INTRODUCCIN A LAS TCNICAS CROMATOGRFICAS

La primera aplicacin que se conoce es la de Tswett a comienzos del siglo XX (1903).

Separ varios pigmentos de plantas tales como la clorofila y xantfilas, haciendo pasar
soluciones de estos compuestos a travs de una columna de vidrio rellena con carbonato de
calcio finamente dividido.

Las especies pueden

identificarse por sus colores,
de ah el nombre
cromatografa.
Hoy en da tiene poco que ver
con la separacin por colores.
Cada banda puede colectarse
separadamente y analizarse
cuali y cuantitativamente.
TCNICAS DE IDENTIFICACIN Y PREPARACIN
En papel o placa Columna (preparativa)
CROMATOGRAMAS
Un cromatograma es un grfico de alguna propiedad relacionada con la concentracin de
los componentes en funcin del tiempo o del volumen de elucin.
Si en el extremo de la columna se coloca un detector que responda a la concentracin de los
componentes y se grafica la seal en funcin del tiempo durante la elucin, se obtiene una
serie de picos. La posicin y el rea de los picos se utiliza para anlisis cuali-cuantitativo.
 TCNICAS CROMATOGRFICAS
Es un conjunto de tcnicas de separacin en las que los diversos componentes de la muestra,
se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es fija (FASE ESTACIONARIA) y la otra es
mvil (FASE MVIL). Esta distribucin es caracterstica para cada sustancia o componente,
por lo que se logra una separacin.
La fase estacionaria puede ser un slido o un lquido y la fase mvil puede ser un gas, un
lquido o un fluido supercrtico.
La forma del sistema cromatogrfico, la naturaleza de las fases mvil y estacionaria, y el
fenmeno fsico-qumico involucrado en la distribucin de los solutos entre las fases,
permiten clasificar las tcnicas.

CP

CCD

CGL CGS

CLL CLS, incluye CE (CPG, FG), CII, CB

(HPLC)
CFS
 CROMATOGRAFA CUANTITATIVA

Columna
Deteccin
Fuente de
eluyente

Inyeccin

H

L N = L/H
Platos tericos
CROMATOGRAFA INSTRUMENTAL EN COLUMNA
CROMATOGRAFA LQUIDO-SLIDO (CLS) o GAS-SLIDO (CGS)
POR ADSORCIN
Se basa en la adsorcin selectiva de los componentes de la muestra sobre la fase
estacionaria y en las diferentes solubilidades o volatilidades en la fase mvil.
Ej. CCD

La interaccin con el slido ocurre debido a enlaces con grupos o sitios activos en la
superficie, la desorcin ocurre por volatilizacin en el gas carrier (CGS) o por
disolucin en el lquido de elucin (CLS)
 CROMATOGRAFA LQUIDO-LQUIDO (CLL)
DE REPARTO O PARTICIN
La separacin se basa en la diferencia de
los coeficientes de particin (solubilidades)
para cada componente de la muestra entre
dos solventes inmiscibles, uno fijo e
inmovilizado en la superficie de un soporte
slido y otro mvil.

Ej.: CP La celulosa del papel forma

puente de H con agua retenida formando
la fase estacionaria. La fase mvil sube por
accin capilar, los componentes ms
solubles en la fase estacionaria sern ms
retenidos y se movern ms lentamente.

El FACTOR DE RETENCIN (Rf) se calcula

por la relacin entre las distancias
recorridas.
CROMATOGRAFA LQUIDO-SLIDO DE INTERCAMBIO
INICO o CROMATOGRAFA INICA (CI)
La fase estacionaria est constituida por una matriz
(polimrica) con grupos funcionales ionizables.

Intercambiadores catinicos: con sitios cargados

negativamente.

Intercambiadores aninicos: con sitios

cargados positivamente.
CROMATOGRAFA LQUIDO-SLIDO (CLS)
DE EXCLUSIN POR TAMAO O PERMEACIN EN
GELES O FILTRACIN EN GELES
La fase estacionaria es una matriz (polimrica, ej: Sephadex)
inerte, con partculas de forma, tamao y porosidad uniformes.

