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Bacterias lcticas
Microflora natural de la leche
Se emplea para la fabricacin de alimentos, productos lcteos, productos
crnicos, productos de panificacin, bebidas (vino, sidra) y en
conservacin de alimentos
Gneros caracterizados por su capacidad de fermentar glcidos
produciendo cido lctico
Fermentacin
Homolctica -----> cido lctico nico producto formado.
Heterolctica -----> se produce: c. lctico, c. actico, etanol, CO2, etc.
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Gnero Streptococos
Especies patgenas para el hombre (Sc. Pyogenes)
Saprofitos de la cavidad bucal (Sc. mutans, Sc. salivarius) o del intestino
(Sc. faecalis).
Tres especies:
Leuconostoc mesenteroides (subsp. mesenteroides, subsp.
dextranicum y subsp. cremoris)
Leuconostoc lactis
Leuconostoc paramesenteroides
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Gnero Lactobacillus
Bastoncitos agrupados en cadenas, gran exigencia de factores de
crecimiento, ejm:
Lactobacillus delbrueckii: requiere 11-15 AAaas, acidificacin lenta,
resistente a pHs cidos (hasta pH: 3.5), produccin de cido lctico de
27g/L.
Subdivisin del gnero Lactobacillus
Grupo I: Lactobacilos homofermentativos obligatorios, no
fermentan pentosas y el gluconato, clulas largas, rectas y
empalizadas: 2 conjuntos de especies Lactobacillus delbrueckii
(sus subespecies producen hasta 18g/L cido D(-) lctico),
Lactobacillus acidophilus (3 subgrupos: Lactobacillus acidophilus
(la cepa tipo), Lb. gasseri y Lb. helveticus).
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Especie Hbitat
Lb.helveticus queso
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Especie Hbitat
Lb.bavaricus vegetales
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Especie Hbitat
Lb.bifermentans queso
Lb.confusus vegetales
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Gnero Pediococcus
Clulas agrupadas en pares o tetradas
Fermentan azcares y producen cido lctico D(L)
L(+).
Muchas especies son incapaces de utilizar la lactosa,
dbil actividad proteoltica, exigentes nutricionalmente
son factores que no les permite acidificar y coagular la
leche.
Las especies se diferencian por su tolerancia a la
temperatura, al pH, y al NaCl.
Especies: Pediococcus damnosus, Pediococcus
parvulus, Pediococcus inopinatus, Pediococcus
dextrinicus, Pc.pentosaceus, Pc.acidolactici,
Pc.halophilus, Pc.urinaequi
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Gnero Bifidobacterium
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Fisiologa del crecimiento: metablismo y regulacin
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1.2 Utilizacin de aminocidos libres
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1.3 Utilizacin de pptidos
La concentracin de AAaas libres no asegura el
crecimiento de las bacterias ------> utilizacin de
pptidos es necesario.
Pptidos sirven de fuente de AAaas como metionina.
Presencia de permeasas para pptidos (di y tripptidos)
facilitan su fermentacin dentro de la clula. Permeasas
son energa(ATP) dependientes acoplado a la fuerza
motriz protnica, la energa es aportada por la lactosa y
la toma de pptidos est regulada por el gradiente de
pH en ambos lados de la membrana.
Crecimiento sobre pptidos varia segn cepa y esta en
funcin de la eficacia de los sistemas de permeacin de
estos pptidos.
Disposicin de las clulas de peptidasas externas para el
rompimiento de grandes molculas.
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1.4 Utilizacin de las protenas y de los polipptidos de la leche:
sistema proteoltico
Oligopptidos Permeasa
Peptidasa
Peptidos Proteasas
Dipptidos Permeasa
Peptidasas
Dipeptidasa
Protenas
AAaas Permeasa AAaas intracelulares
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1.5 Regulacin de la actividad proteoltica
Composicin del medio de crecimiento y condiciones
de cultivo puede modificar la actividad proteoltica total
o activar/inhibir una actividad protesica o peptidsica
especfica.
