PRACTICA N01.

DETERMINACION DE BIOMASA: RECUENTO MICROSCPICO EN CMARA DE

NEUBAUER.

I. OBJETIVOS

Comprender el uso y lectura por cmara de Neubauer.

Determinar la concentracin de microorganismos utilizando la cmara de Neubauer
en el microscopio.
Determinar la desviacin estndar, promedio y coeficiente de variacin de la
muestra a analizar.

II. FUNDAMENTO TERICO

Una suspensin celular se caracteriza por presentar un nmero de partculas

microscpicas dispersas en un fluido. Habitualmente ser necesario determinar tanto la
densidad de las clulas en la suspensin como el porcentaje de stas que son viables.
Para determinar la densidad de las clulas se emplean diferentes tcnicas, desde la
relativamente simple cmara de contaje celular de la que existen numerosas variantes,
entre ellas la que empleamos (cmara de Neubauer), hasta equipos automticos de
contaje celular como el "Cell Coulter" de la empresa Beckman-Coulter.

III. MARCO TEORICO

A. CMARA DE NEUBAUER

La cmara de Neubauer es una cmara de contaje adaptada al microscopio de campo

claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresin en el
centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrcula
como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separacin entre
dos lneas consecutivas de 0.25 mm. As pues el rea sombreada y marcada L
corresponde a 1 milmetro cuadrado. La depresin central del cubreobjetos est
hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un
cubreobjetos ste dista de la superficie marcada 0.1 milmetro, y el volumen
comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milmetro cbico, es decir
0.1 microlitro.

Para contar las clulas de un cultivo lquido, se agrega una gota de este entre estas dos
placas y observar al microscopio ptico la cantidad de clulas presentes en un campo
determinado de las grilla.
 Figura 1. Cmara de Neubauer.

Figura 2. Manipulacin de la cmara de Neubauer.

 B. CONTEO EN CAMARA DE NUEBAUER

1. Colocar el cubreobjetos sobre el portaobjetos de la cmara e introducir entre ambos

la muestra celular previamente preparada. Debe evitarse que la muestra rebalse, si
esto sucede las clulas a contar tambin se perdern.

2. La velocidad de llenado de la cmara debe ser homognea, evitando as una mala

distribucin de las clulas en el preparado que traer aparejado errores en el
recuento.

3. La muestra no debe secarse, por lo tanto es recomendable guardar la cmara de

Neubauer cargada dentro de una cmara hmeda para que sedimenten las clulas.

4. Luego se coloca la cmara en un microscopio ptico y se procede al conteo,

eligiendo para ello los cuadrados apropiados.

5. Se elegir un criterio para definir qu clulas se cuentan y cules no, cuando las
mismas quedan sobre uno de los bordes del cuadrado.

6. Una vez contadas las clulas se calcula la concentracin en la muestra original,

considerando: la dilucin de la muestra hecha para el sembrado, la cantidad de
cuadrados considerados, el nmero de clulas contadas y el volumen de muestra
debajo de cada cuadrado.

Ejemplo de clculo en cmara de Neubauer

Figura 3. Conteo realizado en el retculo de Thoma.

A. Se obtendr el promedio de clulas. X =10 clulas

B. Las dimensiones del retculo ser: 0.2x0.2x0.1.

10 (0.20.20.1)3
1000 3
 10000
=
(0.2)(0.2)(0.1)
= 2.50 + 6 /

Frmula para reducir el clculo:

=

0.2 0.2 0.13 103
3

Donde:
D= dilucin de la muestra

IV. MATERIALES Y METODOLOGIA

A. MATERIALES
Pipetas Pasteur.
Lamina cubre objeto.
Tubos de ensayos.
Gradilla.
Agua estril.
Levadura L-51. (Saccharomyces cerevisiae).

