Una potente cepa bacteriana productora de biofracturante para la aplicacin en

las solicitudes de recuperacin mejorada de petrleo

Abstracto
Se investig la capacidad de los hidrocarburos que utilizan las bacterias para
producir biofracturantes. Fuera de 38 esporas formadoras de alcano utilizando
bacterias aisladas de las instalaciones de la refinera Jeddah, se aisl una
bacteria que produce una potente surfactina, mediante la tcnica de
enriquecimiento. El aislado fue purificado y caracterizado parcialmente como
miembros del gnero Bacillus y se design como BDCC-TUSA-3. Fue capaz de
biodegradarse 11,0 g de n-hexadecano y consumen ms del 82% en 55 h, pero
no se detect surfactina. Cuando se cultiva en Maldex-15, un subproducto
barato recuperado durante la fabricacin de jarabe de alta fructosa a partir de
almidn de maz, hasta 4650 mg.l-1 de surfactina se produjo en 40 h. Se
determin la caracterizacin cintica, para el crecimiento celular y la
produccin de surfactina de Maldex-15. se consigue una tasa de crecimiento
especfico mxima de 0,462 h-1, la eficiencia de conversin de 98,8% y la
productividad volumtrica del reactor de 155 gsurfactin.l-1.h-1. Los resultados
obtenidos sugieren que BDCC-TUSA-3 cepa puede ser de gran importancia
como agente Meor factible en casi todo campos de petrleo agotados.
Introduccin
Recientemente, se ha prestado atencin a los procesos de potenciador
microbiano para la recuperacin de petrleo (Meor). Biosurfactantes
producidos por ciertos microorganismos son algunos de los agentes ms
prometedores Meor [1].
Mejoran la recuperacin de petrleo mediante la reduccin de la tensin
interfacial (IFT) entre las interfaces de aceite y agua, o por mediacin de los
cambios en el ndice de humectabilidad del sistema.Los sistemas tensioactivos
microbianos tienen varias ventajas sobre los tensioactivos qumicos, tales
como menor toxicidad, una mayor biodegradabilidad y la eficacia a
temperaturas extremas o valores de pH [2]. Numerosos comentarios estn
disponibles en la produccin y aplicacin de biosurfactantes [1,3,4]. Muchas de
las aplicaciones potenciales que se han considerado para biosurfactantes
dependen de la naturaleza del biotensioactivo y si puede ser rentable
producido.
Surfactina es uno de los ms poderosos biosurfactantes producidos por varias
cepas de Bacillus subtilis, una bacteria Gram-positivas, mviles, bacterias
formadoras de esporas [5,6,7]. Se compone de una estructura de anillo de
siete aminocidos acoplado a una cadena de cidos grasos a travs de la
vinculacin de lactona. La surfactina disminuye la tensin superficial de 72 a
27,9 mN / m a concentraciones tan bajas como 0,005% y la tensin interfacial
del agua / hexadecano a <1 mN / m [8].
El presente estudio est dirigido a la bsqueda de una cepa bacteriana que
podra producir surfactina efectiva a partir de sustrato de residuos de bajo
costo y podra sobrevivir de forma simultnea en las duras condiciones
encontradas en la tubera del pozo petrolero.

