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Pasos para PCR

1. 1. Tecnologa delADN recombinante PCR Southern Blot


2. 2. PCR El aislamiento de grandes cantidades de segmentos especficos de ADN
puede ser realizado utilizando varias tcnicas, una de las cuales es la Reaccin en
Cadena de la Polimerasa (PCR).
3. 3. La PCR est basada en una reaccin de sntesis de DNA llevada a cabo in vitro
por la enzima Taq Polimerasa, una polimerasa de DNA resistente a la temperatura.
4. 4. Componentes de la reaccin: El tampn (buffer) Los nucletidos (dNTPs) Los
cebadores (primers) El ADN (muestra) La polimerasa (taq Polimerasa)
5. 5. Parmetros de la reaccin: Temperaturas en cada parte del ciclo Duracin de cada
parte del ciclo Velocidad de enfriamiento y calentamiento Nmero de ciclos
6. 6. En abril de 1983, Kary Mullis da a conocer la tcnica de reaccin en cadena de la
polimerasa, o PCR. Esta tcnica ha invadido de tal forma la Biologa Molecular, que
hoy en da es muy difcil imaginar esta ciencia sin ella. En 1989, Science seleccion el
PCR como el principal desarrollo cientfico, y la Taq polimerasa como la molcula del
ao. En 1993, Kary Mullis recibi por este descubrimiento el Premio Nobel de Qumica.
7. 7. Gracias a la PCR, la "insuficiente cantidad de ADN" ya no es una limitacin en la
investigacin en Biologa Molecular, ni en los procedimientos de diagnstico basados
en el estudio del ADN. El nmero de aplicaciones de esta tcnica parecen infinitas, y
continan creciendo sin parar. Una de sus posibles aplicaciones se centra en la
secuenciacin del ADN de muestras biolgicas.
8. 8. Desnaturalizacin Dos pequeos fragmentos de ADN, tpicamente de 10 pares de
bases, llamados primers, son sintetizados a travs de otra tcnica. Esos primers son
pequeos fragmentos de ADN que son complementarios a cada una de las
extremidades de la secuencia de ADN de inters. En un tubo de reaccin son
adicionados los primers, nucletidos libres de todas las bases nitrogenadas (adenina,
guanina,, timina y citosina), el ADN y una enzima especial resistente al calor llamada
Taq polimerasa, que promueve la sntesis de ADN. La mezcla es calentada a 95C lo
que provoca la separacin de las dos cadenas de ADN.
9. 9. Alineamiento Enseguida, la mezcla es enfriada hasta 55C, temperatura en la cual
los primers se unirn a las regiones complementarias de las molculas de ADN que
estn separadas. En este momento, dentro del tubo de reaccin, todo el ADN est en
forma de cadena simple, menos las dos pequeas regiones en las cuales los primers
de 20 pares de bases se ligarn a los dos lados de la secuencia de ADN.
10. 10. Alargamiento (polimerizacin) La temperatura se eleva entonces hasta 72C y la
Taq polimerasa comienza a sintetizar un nuevo ADN, comenzando por las regiones en
doble cadena, en donde cada uno de los primers se uni al molde de la muestra de
ADN. La Taq polimerasa promueve la sntesis de ADN apenas en la regin de doble
cadena. La sntesis ocurre a una tasa de aproximadamente 20 nucletidos por
segundo, y en un minuto es sintetizada una nueva copia del fragmento que se quiere
analizar.
11. 11. Repeticin del ciclo La reaccin entonces es nuevamente calentada a 95C
causando nuevamente la separacin de todo el ADN en las cadenas simples. Al final
del primer ciclo hay dos cadenas de la molcula original de ADN mas dos copias de la
regin de inters.
12. 12. La temperatura es disminuida de nuevo a 55C y ahora los primers se irn a unir
a los cuatro sitios en las dos copias nuevas y tambin en la molcula original de ADN.
LA temperatura del ciclo es nuevamente elevada a 72C y se multiplican entonces las
cuatro cadenas individualizadas.
13. 13. Estos ciclos son repetidos varias veces, tpicamente 30 veces, en un aparato
llamado termociclador. Al final de 30 ciclos de amplificacin existen aproximadamente
un milln de copias del segmento de ADN de inters por cada molcula molde original
de la muestra inicial. Es as que podemos seleccionar un fragmento especfico dentro
de todo el ADN.
14. 14. Estos ciclos son repetidos varias veces, tpicamente 30 veces, en un aparato
llamado termociclador. Al final de 30 ciclos de amplificacin existen aproximadamente
un milln de copias del segmento de ADN de inters por cada molcula molde original
de la muestra inicial. Es as que podemos seleccionar un fragmento especfico dentro
de todo el ADN
Preparacin de gel de agarosa para
electroforesis
Por DoctorGenoma | febrero 26, 2010