B. EQUIPOS
Microscopio.
Cmara de Neubauer.

C. METODOLOGIA
1. Colocar 2 ml de agua estril ms la muestra de levadura L-51. Luego se realizar
diluciones 10-1 y 10-2.

M 10-1 10-2
O

Muestra 1 ml de MO. + 1 ml de 10-1. +

Original 9ml de agua 9ml de agua
Original. estril estril
Figura 4. Diluciones para conteo en cmara de Neubauer.
2. Colocar la lmina cubreobjetos sobre la zona central de la Cmara de Neubauer.

3. Con una jeringa o micropipeta tomar una determinada cantidad de la muestra 10 -1 y

colocar en el borde del cubreobjetos de manera que el lquido entre por capilaridad sin
que se formen burbujas en la cmara.

4. Llevar la cmara al microscopio y con el objetivo 10x localizar en el campo visual el

cuadrante central, enfocar de tal forma que se observen ntidamente los cuadrantes y
luego se pasa al objetivo 40x.

5. El recuento se determina sumando el total de clulas presente en los 25 cuadrantes

centrales de la cmara y calculando su promedio (X). El nmero promedio de clulas
nos ayudara a determinar la concentracin de clulas en suspensin por mililitro de la
muestra original.

V. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

Aquihuatl, M y Prez, M. 2004. Manual de prcticas de laboratorio de microbiologa

general. Primera edicin. Editorial de la Universidad Autnoma Metropolitana-
Iztapalapa. Mxico

Toro, R. 2005. Manual para la introduccin al laboratorio de microbiologa. Primera

Edicin. Editorial de la Universidad de Caldas. Colombia.

lvarez, R.2007. Estadstica aplicada a las ciencias de la salud. Editorial Diaz de Santos.
Espaa

Exebio, C. 2007.Curso de estadstica. Definiciones bsicas.

[Consultado el 18 de Abril del 2012]. Disponible en:
http://es.scribd.com/doc/6692651/DEFINICIONES-BASICAS

Estrada, N. 2000. La biodiversidad en el mejoramiento gentico de la papa. Centro de

informacin para el desarrollo- CID. Plural Editores. Bolivia

Fuentes, X; Castieiras, M y Queralt, J. 1998. Bioqumica Clnica y Patologa molecular.

Segunda Edicin. Editorial Revert. Espaa
 PRACTICA N02. DETERMINACIN DE BIOMASA: PESO SECO Y PESO HUMEDO.

I. OBJETIVOS

Determinar la biomasa de una solucin celular desconocida en peso seco y en peso

hmedo.

II. FUNDAMENTO TEORICO

La determinacin de la biomasa es una de las variables ms importantes de un

bioproceso ya que su determinacin nos lleva a la comprensin de la eficiencia del
mismo. Se trata de una variable clave para establecer las tasas de produccin, de
consumo de nutrientes y el clculo de los balances de masa de cualquier proceso
biolgico. Los mtodos clsicos de determinacin de biomasa son mtodos directos que
se basan en el nmero de clulas o en el peso celular. Los mtodos de enumeracin
celular son mtodos de observacin, basados en propiedades fsicas o en la actividad
biolgica. Actualmente hay un gran inters en mtodos alternativos de determinacin
de la biomasa. Estos mtodos son indirectos y estiman algn componente celular o
alguna actividad metablica especfica.

La medida de masa celular se realiza mediante mtodos directos o indirectos. En los

primeros se requiere preparaciones limpias, sin partculas extraas y pueden realizarse
por:

A. Determinacin del peso hmedo, en la cual se tara un tubo de centrifuga; se

centrfuga el cultivo y se elimina el sobre nadante. Se determina el peso del
sedimento.
B. Determinacin de peso en seco, similar al anterior, pero el sedimento se seca
antes de ser pesado (105C aproximadamente) hasta tener un peso constante.
Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso
hmedo.
C. Determinacin de nitrgeno total, mediante la tcnica de kjeldahl.
D. Determinacin de un componente caracterstico como peptidoglucano, ADN,
ARN protenas, ATP, clorofilas en organismo fotosintcos, etc.