Materiales y mtodos
sitio de muestreo
Se recogieron muestras de sedimentos, en el horario de verano, mx.
temperatura 45 C, de una tubera de transporte de petrleo en un sitio de
reparacin y mantenimiento, Jeddah refinera de petrleo, Sur de Jeddah, al
oeste de Arabia Saudita.
procedimiento de enriquecimiento
Con el fin de enriquecer selectivamente cepas microbianas termfilos que
podran degradar los hidrocarburos y es de esperar producir biofracturante una
cultura quimiostato se puso en un recipiente de vidrio de 2 l con un volumen de
trabajo de 1 l. se aadi medio mnimo de sal (MSM) en la siguiente
composicin: NaCl (0,001%), MgSO4 (0,06%), CaCl2 (0,004%), FeSO4 (0,002%)
y 0,1 ml de solucin de elementos traza contiene (gl-1) 2,32 ZnSO4.7H2O, 1,78
MnSO4.4H2O, 0,56 H3BO3, 1,0 CuSO4.5H2O, 0,39
NaMoO4.2H2O, 0,42 CoCl2.6H2O, 1.0 EDTA, 0,004 NiCl2.6H2O y 0,66 Kl. El
MSM se suministr adicionalmente con n-hexadecano como la nica fuente de
carbono y energa a 11,0 g.l-1 y se inocul con la muestra de sedimento en 5%
(w / v). La temperatura y pH se controlaron a 55 C y 7,2, respectivamente, y
la velocidad de agitacin se mantuvo a 200 rpm y el cultivo continu durante 5
das. Esto se repiti 8 veces despus de lo cual se prepararon y se sembraron
en placas de agar de MSM con n-hexadecano en 11,0 g.1-1 como fuente de
carbono y energa diluciones en serie del cultivo obtenido [9]. As, las colonias
microbianas desarrollaron se ensayaron adicionalmente, purificado y sub-
cultivaron en el mismo medio.
A los cultivos madre congelados se almacenaron en glicerol al 30% a -70 C.
La biomasa (peso seco): biomasa bacteriana se determin por centrifugacin
un volumen conocido de caldo de fermentacin a 1000 g durante 15 min. La
biomasa se lav dos veces con agua destilada y se sec durante la noche a 90
C hasta peso constante.
caractersticas de crecimiento de aislados bacterianos: observaciones
de la morfologa de clulas vegetativas se realizaron en cultivos cultivados
durante 24 horas, en agar nutritivo (NA) medio, a 30 C. Los microorganismos
fueron examinados en 1000 aumentos, usando microscopa de contraste de
fase, para la forma de las clulas, la presencia de cadenas, y para la reaccin
con la tincin de Gram [10]. Para determinar la motilidad, las cepas se
cultivaron en pendientes de NA y despus de 6 h, o tan pronto como el
crecimiento apareci despus, un asa de siembra del lquido en la base de la
pendiente se examin a 1.000 x ampliacin por microscopa de contraste de
fase.
La actividad de la catalasa de aislados bacterianos se detect mediante la
resuspensin de una colonia en una solucin de 3% de perxido de hidrgeno
(Sigma).
La capacidad de crecer en diferentes fuentes de carbono se determin
mediante el control de la densidad ptica a 600 nm de cultivos crecidos en
caldo nutriente suministrado con glucosa, xilosa, maltosa, sacarosa, celobiosa,
galactosa, almidn, manitol o Tween 80 como fuente de carbono.
la produccin de biosurfactante: Con el fin de probar para la produccin
biofracturante agitacin de 500 ml frascos cada carg con 250 ml de MSM que
contienen se utilizaron 20 g.l-1 de Maldex-15 como fuente de carbono. Maldex-
15 es una dextrina -amilasa producida durante la produccin comercial de
jarabe de fructosa a partir de almidn de maz. Contiene 1% de glucosa, 3% de
maltosa, maltotriosa 5% y 91% de oligo- y megalosaccharides [11]. Los
matraces se inocularon con un cultivo de 24 h de cada cepa bacteriana en 5%
(v / v) y se incubaron en un agitador rotatorio a 50 C y 200 rpm.
Se tomaron muestras al final de cada ejecucin de cultivo, se centrifugaron a