Las molculas de menor tamao pueden entrar en los poros y por

eso son ms retenidas, las de mayor tamao pasan entre los
granos sin penetrar y son arrastradas por la fase mvil
CROMATOGRAFA LQUIDO-SLIDO (CLS)
POR BIOAFINIDAD
Porath 1967- para separacin de protenas.
Fase estacionaria con grupos especficos para retencin de
las molculas de inters.
CROMATOGRAFA CON FLUIDOS
SUPERCRTICOS (CFS)
Esta tcnica permite la separacin y determinacin de compuestos que no pueden
analizarse por la cromatografa de gases ni por la de lquidos: compuestos no voltiles o
trmicamente lbiles.
Una sustancia a temperaturas y presiones por encima de su temperatura y de su presin
crtica (punto crtico) se denomina fluido supercrtico que es otro estado de agregacin de la
materia. Los fluidos supercrticos tienen propiedades distintas a las de esas sustancias en
estado gaseoso, lquido o slido.
Una propiedad importante de los fluidos supercrticos, que est relacionada con sus
densidades elevadas (de 0,2 a 0,5 g/cm3), es su notable capacidad para disolver molculas
grandes no voltiles.
Por ejemplo, el dixido de carbono supercrtico disuelve fcilmente n- alcanos que poseen
entre 5 y 30 tomos de carbono. Otra propiedad notable de estos fluidos es que los analitos
disueltos en ellos pueden ser fcilmente recuperados por el procedimiento simple de
volatilizar el solvente al permitir que las soluciones se equilibren con la atmsfera.
Los equipos instrumentales para la esta cromatografa son parecidos los de HPLC con dos
diferencias importantes: es necesario un control preciso de la temperatura y de la presin, y
poseen un dispositivo restrictor que convierte en gas al fluido antes de que llegue al
detector.
 CROMATOGRAMAS

Tiempo de retencin (tr): de un componente, es el tiempo que transcurre desde la

inyeccin de una mezcla en la columna hasta que ese componente llega al detector
(mximo del pico cromatogrfico).
Volumen de retencin (Vr): es el volumen de fase mvil necesario para eluir un soluto
determinado de la columna.
La fase mvil que no es retenida por la fase estacionaria atraviesa la columna en el mnimo
tiempo posible, denominado tiempo muerto (tm).
El tiempo de retencin corregido (tr) de un soluto es la diferencia entre el tiempo que
tarda un soluto en atravesar toda la columna y el que emplea un disolvente no retenido.
PROCESOS EN LA COLUMNA
La eficiencia de una columna cromatogrfica para separar los componentes depende de sus
velocidades de elucin relativas.
Estas velocidades estn determinadas por la relacin de las concentraciones de soluto en
entre la fase estacionaria y la fase mvil.
Para el soluto 1 A, el equilibrio de pariticin implicado (suponiendo que se llega al equilibrio
en un plato terico) se describe:

1 (mvil) 1 (estacionaria)
Kd = a1 e / a1 m C1 e / C1 m
(Las actividades pueden reemplazarse por las concentraciones molares en soluciones)
diluidas.
Podemos introducir un parmetro cromatogrfico:

Kd = CAe / CAm = nAe . Vm / nAm. Ve = k Vm / Ve

Siendo el llamado factor de capacidad k = tr / tm

Este factor adimensional que sirve para comparar la retencin de un compuesto por la
fase estacionaria, es independiente del caudal.
EFICIENCIA DE LA COLUMNA
Se mide la eficiencia de una columna como el nmero de platos tericos, que es el cuadrado
de la relacin entre el tiempo de retencin corregido y la desviacin estndar del pico (el
ancho del pico en la base es 4).

N = (tr /)2 = 16 (tr / w)2 = 5,54 (t'r / w1/2)

Altura equivalente
de un plato terico
H = L/ nplatos

H
L

Para aumentar la eficiencia de una columna se debe evitar el ensanchamiento de las
bandas o picos debido a varios factores
CROMATOGRAMAS

Ya hemos visto el factor de retencin (k):

k = K Vestac./Vmvil = t'R/tM
Se define la retencin relativa () o factor de selectividad para dos componentes, como el
cociente de los tiempos de retencin ajustados.
= k2/k1 = t'R,2/kR,1
Para la cuantificacin se utiliza el rea de los picos, previa calibracin, generalmente por
los mtodos de estndar interno o externo.
RESOLUCIN DE LA COLUMNA
El problema de la buena separacin de todos los componentes de una mezcla queda
reducido siempre a la separacin de las dos bandas ms difciles de separar.
La resolucin (Rs)se define como el cociente de la distancia entre los centros de las dos
bandas y el valor medio de sus ensanchamientos.

Rs = 2 t / w1 + w 2 Para valores altos

de y bajos de Rs,
la separacin
mejora con el
aumento de la
eficacia; para
valores bajos de
solo se puede lograr
una mejora
cambiando el
sistema (fase mvil
o columna)
 2(t R , B t R , A )
R
wB wA
 Eficiencia de la separacin

N = L/H columna, efectos cinticos

'
N 1,2 1 k2
R '
4 1,2 1 k2

Particin f.mvil/f.estacionaria, efectos termodinmicos

 Teora de van Deemter

B
H A Cu
u
A Camino
mltiple
B Difusin
longitudinal

C Resistencia
a la transferencia
de materia
Grfico de van Deemter y tamao de partculas
El problema de la elucin
Efecto de la temperatura (en CG)
Efecto del solvente (en CL)
CROMATOGRAFA GASEOSA
Se utiliza un cromatgrafo de gases.
La fase mvil es un gas inerte (N2 , Ar) puro.
La fase fija puede ser un slido o un lquido
fijado en un soporte sobre las paredes de la
columna.