Los mtodos indirectos se pueden clasificar en los siguientes:

A. Medida de consumo de nutrientes o de produccin de algn metabolito por

unidad de tiempo como consumo de oxigeno (QO2) determinado por el
respirmetro de Warburg. Produccin de cidos.
B. Mtodos turbidimtricos (pticos), que son muy usados en la prctica cotidiana
del laboratorio.

La base comn de estos mtodos consiste en la medicin de la cantidad de la luz

dispersada o transmitida a travs de un cultivo. Las suspensiones dispersan la luz, al igual
 que cualquier partcula pequea suspendida en el agua (efecto Tyndall). La dispersin
de la luz, dentro de ciertos lmites, proporcional a la masa de cultivo.

III. MARCO TEORICO

A. Peso hmedo: Se obtiene a partir de una muestra en suspensin que es pesada luego
de la separacin de las clulas por filtracin o centrifugacin. Es una tcnica til para
grandes volmenes de muestra.
La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y
contribuye al peso total de la masa. La cantidad de lquido retenida puede ser
importante, por ejemplo, un pellet de clulas bacterianas muy empaquetadas puede
contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la
forma y deformacin celular. Para corregir el peso hmedo se determina la cantidad de
lquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugacin, para
ello se utilizan soluciones de polmeros no inicos (como el Dextran) que pueden
ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas

B. Peso seco: El peso seco (contenido de slidos) de las clulas bacterianas que se
encuentran en una suspensin se obtiene por el secado de un volumen en un horno a
105C hasta peso constante. Esta tcnica es til para grandes volmenes de muestra,
debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran
nmero de bacterias.

La desventaja de este mtodo es que componentes voltiles de la clula pueden

perderse por el secado y puede existir alguna degradacin. Tambin la muestra seca
puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una
humedad relativa alta.

IV. MATERIALES Y METODOLOGIA

A. MATERIALES
Pipetas Pasteur.
Lamina cubre objeto.
Tubos de ensayos.
Gradilla.
Agua estril.
Levadura L-51. (Saccharomyces cerevisiae).

B. EQUIPOS
Microscopio.
Cmara de Neubauer.
Centrifuga.
C. METODOLOGIA
 En 200 ml de agua destilada se colocar muestra de levadura
Realizar 3 repeticiones en tubos de ensayos previamente pesados y rotulados.
Colocar 5 ml de muestra original.

MUESTRA
ORIGINAL

5 ml de
muestra
original

4000 rpm
CENTRIFUGADO 10 min

Peso de tubo +
ESCURRIDO muestra hmeda

105 C x 3 horas.
ESTUFA Peso de tubo +
muestra seca

A. Determinacin de peso hmedo

. ( + ) ( )
( )=

B. Determinacin de peso seco

. ( + ) ( )
( )=

 Tabla 1. Determinacin de peso hmedo y seco para la muestra original.

Peso de tubo Peso hmedo g m.h./ml Peso seco g m.s./ml

1
2
3

V. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

Aquihuatl, M y Prez, M. 2004. Manual de prcticas de laboratorio de microbiologa

general. Primera edicin. Editorial de la Universidad Autnoma Metropolitana-
Iztapalapa. Mxico

Silva, M y Garca, M. 2006. Tcnico especialista en laboratorio de atencin primaria.

Primera Edicin. Editorial MAD, S.L. instituto cataln de salud. Espaa.

Harris, D. 2007. Anlisis qumico cuantitativo. Tercera edicin. Editorial Reverte. Espaa

Quesada, S. 2007. Manual de experimentos de laboratorio para Bioqumica. Editorial de

la Universidad Estatal a Distancia. San Jose de Costa Rica.

Silva, C; Garca, J; Del Castillo, L; Ania, J y Gmez, D. 2006.Tcnicos especialistas de

laboratorio del servicio Vasco de Salud- Osakidetza. Segunda edicin. Editorial MAD.
Espaa

Tresguerres, J. 2003. Biotecnologa Aplicada a la Medicina. Editorial Daz de Santos.

Espaa.

Villegas, W; Acereto, P y Vargas, M. 2006. Anlisis ultravioleta visible. Universidad

autnoma de Yucatn. Mxico.