1000 g durante 15 min y se examinaron para biosurfactantes.
La deteccin de la actividad biofracturante: la actividad biofracturante de
las bacterias aisladas se detect mediante el uso de la tcnica de propagacin
de aceite y la prueba de estabilidad de la emulsin en tres aceites diferentes:
queroseno, petrleo crudo y aceite de motor.
Aceite tcnica de difusin: Las capacidades de los aislados bacterianos se
determinaron midiendo el dimetro de las zonas claras se produjo cuando una
gota de una solucin contiene biotensioactivo, se coloca sobre una superficie
de aceite-agua [12]. Se aadieron 50 ml de agua destilada a una placa de
Petri, 15 cm de dimetro, seguido de la adicin de 20l de aceite a la superficie
del agua. Despus, se aadieron 10l de sobrenadante de cultivo bacteriano.
El dimetro de las zonas claras desarrolladas se determin por triplicado.
estabilidad del emulsionamiento (E24) de la prueba: E24 de muestras de
cultivo se determin mediante la adicin de 2 ml de aceite a la misma cantidad
del cultivo, mezclando con un vrtice durante 2 min y dejando reposar durante
24 horas. El ndice de E24 se da como porcentaje de la altura de la capa
emulsionada (mm) dividido por la altura total de la columna de lquido (mm)
[13].
Superficie mediciones de la tensin: Ellos se hicieron con un Fisher
Autotensiomat (Fisher Scientific Co., Pittsburgh, Pa.). concentraciones de
surfactina relativas se determinaron mediante la dilucin del cultivo hasta que
se alcanz la concentracin micelar crtica (CMC) [14].
Aislamiento de surfactina: El mtodo descrito por Cooper et al. [15] fue
utilizado. surfactina bruto se aisl mediante la adicin de cido clorhdrico
concentrado a caldo de cultivo despus de la eliminacin de la biomasa por
centrifugacin. Se form un precipitado al disminuir el pH a 2, que podra ser
recogida, se sec, y se extrajo con diclorometano. El disolvente se elimin a
presin reducida para dar un slido blanquecino. La purificacin adicional se
logr mediante recristalizacin. El extracto de diclorometano se disolvi en
agua destilada que contiene suficiente NaOH para dar pH 7. Esta solucin se
filtra a travs de Whatman no. 4 de papel y reducido a pH 2 con HCl
concentrado.
El slido blanco se recogi en forma de grnulos despus de la centrifugacin.
caracterizacin cualitativa de la biofracturante producido:
Cromatografa de capa fina se utiliz con el fin de caracterizar biotensioactivo
producido en caldo de cultivo de cepas bacterianas de acuerdo con el mtodo
de Yin et al. [diecisis]. Una parte de la biosurfactante bruto se separ en una
placa de gel de slice usando CHCl: CHOH: H2O (70: 10: 0,5, v / v / v) como el
desarrollo de sistema de disolventes con diferentes reactivos de desarrollo de
color. Reactivo de ninhidrina (0,5 g de ninhidrina en 100 ml de acetona
anhidra) se utiliz para detectar surfactina como puntos rojos.
Tiempo curso para el crecimiento celular y la produccin de biosurfactante: En
otra serie de experimentos, una cultura quimiostato de 3-l cargado con 1700
ml de MSM que contienen se llev a cabo 40 g.l-1 de Maldex-15 para cada una
de las cepas bacterianas seleccionadas. Se establecieron las condiciones de
cultivo como se ha descrito anteriormente. Se tomaron muestras a intervalos
regulares y se analizaron para la biomasa, surfactina y los hidratos de carbono
residuales.
Anlisis
El hidrato de carbono total en el caldo de cultivo se estim por el mtodo de
fenol-cido sulfrico usando manosa como un estndar [17]. La tasa de
crecimiento especfica se determin segn PIRT [18]. Se utiliz la siguiente
ecuacin