1
Arginina Citrulina Ornitina
NH3
2
Carbamil-fosfato
1: arginina disiminasa
2: ornitina carbamoil transferasa ADP
3: carbamato quinasa 3
ATP
CO2 + NH3
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2. El metabolismo de los azcares: fermentacin lctica
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Va homofermentativa Va heterofermentativa
Lactosa Lactosa
PEP PEP
PYR Galactosa-6-P PYR
Lactosa-6-P Lactosa-6-P
1 2
Tagatosa-6-P
ATP Glucosa
ADP
3
Glucosa ATP
ATP Tagatosa-1,6-diP
ADP
ADP
Glucosa-6-P 4 Glucosa-6-P
NAD+
NADH
Fructosa-6-P Gliceraldehdo -3-P
NAD+ 6-fosfogluconato
ATP
NADH
ADP
1,3-difosfoglicerato
Fructosa-1,6-diP
ADP
ATP Ribulosa-5-P
7 CO2
Dihidroxiacetona-P 3-fosfoglicerato 8
Xilulosa-5-P
1: Fosfo--galactosidasa Acetil-P
2: tagatosa-6-fosfato isomerasa Fosfoenolpiruvato CoASH Pi
3: tagatosa-6-fosfato quinasa ADP
4: tagatosa-1,6-diP-aldolasa 5 9
ATP
5: piruvato quinasa Piruvato Acetil-CoA
6: lactato deshidrogenasa NADH
NADH
7: fructosa-1,6-diP-aldolasa NADH NAD+ NAD+
NAD+ 6 CoASH
8: pentosa-5-fosfato cetolasa
9: etanol deshidrogenasa Lactato Etanol Acetaldehdo
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La fermentacin de la lactosa en las bacterias lcticas: va homofermentativa y va heterofermentativa
2.1 Metabolismo de la lactosa
Leche de vaca: 40 a 50 g/litro de lactosa-unico azcar en estado libre.
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Metabolismo de la lactosa en Sc. thermophilus
Probablemente algunas posean una -galactosidasa o una fosfo--
galactosidasa o las dos, esto implicara la presencia de una permeasa
especfica de los -galactsidos, ya sea de un sistema PTS, ya sea de
los dos.
La galactosa producida por hidrlisis de lactosa no es fermentada
mayormente y es excretada, su no utilizacin sera debido a la
represin por la glucosa o la lactosa.
La glucosa proveniente de la lactosa se metaboliza a travs de la va
EMP: est presente una fuerte actividad de la hexoquinasa.
Metabolismo de la lactosa en Lactobacillus
Lactobacilos homofermentadores: Lb. Delbrueckii subsp.lactis,
Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. helveticus poseen una -Gal.
En Lb. acidophilus estn presentes la enzima anterior y la P--Gal, pero
con actividades variables segn cepas.
La lactosa debe penetrar por accin de una permeasa, Lb. delbrueckii
subsp. bulgaricus y Lb. helveticus no poseen un sistema PTS ni para
lactosa ni para galactosa. Slo utilizan la mitad de la glucosa de la
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molcula de lactosa.
Lactobacilos heterofermentadores
Las enzimas claves del metabolismo homofermentativo (la FDP
aldolasa y la triosa-fosfato isomerasa) estn ausentes.
Permeasa PEP-PTS
NADH
NAD+
Piruvato Lactato 1
6
TPP 11 Formiato 1: Fosfo--galactosidasa
2: tagatosa-6-fosfato isomerasa
12 NADH
Acetil-CoA 3: tagatosa-6-fosfato quinasa
NAD+
4: tagatosa-1,6-diP-aldolasa
6: lactato deshidrogenasa
Acetil-P Acetaldehdo 9: etanol deshidrogenasa
ATP NADH 10: galactoquinasa
ADP
13 9 11:piruvato formiato liasa
NAD+ 12:piruvato deshidrogenasa
Acetato Etanol 13:acetato quinasa
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Fermentacin de la galactosa en Lactococcus lactis: las 2 vas de penetracin y
los 2 tipos de metabolismo
Metabolismo de la galactosa en los Lactobacilos
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2.3 Metabolismo de las pentosas
Las pentosas en algunas especies de Lactobacillus heterofermentativos,
penetran ayudado por permeasas especficas y luego son convertidos en
D-xilulosa-5-fosfato y finalmente a lactato y acetato.
Numerosas cepas homolcticas de Lactobacillus, Streptococcus,
Lactococcus y Pediococcus pueden fermentar pentosas, aqui la
fermentacin de las pentosas es heterolctica con produccin de lactato
y acetato en cantidad equimolar.
Las bacterias que poseen un metabolismo homofermentativo en
presencia de hexosas y un metabolismo heterofermentativo en presencia
de pentosas son especies homofermentativas facultativas.
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2.5 Permeacin y el metabolismo de los otros azcares
La permeacin de la glucosa en bacterias lcticas puede darse por
una permeasa especfica o por el sistema PTS.
