientes adecuados, como
las placas de Petri (ver prcticas). Tras la incubacin a la temperatura y condiciones
pertinentes, cada bacteria o agrupacin bacteriana que ha quedado en un punto
determinado del medio da origen, por crecimiento, a una acumulacin de clulas,
visible a simple vista, denominada colonia.

La densidad de cada colonia es muy alta (del orden de 10 7 clulas para una colonia de
unos 5 mm). Esto se debe a que en el medio slido, a diferencia del lquido, las
bacterias no pueden dispersarse, y durante mucho tiempo este medio slido permite
un aporte continuo de nutrientes (por difusin desde el entorno de la colonia, hacia
ella), y eliminacin continua de productos de desecho (por difusin desde la colonia
hacia fuera). Por lo tanto, se parece a un cultivo continuo, excepto que no hay drenaje
de clulas.

Como el alumno comprobar en prcticas, cada especie bacteriana suele originar


colonias de un tipo determinado, en cada medio concreto. Con vistas a la
determinacin taxonmica, se suele tomar nota de una serie de caractersticas de las
colonias (caracteres culturales):

tamao (relativo)

forma general

forma de los bordes de la colonia

aspecto de la superficie y elevacin sobre el sustrato

color

consistencia, etc.

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