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Esto parece ms de cocinitas, pero es algo bsico en un laboratorio de biologa molecular. La


agarosa es un polisacrido formado por galactosas alfa y beta que se extrae de las algas de
los gneros Gellidium y Gracillaria. De lo que se trata es de formar una matriz inerte y no
txica para construir geles que permitan separar molculas de ADN mediante electroforesis,
adems de ser utilizada para fijar molculas a su estructura como anticuerpos, antgenos y
enzimas. Igualmente se utiliza para el cultivo celular y microbiologa. Otros usos menos
extendidos son la utilizacin de estos geles como matrices en la reparacin de tejidos
daados.
Una vez puestos en materia nos quedamos con la idea principal: separacin de molculas
gracias a un entramado que lo permite. Esta separacin se produce gracias a la aplicacin de
un campo elctrico. Las muestras migrarn de un lado a otro dirigidas por ese campo
elctrico. As molculas como los cidos nucleicos que son de polaridad negativa se dirigirn
al nodo.
Para la preparacin de un gel de agarosa se precisan 4 cosas:

1.La agarosa en polvo.


2.Tampn en el que se disuelve la agarosa y que sirve para embeber el gel y transmitir el
campo elctrico.
3.Fuente de calor o microondas para mezclar y fundir la agarosa en el tampn.
4.Cubeta y molde para solidificar el gel y sumergirlo en el tampn. La cubeta tiene los bornes
para conectar los cables a la fuente de alimentacin.

Los pasos a seguir son:


1. En un matraz, verter la cantidad de tampn para completar el volumen del molde a rellenar
con el gel.
2.Medir la cantidad de agarosa dependiendo de la concentracin a la que se quiera obtener el
gel. A ms concentracin, mayor resolucin. Por ejemplo, un gel al 2% sera 2 gramos de
agarosa en polvo disueltos en 100 ml de tampn. Como podis comprobar, la concentracin
se obtienen mediante la relacin peso/volumen. Sencillo.
3.Se procede a mezclar la agarosa con el tampn y fusionar los componentes para obtener el
gel. Se necesita una fuente de calor como un bao (poco recomendable si se quiere rapidez) a
una temperatura que permita fundir la agarosa o un microondas, que permite realizar el
proceso ms rpidamente. Con la experiencia, es todo un arte dependiendo de las
concentraciones y las agarosas. Pero esto es slo a modo introductorio.
4. Se enfra el gel para poder verterlo en la cubeta. Siempre hay que acordarse de poner unos
lmites con cinta para que no se disperse el gel por la mesa y el peine que formar los pocillos.
En unos minutos, al enfriarse del todo, se tiene el gel polimerizado.
5.Por ltimo se introduce en la cubeta que contiene el tampn, a la misma concentracin que
el que se ha utilizado para generar el gel.

Ya slo queda cargar las muestras y correr el gel al voltaje predeterminado (generalmente a 10
voltios por cm de gel, pero depende de las muestras, el gel y los protocolos a seguir). Luego
se deber realizar una tincin para poder ver las bandas. Existen varios mtodos y sern
limitantes para el posterior visionado, pero eso lo comentar en otro artculo.
El gel final se puede fotografiar y guardar la imagen. Incluso se pueden extraer bandas de
inters para un posterior anlisis, como podis ver en la imagen que he tomado estos das
donde estuve cortando unas banditas.

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