.loge.t = log X2- log X1

Donde = tasa de crecimiento especfico, loge = logaritmo natural, X1 y

X2 = concentraciones de dos valores para la biomasa (DW) en mitad de la fase
logartmica de crecimiento celular y t = tiempo entre medidas de X1 y X2.

resultados
El aislamiento y la identificacin parcial de hidrocarburos utilizando y
microorganismos productores de biotensioactivo
Cuarenta y ocho cepas microbianas con la capacidad de crecer en n-
hexadecano como nico fuente de carbono y energa y que representa las
diferentes morfologas de colonias se obtuvieron (Figura 1). Estos incluyen 38
(9,2%) cepas como las bacterias formadoras de esporas, 8 (16,7%) como no
formadoras bacterias formadoras y 2 (4,2%) como levaduras. No se utilizaron
adems la formacin de bacterias y levaduras no forma esporas. Por tanto,
este estudio se limita a la produccin biofracturante por la formacin de
esporas de bacterias que utilizan alcanos.
De los 38 aislamientos bacterianos formadoras de esporas, 3 mostraron
biodegradacin efectiva de hidrocarburos con una eficiencia de conversin de
ms del 69%. Las tres cepas bacterianas fueron nombrados despus de la
Coleccin de Cultivos Departamento de Biotecnologa de la Universidad de Taif,
Arabia Saudita como BDCC-TUSA-1, BDCC-TUSA-2 y BDCC-TUSA-3 y wereused
para los experimentos de produccin biofracturante.
Caractersticas morfolgicas y bioqumicas
Los aislados morfolgicamente distintos fueron identificados por las
propiedades morfolgicas, fisiolgicas, y quimio-taxonmica de acuerdo con el
Manual de Bergy de bacteriologa determinativa [19].
Los tres aislamientos seleccionados fueron formadores de esporas, aerbica,
mviles, gramo varillas positivos, catalasa positiva, indol negativo, termfilo
(creciendo vigorosamente a 55 C) y se puede utilizar la glucosa, xilosa,
maltosa, sacarosa, celobiosa, galactosa, almidn y manitol como fuentes de
carbono y energa, pero que no pueden utilizar Tween 80. Esta identificacin
parcial las caracteriza como miembros del gnero Bacillus [20]. Estos
resultados estn en buen acuerdo con los obtenidos por Pokethitiyook et al.
[21] y Sadeghazad y Ghaem [22] que inform de que las especies de bacilos
estaban entre los microorganismos ms eficaces en la biodegradacin de
alcano y la prevencin
de precipitacin de la cera y la deposicin.
Examen para la produccin biofracturante
Aceite de capacidad de desplazamiento y la actividad de emulsin estn entre
las caractersticas ms importantes de la produccin de biofracturante
microorganismos [1,7]. Estas caractersticas han demostrado aumentar la tasa
de biodegradacin de hidrocarburos, estimular el crecimiento microbiano,
reducir la viscosidad del aceite crudo y mejorar la recuperacin de aceite a
aceite
campos [23,24,25]
En el presente estudio, biosurfactantes Nunca se detectaron en caldo de cultivo
de cepas bacterianas cultivadas en HSH en presencia de n-hexadecano como
nica fuente de carbono. Por el contrario, Margaritis et al. [23] y Etoumi [26]
encontraron varios tipos de biosurfactantes con cepas bacterianas de las
especies de Pseudomonas y actinomicetos cuando se crece en n-hexadecano.
Esta discrepancia se debe muy probablemente a la naturaleza de los
microorganismos fermentativos y sustratos utilizados.
Por lo tanto, se intent probar posibilidades para la produccin de
biosurfactante por estas cepas en los suministros de HSH con Maldex-15 como
sustrato de fermentacin. Los tres bacteriana seleccionada asla con la tasa de
utilizacin ms alta de alcano (Tabla 1) fueron probados para la produccin de
biosurfactante de una fuente de carbono alternativa como se describe en
la seccin de Materiales y Mtodos. Cuando crece en MSM con Maldex-15 como
fuente de carbono, theisolates producido biotensioactivo con concentracin
variable como sobrenadantes de cultivo exhiben capacidades de
desplazamiento variable (Tabla 2) y las actividades de emulsificacin (Tabla 3).
Cleary, aislar BDCC-TUSA-3 mostr un mejor rendimiento en comparacin con
los otros twoisolates. Un rea de desplazamiento de aceite, el ndice de
emulsificacin (E24), con el petrleo crudo, de 67,9 cm2 y 97% se registran
para aislar BDCC-TUSA-3 en comparacin con slo 12,6 y 28% para aislar
BDCC-TUSA-2 y 32,2 y 89% para asla BDCC-TUSA-1, respectivamente. Estos
resultados son comparables con los reportados por Etoumi [26] y Margaritis et
al. [23] el uso de especies de Pseudomonas.
Mientras los ndices de emulsificacin registrado para los tres hidrocarburos,
queroseno, petrleo crudo y aceite de motor (Tabla 3), haba una diferencia en
la actividad de emulsificacin de aislado de BDCC-TUSA-3 en los tres
hidrocarburos. Un ndice de emulsin de 97% se logr con el petrleo crudo,
90% para aceite de motor y 86% para el queroseno. Por lo tanto, aislar
BDCC-TUSA-3 mostr una emulsin preferente en el orden del crudo> aceite de
motor> queroseno.
Aislamiento e identificacin de biotensioactivo
Se identific el biotensioactivo producido como surfactina por la tcnica de TLC
como manchas de color rojo se desarrollaron despus de la aplicacin de
reactivo de ninhidrina. Una vez ms, aislar BDCC-TUSA-3 exhibi el mayor valor
Rf y demostr ser los mejores productores de surfactina entre las cepas
analizadas (Tabla 4).
Tiempo curso para el crecimiento celular y la produccin de biosurfactante