Stanier, R; Ingraham, J; Wheelis, M y Painter, P. 1992. Microbiologa. Segunda Edicin.

Editorial Reverte.
 PRACTICA N03. DETERMINACION DE BIOMASA: TURBIDIMETRIA.

I. OBJETIVOS

Determinar la biomasa de una solucin celular desconocida en peso seco y peso

hmedo.

II. FUNDAMENTO TEORICO

La turbidimetra es un mtodo de masa celular indirecto se fundamenta en la medicin de

la cantidad de luz transmitida o dispersada a travs de cultivos bacterianos. Las dispersiones
bacterianas dispersan la luz como cualquier solucin. La dispersin de la luz es proporcional
a la masa de cultivo. Son mtodos utilizados frecuentemente en los laboratorios.

Existen dos mtodos principales:

1. Espectrofotmetro: Mide la densidad ptica (D. O.), esto quiere decir la

absorbancia(A). Siempre se efecta una curva de crecimiento para poder medir el
valor de A con la masa bacteriana.

IMPORTANTE: La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el

tamao de la partcula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la tcnica
aumenta pues a longitudes de onda cortas.

2. Nefelmetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor est

situado en ngulo recto respecto de la direccin de la luz incidente, y lo que se mide
es pues, la luz dispersada directamente por la preparacin. Posee mayor
sensibilidad que el espectrofotmetro.

III. MATERIALES Y METODOS

A. MATERIALES
Clulas en suspensin (muestra orginal)
Pipetas Pasteur.
Lamina cubre objeto.
8 Tubos de ensayos.
Gradilla.
Agua destilada.
Levadura L-51. (Saccharomyces cerevisiae).
Mechero.
Pipetas de 5 ml.
B. EQUIPOS
Microscopio.
Cmara de Neubauer.
Espectrofotmetro
C. METODOLOGIA

MUESTRA ORIGINAL

Muestra
4/5 3/5 2/5 1/10 1/30 1/50 1/100
original

LECTURA DE ABSORVANCIA A 550 nm.

Se evaluara la absorbancia y se hallara recuento del nmero de clulas por mililitro para
cada dilucin, posteriormente se hallar el porcentaje de error para el clculo del error.

CONSTRUCCIN DE CURVA DE CALIBRACIN

 Construccion de curva de calibracion
45
40 y = Ax
R = 1
35
30
Absorvancia

A: factor de
25 conversion
20
15
10 construccionde curva de
calibracion
5
Lineal (construccionde
0
curva de calibracion)
0 10 20 30 40 50
clulas/ml

Figura 1. Determinacin del factor de correccin para cada caso.

Clculo del error de los factores de conversin

% Error
cel / ml CN cel / ml F .C x100
cel / ml CN

Tabla 1. Determinacin de concentracin de clulas y absorbancia.

MUESTRA DILUCION CONCENTRACION ABSORBANCIA

(clulas/ml)
(nm)

M.O. 1

1 4/5

2 3/5

3 2/5

4 1/10

5 1/30

6 1/50

7 1/100
IV. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

Silva, M y Garca, M. 2006. Tcnico especialista en laboratorio de atencin primaria. Primera

Edicin. Editorial MAD, S.L. instituto cataln de salud. Espaa.

Harris, D. 2007. Anlisis qumico cuantitativo. Tercera edicin. Editorial Reverte. Espaa

Silva, C; Garca, J; Del Castillo, L; Ania, J y Gomez, D. 2006.Tcnicos especialisas de

laboratorio del servicion Vasco de Salud- Osakidetza. Segunda edicin. Editorial MAD.
Espaa

Tresguerres, J. 2003. Biotecnologa Aplicada a la Medicina. Editorial Daz de Santos. Espaa.

Villegas, W; Acereto, P y Vargas, M. 2006. Anlisis ultravioleta visible. Universidad

autnoma de Yucatn. Mxico.

Stanier, R; Ingraham, J; Wheelis, M y Painter, P. 1992. Microbiologa. Segunda Edicion.

Editorial Reverte.