Existira dos PTS para la entrada d glucosa: PTS-glc (presente en
todas las bacterias homofermentativas que usa la va EMP) y la PTS-
manosa (permite la entrada de manosa, fructosa y glucosa).
La no utilizacin de la va de EMP conduce a la heterofermentacin.
La permeacin de la sacarosa y de la maltosa estara ayudado por un
sistema PTS-PEP. Slo una mitad de la molcula es metabolizada
por la va EMP, entonces se produce un bajo contenido en FDP y un
alto contenido de fosfato, esto sera responsable de la inhibicin de la
piruvato quinasa y de la LDH.
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1. Cuando hay crecimiento en azcares, la concentracin intracelular en
FDP es alta, la de Pi es baja: la piruvato quinasa y la LDH son activadas
y conducen el PEP hacia el lactato y no hacia los sistemas PTS.
2. Al mismo tiempo la alta concentracin de FDP activara la protena-
quinasa y la transformacin de las protenas HPr hacia la forma
HPr(ser)P inepta para la permeacin.
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2-desoxiglucosa
Lactosa
EII Man
EII Lac
EIII-Lac-P 2-desoxiglucosa-6-P
Glucosa
Lactosa-6-P
EIII-Lac 1
HPr Glucosa-6-P
HPr-P
EI-P
EI Galactosa-6-P Fructosa-6-P
2
PEP Tagatosa-6-P
3
5 Gliceraldehdo-2-P Fructosa-1,6-diP
Tagatosa-1,6-diP
Piruvato 4 7 1: Fosfo--galactosidasa
Gliceraldehdo-3-P 2: tagatosa-6-fosfato isomerasa
6 Triosa-P
3: tagatosa-6-fosfato quinasa
4: tagatosa-1,6-diP-aldolasa
Lactato Formiato 5: piruvato quinasa
Acetato Gliceraldehdo-1,3-diP 6: lactato deshidrogenasa
Etanol 7: fructosa-1,6-diP-aldolasa
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El ciclo de la gluclisis y el sistema fosfotransferasa en Lactococcus lactis
3. El metabolismo del citrato y del piruvato
El citrato solo, no puede ser utilizado como sustrato de crecimiento por
las bacterias lcticas. En presencia de un sustrato fermentable y de una
fuente de nitrgeno, ciertas bacterias lcticas pueden utilizar el citrato de
la leche.
La va metablica de utilizacin del citrato es idntica en bacterias
lcticas, conduce a la formacin de acetato (mayor parte excretado), CO 2
y de diacetilo (2,3 butanodiona) compuesto aromatizante, as mismo
son excretados otros productos como: la acetona y eventualente 2,3-
butanodiol.
Citrato permeasa
En Lc.lactis subsp.diacetylactis
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En Leuconostoc
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4. La produccin de acetaldehdo
Producido en cantidad variable por las bacterias lcticas, es de gran
importancia en bacterias del yogurt, es considerado el compuesto
aromtico ms importante del yogurt.
Es producido durante el crecimiento de Sc.thermopilus o de Lb.
delbrueckii subsp. Bulgaricus.
En el yogurt la produccin de acetaldehdo sera producido por los
Lactobacilos termfilos, la presencia de acetona puede alterar el aroma
del producto, as las mejores cepas deberan producir 2,8 veces ms d
acetaldehdo que de acetona.
Los precursores del acetaldehdo pueden ser el piruvato y el acetil-CoA
derivados del metabolismo de los azcares. En Lb.delbrueckii
subsp.bulgaricus y Sc.thermophilus una cantidad de acetaldehdo deriva
de la treonina que puede ser directamente escindida en glicina y
acetaldehdo por una treonina aldolasa.
La hiperproduccin de acetaldehdo por las bacterias del yogurt podra
explicarse por la ausencia de etanol deshidrogenasa (ADH) y as la
incapacidad de producir etanol a partir de acetaldehdo.
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5. Produccin de polisacridos
Sc.thermophilus y Lb.delbrueckii subsp.bulgaricus
o El crecimiento en leche de estas cepas les hace responsables de la
viscosidad, ejemplo en el yogurt. Esta viscosidad es atribuida a la
produccin de EPS (exopolisacrido) por dichas cepas.
o Lb.delbrueckii subsp.bulgaricus produce un EPS soluble en presencia
de diversos substratos carbonados y en fase exponencial precoz,
estara formado por fructosa y glucosa en relacin 2:1 y poseera
enlaces -(1,4) y -(1,6).
o El EPS de Sc.thermophilus difiere del de Lactobacilo por estar formado
de galactosa y de glucosa, adems estn presentes trazas de ramnosa,
arabinosa y xilosa.