Figura 2 y la Tabla 5 muestra el patrn de crecimiento y la produccin de
surfactina de Maldex-15 por las tres cepas bacterianas seleccionadas.
Como se evidencia a partir de (Figura 2), Madex-15 apoya el crecimiento y la
produccin de surfactina de todos los aislamientos, pero a diferentes
velocidades y eficiencias con aislamiento BDCC-TUSA-3 es la mejor. Casi no se
observ ninguna fase de latencia durante el crecimiento. Alrededor del 20% de
hidratos de carbono se consume durante las primeras 10 h de cultivo, con 0,8-
1,2 g.l-1 de la biomasa bacteriana. No se detect surfactina durante este
perodo.
Con aislado BDCC-TUSA-3, la concentracin de biomasa mxima de 5,96 gl-1 se
logr despus de 20 h seguido de la mxima produccin de surfactina de 4650
mg.l-1 a 30 h con un consumo casi completo de Maldex-15 (98,7%? ) (Tabla 5).
Esto est de acuerdo con Bala et al.
[27] y No et al. [6], pero en desacuerdo con Sheppard et al. [28] inform de
que la mxima produccin de surfactina a mediados de la fase de registro y
Gong et al. [7] que encontr que la produccin de surfactina fue un proceso de
crecimiento asociado. Esta discrepancia podra atribuirse a la naturaleza de los
microorganismos y los parmetros ambientales y culturales
empleado en cada estudio.
Los aislados BDCC-TUSA-1 (Figura 2A) y BDCC-TUSA-2 (Figura 2B), dio lugar a
mucho ms bajos Maldex-15 eficiencias de conversin (68,1 y 56,9%,
respectivamente) con concentraciones de biomasa de tan slo 2,82 y
1,47 g.l-1, respectivamente. Al mismo tiempo, el aislado bacteriano
BDCC-TUSA-1 produce slo 2,050 mg.l- de surfactina incluso cuando su
capacidad para degradar n-hexadecano fue el mejor (Tabla 1). La produccin
de surfactina ms bajo de 560 mg.l-1 se registr para aislar BDCCTUSA- 2
(Tabla 2).
Como se ilustra en la (Figura 2), se observ una disminucin gradual de la
tensin superficial para las tres cepas bacterianas. Este fue coordinada con el
inicio de la produccin de surfactina. Se detect la tensin superficial mnima
despus de aproximadamente 15 h y se mantiene durante todo el perodo de
cultivo restante. En contraste, la produccin de surfactina sigui aumentando
alcanzando su mximo en casi 25 h, donde
ya se ha alcanzado la fase estacionaria del crecimiento celular.
Con respecto a los parmetros cinticos generales, aislar BDCCTUSA- 3 mostr
ventaja sobre los otros aislados (Tabla 2). Thisisolate alcanzado los valores ms
altos: tasa de crecimiento especfico 0,462 h-1, rendimiento 0,151 crecimiento
gcells.gMaldex-15, surfactina producir 117,9 gsurfactin / gMaldex-15, el
rendimiento de surfactina por unidad de peso seco de 780,2 mgsurfactin /
gcells y la productividad volumtrica del reactor de alto 155 gl-1.h-1. No et al.
[6] desarrollado un proceso para la produccin de surfactina continua utilizando
un biorreactor de transporte areo utilizando Bacillus subtilis y el registro de
una de las tasas ms altas de crecimiento especficos, reportado en la
literatura (0.447h-1) que es menor que la reportada en este estudio. Esto es
ms probablemente debido al aumento de las concentraciones de glucosa libre
y de cadena corta
maltodextrinas presente en Maldex-15 que podra iniciar el crecimiento celular
y la multiplicacin activa.
Durante los ltimos 50 aos, un nmero de resultados prometedores se han
obtenido en la mejora del rendimiento de surfactina por fermentacin. Arima et
al. [29] producido en primer lugar surfactina, con una produccin nica con 50-
100 mg L-1 en un cultivo de 24 -h. Entonces, Cooper et al. [15] desarroll un
proceso continuo con la eliminacin de productos y catin metlico adems
que dio lugar a la mejora de rendimiento de surfactina de 780 mg.l-1. Mulligan
et al. [30]
utilizado el mutante ultravioleta del Bacillus subtilis ATCC 21332 que
produjeron ms de tres veces ms surfactina (1,124 mg / L). Ms
recientemente, Sen y Swaminathan [31] optimizan el medio de fermentacin y
obtener una produccin mxima de surfactina 760 mg.l-1. Cleary, los
resultados obtenidos en el presente estudio ?? El uso de aislar BDCCTUSA- 3 se
comparan muy favorablemente con los reportados en la literatura y demostrar
su superioridad. Como cultivador rpido en alcanos, productor mviles y eficaz
de surfactina, el aislado bacteriano BDCC-TUSA-3 tiene un potencial de
aplicaciones como agente de Meor en yacimientos de petrleo casi agotados
y / o aquellos con historia de deposicin de cera de parafina.
Conclusin El presente estudio proporciona una notable cepa de bacterias
termfilas con una potencialidad prometedor en el uso como agentes MOER.
El Maldex-15, un subproducto recuperado durante la fabricacin de jarabe de
fructosa a partir de almidn de maz, fue demostrado ser un sustrato viable
para fermentativa relativamente alta produccin de surfactina.
Al lado de la disponibilidad de potentes BDCC-TUSA-3 cepa y el sustrato de
fermentacin baratas para el crecimiento celular y la produccin de surfactina,
proceso de produccin de surfactina necesita ser totalmente optimizado, tanto
a nivel biolgico y de ingeniera con el fin de competir con xito con
surfactantes qumicos. Trabajar isin progreso con el fin de optimizar las
condiciones culturales y ambientales necesarias para tasas ms altas para la
utilizacin del sustrato y produccin de surfactina tambin.