Sirve para analizar mezclas voltiles y

estables.
Regulador
de flujo-
Manmetro Inyector
Cromatograma

Horno
Datos

Cilindro
de gas
Columna
CROMATOGRAFA GASEOSA - Equipo
Inyector 1- Septum
2- Alimentacin de gas carrier
3- Bloque calefactor metlico
4- Punta de la columna cromatogrfica.

Columnas
Empaquetadas
Largo: 0,5 a 5m
o rellenas
Dimetro externo: 2 a 4 mm
Relleno: 0,5 a 25% de fase
estacionaria lquida sobre soporte

Capilares Largo: 12 a 60 m
Dimetro externo: 0,1 a 0,5 mm
Relleno: slido o pelcula lquida
CROMATOGRAFA GASEOSA - Equipo
Columnas Tipo Ventajas Desventajas

Rellenas Menos costo Menor eficiencia

Ms capacidad de carga Anlisis ms lento

Capilares Mayor eficiencia Satura rpidamente

Anlisis rpido (pequeos
Mejor separacin volmenes de
muestra)
CROMATOGRAFA GASEOSA - Equipo
Detectores
de conductividad trmica (TCD)
Seal basada en la diferencia en la
conductividad trmica de un Muestra
filamento de W cuando pasa gas
carrier y cuando pasa alguna otra Referencia
sustancia.
Es universal, todas las sustancias
generan alguna seal.

de ionizacin en llama (FID)

Bobina de Electrodos
Seal basada en la variacin de la ignicin
corriente debido a la influencia de
iones y electrones formados en una
llama de H2
No detecta sustancias inorgnicas. Aire
Columna
de captura electrnica (ECD)
Solo para compuestos orgnicos halogenados (pesticidas).
CROMATOGRAFA GASEOSA - Equipo
Otros detectores
de emisin atmica (AED)
Atomiza la muestra y detecta la emisin de los tomos. En principio detecta
elementos, no compuestos

detectores termoinicos (TID)

Similar al de ionizacin en llama, pero especialmente sensible a P y N

de quimioluminiscencia de azufre (SCD)

Reaccin de compuestos sulfurados con ozono, que produce fluorescencia.
Solo para azufre.

Mtodos acoplados
con transformada de Fourier (GC-FTIR)
con espectrometra de masa (GC-MS)
CROMATOGRAFA GASEOSA
Temperatura
Anlisis Isotrmico
-Primeros picos agudos y
poco resueltos
-ltimos pcos bajos, anchos,
muy resueltos.
-Cpmponentes con elevada
masa molecular no eluyen

Anlisis con programacin de temperatura (optimizacin)

-Menor tiempo de anlisis
-Minimizacin de
transformaciones qumicas de
los componentes ms inestables
-Mejor resolucin de todos los
picos.
CROMATOGRAFA GASEOSA - Ejemplos
CROMATOGRAFA GASEOSA - Ejemplos
Mtodos de cuantificacin

Normalizacin simple de reas

Factores de respuesta
Calibracin externa
Estndar interno
Estndar interno con calibracin externa
Agregado patrn
 Normalizacin simple de reas

Se utiliza con detectores FID, donde la seal es

aproximadamente proporcional a la masa.
Entonces, normalizando las masas tal que la
suma sea el 100%, se obtienen los porcentajes
en masa de los analitos del cromatograma
 Factores de respuesta
Conocido tambin como normalizacin relativa
de reas, toma un compuesto como
referencia (generalmente agregado) presente
tanto en la muestra como en los patrones, y
calcula la respuesta relativa de los analitos a
travs de factores de respuesta, que son
cocientes de las relaciones masa/rea de pico:
% X/ AX
FR
%R / AR
donde X es el analito y R es el compuesto de
referencia
 Calibracin externa

Es el mtodo convencional de realizar una curva

de calibracin con estndares preparados
aparte de la muestra. En CG es de poco uso
debido a la poca reproducibilidad de la
inyeccin.
 Estndar interno

Se agrega en las muestras y los patrones una

cantidad conocida y exactamente igual de un
compuesto no contenido en la muestra, y
todas las reas se normalizan por la del patrn
interno. Con esto se puede usar una curva de
calibracin externa.
 Estndar interno con calibracin externa

Similar al anterior, pero se hacen curvas de

calibracin externa para los analitos y el
estndar interno y se corrigen los resultados
por el estndar interno. Sirve para corregir los
efectos de matriz pero no las diferencias en la
inyeccin.
 Agregado patrn

Se corre la muestra tal cual y la misma muestra

con agregados crecientes y conocidos del/los
analitos a determinar. Sirve para corregir
efectos de matriz, no de inyeccin.