Lactococcus lactis
o Cepas de Lc.lactis subsp.cremoris aisladas de leche fermentada cuyas
clulas son encapsuladas producen EPS. Este EPS podra ser una
glucoprotena
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6. Metabolismo aerobio
Las bacterias lcticas tienen metabolismo fermentativo y son
consideradas anaerobias son incapaces de sintetizar las porfirinas
hmicas.
Su sensibilidad al oxigeno vara segn cepas desde anaerobia estricta
a aerotolerante e insensible.
Poseen catalasas no hmicas llamadas pseudocatalasas bacterias
lcticas transforman el oxgeno molecular en superxido (O2), en
perxido (H2O) o en agua. En presencia del aire, el perxido si no es
destrudo por una peroxidasapuede acumularse, autoinhibir la cea
productora e inhibir cepas concurrentes.
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La presencia del oxgeno puede modificar el espectro fermentativo de las
bacterias lcticas y la naturaleza de los productos finales de la
fermentacin.
Metabolismo heterolctico aerobio de Leuconostoc
En aerobiosis las enzimas que fermentan (anaerobiosis) la glucosa
(acetil-fosfato tansferasa y etanol deshidrogenasa) son poco activas. Por
el contrario en aerobiosis, la NADH-oxidasa y la acetato quinasa son
activas y conducen el metabolismo hacia la formacin de acetato .
(figura)
El metabolismo aerobio produce una molcula ms de ATP por molcula
de sustrato: aumenta la tasa de crecimiento y rendimiento.
CoASH Piruvato
b Hidroxietil-TPP
CoASH
a
Formiato NAD+
NADH ADP
d
NAD+ f ATP
Etanol Acetato
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El metabolismo aerobio: Va heterofermentativa
Produccin aerobia de acetona
En ciertas cepas de Lc.lactis subsp.lactis la -acetolactato sintetasa es
activada y produce acetona (fig7) sobre todo en presencia de galactosa
y a la adicin de catalasa para eliminar el perxido.
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Ventajas del metabolismo aerobio
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7. Fermentacin malolctica (FML)
Durante vinificacin, en presencia de azcar como fuente de energa,
ciertas bacterias como Leuconostoc oenos son capaces de fermentar
concentraciones elevadas de cido mlico en cido lctico con un
rendimiento de transformacin muy elevado del 75 al 96%.
Leuconostoc oenos bacteria ms frecuente del vino a pH <3,5 y la ms
importante en la vinificacin y la nica que existe en el vino a este pH
cido.
La FML por Ln.oenos se acompaa de la degradacin de los cidos
ctrico y fumrico con formacin de cido actico y de la utilizacin de la
arginina, histidina y del acetaldehdo.
Ciertas especies de Lactobacillus y Pediococcus se aslan tambin del
vino a un pH igual o superior a 3,5 y realizar esta fermentacin, pero en
este caso no hay utilizacin del cido ctrico y fumrico ni produccin de
acetato.
El fumarato, etanol y un pH cido inhiben a las bacterias malolcticas y
as la fermentacin malolctica.
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La enzima responsable de la fermentacin malolctica (MLE)(E.C.
1.1.1.38). Es una malato-decarboxilasa que exige Mn2+ y NAD+ sin
reducirlo. Transforma el L-malato en CO2 y L-lactato que es liberado al
medio.
La enzima puede ser constitutiva o inducible por el malato en algunas
especies de bacterias lcticas. En presencia de malato se induce otra
enzima que es tambin una malato-decarboxilasa que produce piruvato
y CO2 reduciendo el NAD+
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9. Lipolisis
La actividad lipoltica de los Lactococos en la leche sera dbil pero
poda contribuir al sabor y aroma de los quesos madurados. Estas
bacterias hidrolizaran ms fcilmente los mono- y di-glicridos que los
tri-glicridos de la leche.
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10. Produccin de compuestos antagonistas
Las bacterias lcticas son conocidas por producir durante su crecimiento
sustancias que inhiben el crecimiento de otros m.o. Pueden ser los
metabolitos excretados por la bacteria como el cido lctico o derivados
del metabolismo del oxgeno como el perxido de hidrgeno. Tambin
producen bacteriocinas que son de naturaleza proteca.
1. En Lactococcus lactis
Se ha observado la produccin de 2 sustancias consideradas
antibiticos: la nisina y la diplococina.