Figura 1 Distribucin de los diferentes tipos de

microorganismos presentes en las
muestras de aceite contaminado.

Tablas Con respecto a los parmetros

cinticos generales, aislar
BDCCTUSA- 3 mostr ventaja sobre
los otros aislados (Tabla 2). Este 1,
los porcentajes de conversin de n-
hexadecano de biomasa 2, g de
biomasa (DW) producido a partir de g
de hexadecano consumido.
Tabla 1 Parmetros de crecimiento de las tres
cepas bacterianas cultivadas en MSM
con n-hexadecano como fuente de
carbono y energa.
Tabla 2 zona de Desplazamiento de aceite
por sobrenadante libre de clulas de
 las tres cepas bacterianas.
Tabla 3 ndice de emulsificacin (E24) de
sobrenadante libre de clulas de las
tres aislado bacteriano con varios
hidrocarburos de petrleo.
Tabla 4 Los valores de Rf para biofracturante
utilizando cromatografa en capa fina.
1, los porcentajes de Maldex-15
conversin a biomasa y surfactina 2,
mg surfactina produce a partir de 1,0
g de Maldex-15 3, la biomasa g de
clulas (peso en seco) produce a
partir de 1,0 g de Maldex-15

Tabla 5. Cintica de crecimiento de las clulas

y la produccin de surfactina por las
tres cepas bacterianas cultivadas en
MSM con Maldex-15 como nica
fuente de carbono.
Figura 2 Modelo de crecimiento celular y la
produccin de surfactina por la
aislamientos bacterianos BDCC-TUSA-
1 (A), BDCC-TUSA-2 (B) y BDCC-TUSA-
3 (C) cultivadas en MSM suministra
con Maldex-15 como carbono fuente.