La nisina, grupo de polipptidos producidos por Lactococcus lactis
subsp.lactis tiene accin contra las bacterias Gram positivas, acta sobre
las clulas vegetativas e impide tambien la germinacin de los esporos
de bacterias esporuladas como Bacillus y Clostridium.
La accin de la nisina seria sobre la membrana bacteriana, tambin
inhibe otras bacterias lcticas como a Lactococcus lactis subsp.cremoris,
pero sera inactiva frente a los Lactobacilos y Streptococcus
thermophilus.
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La nisina es el nico que est autorizado y comercializado en la
industria alimentaria para la conservacin de alimentos.
La diplococina es producida por Lactococcus lactis subsp.cremoris su
actividad es ms restringida que la nisina y acta sobre ciertas cepas de
Lactococcus lactis subsp.lactis pero no acta sobre las bacterias
esporuladas.
La diplococina (polipptido) detiene inmediatamente la sntesis de ADN
y ARN y la muerte de las clulas pero no su lisis.
2. En Lactobacilos
o Las bacteriocinas son de naturaleza proteica de accin bactericida y su
actividad esta restringido a especies parecidas.
En Lb.helveticus
Produce la lactocina 27 (glicoprotena). Es activa sobre cepas de Lb.helveticus o
de Lb.acidophilus, provoca el detenimiento de la sntesis proteica pero no la del
ADN o del ARN. La helveticina inhibe solo cepas de Lb.helveticus,
Lb.delbrueckii subsp.bulgaricus y de Lb.lactis.
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En Lb.acidophilus
En Lb. plantarum
En Lb.sake
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3. En Pediococcus
Tcnicas de conservacin
Los sistemas de conservacin de larga duracin de las bacterias lcticas
son la congelacin a muy baja temperatura y la liofilizacin.
Lactococcus lactis
Crece a 37C, para el recuento se usa el medio MRS (empleado sobre
todo para Lactobacilos) y el medio Elliker. El medio M17 es el ms usado
contiene -glicerato de sodio (efecto tampn del medio: a pH 7.15 el
crecimiento es rpido y colonias de buen tamao en medio slido).
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Las clulas no deben conservarse en medio cido, favorece las lesiones
de la envoltura y la prdida de los plsmidos, deben ponerse en
suspensin en un medio de leche nuevo y almacenadas en fro sin
incubacin.
Pueden almacenarse en fro en medio M17. El mtodo ms utilizado es
la congelacin y el almacenamiento a -30C o menor a -75C o en
nitrgeno lquido en un medio que contenga M17 nuevo y como
crioprotector glicerol.
La liofilizacin destruye hasta el 90-95% de las clulas.
Streptococcus thermophilus
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Leuconostoc
Los medios especficos utilizados no parecen ser muy eficaces, el medio
MRS se usa con frecuencia. No crecen bien en medio M17, su
crecimiento es posible en el medio KCA y Rogosa.
Lactobacillus
Para el recuento se utiliza con frecuencia el medio de Rogosa, aunque
tambien el medio MRS a un pH 6.5 pero con frecuencia de utiliza a pH
5.5.
La conservacin tras congelacin -196C de clulas concentradas es
buena incluso tras 28das. Tras siembra en leche pasteurizada y
conservacin a 5C, la viabilidad (21das) vara con las cepas.
Pediococcus
Se desarrollan bien en medios como MRS con pH 6.2 o en presencia de
cido ascrbico MRSS o de acetato de talio MRST y el medio RA a pH
6.2.
Las bacterias que sirven de fermentos pueden liofilizarse o mejor
congelarse en presencia de diversos
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crioprotectores.
Aplicaciones industriales
Fermentos industriales
Los probiticos
Es una preparacin bacteriana a base de bacterias lcticas intestinales
utilizada en forma revivificable con fines nutricionales o teraputicos
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Bacterias lcticas utilizadas frecuentemente son Lactobacilos:
Lb.acidophilus, Lb.casei, Lb.delbrueckii subsp.bulgaricus, Lb.helveticus,
Lb.lactis, lb.salivarius, Lb.plantarum y tambin Sc.thermophilus, etc.
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Consumo de leche con Lb.acidophilus vivo facilitara el transito intestinal,
combatira el estreimiento y el trastorno causado por antibiticos
ayuda a restaurar el equilibrio de la flora intestinal.
En la panificacin
o Se utilizan junto con cultivos iniciadores: Lb.sanfrancisco, Lb.plantarum,
Lb.delbrueckii, Lb.brevis, etc.