Captulo 11

Los biosensores para el control de bioprocesos

Ursula Bilitewski
11.1 INTRODUCCIN
El rea de aplicacin tradicional de los productos biotecnolgicos es el alimento
la industria, que sigue siendo un mercado importante con la produccin de
cerveza y
vino y tambin los aditivos alimentarios. Sin embargo, las aplicaciones mdicas
estn recibiendo
atencin cada vez mayor, por ejemplo, antibiticos, vacunas, protenas
teraputicas
o protenas utilizadas en ensayos de diagnstico se producen cada vez ms por
(recombinacin
Nant) microorganismos. Los organismos productores ms importantes son las
bacterias,
tales como Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum o
Streptomyces spec., Levaduras, tales como Saccharomyces cerevisiae y Pichia
pastoris, hongos, tales como Aspergillus nidulans o Penicillium notatum y
lneas de clulas animales, tales como clulas de hibridoma para la produccin de
anticuerpos monoclonales
anticuerpos, ovario de hmster chino (CHO) y rin de cra de hmster (BHK)
Clulas. Adems, las clulas o sistemas de clulas se desarrollan como medio
teraputico,
por ejemplo, clulas, clulas dendrticas o tejidos artificiales u rganos basados
en el vstago
cultivo de hepatocitos, queratinocitos, etc. Cada uno de estos organismos tiene su
requisitos propios de la composicin del medio y el cultivo
estrategias para el crecimiento y la productividad [1,2] ptima. El desarrollo de
organismos recombinantes, adems, requiere estrategias especficas para la
gentica
modificacin, como las vas metablicas, las vas de secrecin de las protenas o
promotores adecuados para la induccin de la biosntesis son propiedades
especficas
de un organismo [3-10].
Las estrategias empricas aplicadas originalmente para la optimizacin de
procesos resultaron ser de un valor limitado en el largo plazo y para
productos de alto valor econmico, tales como protenas teraputicas, y el
nmero
de sistemas de vigilancia y estrategias de control aumentado continuamente. los
llamado "control de bajo nivel", basada en la temperatura, la presin, el pH y la
pO
2
[11]
E-mail: ubi@gbf.de (U. Bilitewski).
Integral de Qumica Analtica XLIV
L. Gorton (editor)
q 2005 Elsevier BV Todos los derechos reservados.
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sigue siendo la estrategia predominante en los procesos de produccin de rutina,
como adecuados en
Existen sensores in situ durante un largo tiempo. La determinacin en lnea de los
nutrientes,
productos metablicos, protenas recombinantes secretadas pueden ser realizadas
por HPLC o
GC [12,13]. Sin embargo, debido a la complejidad de los instrumentos y
requisitos de pureza de la muestra y el tiempo de anlisis, estos dispositivos son a
menudo
restringido a los anlisis fuera de lnea, mientras que el anlisis en lnea de
componentes especficos
se realiza mediante sistemas basados en los principios de anlisis o biosensores
bioqumicos. Ellos
comprender un receptor bioqumico adecuado, generalmente una enzima o un
anticuerpo, en
forma inmovilizada, y el procedimiento de reaccin bioqumica en presencia de
el analito se controla mediante un transductor adecuado (un amperomtrica o
electrodo potenciomtrico, un termistor, fluormetro, fotmetro, etc.). Como estos
sistemas no son esterilizables debido a la sensibilidad al calor de la bioqumica
receptor, tienen que ser acoplado al proceso a travs de interfaces adecuadas
mantenimiento de la integridad estril del proceso. Varios intentos para disear
en
sondas in situ no dieron lugar a dispositivos de rutina, y en la actualidad o de
flujo continuo
anlisis de flujo de inyeccin de dispositivos (FIA) son los ms populares. Ellos
estn acoplados a
el proceso a travs de sistemas de toma de muestras que permite la eliminacin
automtica de muestras
sin afectar a la integridad de la esterilidad del proceso [13-17].
La aplicacin de estos sistemas, en particular para la determinacin de
glucosa, y en un grado menor de lactato y metanol, se convierte
cada vez ms habitual, ya que despus de un largo tiempo de las aplicaciones de
investigacin adecuados
sistemas de muestreo y monitoreo estn disponibles comercialmente (por
ejemplo,
www.ysi.com; www.trace.de; www.flownamics.com). Esto condujo a una mayor
estimulacin del campo y en consecuencia el nmero de informes es cada vez
mayor
que describe no slo la vigilancia sino tambin el control de los cultivos
mediante el
concentracin de la fuente de carbono como variable de [12,18-20]. En aos
recientes
apareci un nmero de libros y artculos de revisin que describe la declaracin
de la tcnica de estos sistemas [11,14,15,17,21], y por lo tanto no sern
considerado en detalle en esta contribucin. Las excepciones son la
determinacin
de "nuevas" fuentes de carbono, los enfoques para la mejora de la estabilidad
y la sensibilidad de los sensores, nuevos dispositivos de muestreo o la aplicacin
de la
sistema de control de la bioprocesos.
Hoy en da, existen requisitos adicionales sobre el control de bioprocesos
sistemas. Estos son, en parte debido a las regulaciones gubernamentales sobre la
produccin
de productos farmacuticos, que requieren procesos validados de entrega, por
ejemplo, una
rendimiento constante de las clulas, el producto y la calidad del producto. Este
ltimo no incluye
slo la calidad del producto en s, tales como la actividad biolgica de una
protena teraputica, sino tambin de su pureza, es decir, la presencia o ausencia
de
compuestos que interfieren [22,23].
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Adems, las nuevas estrategias estn en desarrollo para la optimizacin de
bioprocesos, en particular, para la produccin recombinante de teraputica
protenas. Se reconoce cada vez que el xito de un proceso biotecnolgico, es
decir, el
rendimiento del producto deseado, no slo est influenciada por la eleccin de la
que produce la cepa o clula de la lnea, del nmero de copias del gen (plsmido
nmero de copias)
o el promotor en una cepa recombinante [6,24] o la induccin, la fermentacin
y estrategia de alimentacin [25,26], pero tambin por el uso eficiente de la
metablico
potencial del husped. La produccin de una protena heterloga puede ejercer tal
carga significativa sobre el metabolismo celular que son funciones vitales
alteracin de [27-29]. Es por ello que se evalan nuevos parmetros que deberan
dar informacin fisiolgicamente relevante, no slo se deriva indirectamente de
parmetros fuera de las clulas [27,30-33], sino tambin directamente de las
clulas y
las variables internas. El estado fisiolgico de las clulas se juzga
tradicionalmente
de varios parmetros: investigaciones microscpicas muestran la morfologa de
las clulas
y puede dar primera informacin sobre la viabilidad y el estado metablico de las
clulas.
Una imagen ms detallada, sin embargo, se obtiene a partir del anlisis
qumico. los
aplicacin de compuestos marcados isotpicamente como sustratos y el anlisis
de la distribucin de estos istopos en los intermediarios metablicos y productos
[34-39], la determinacin de actividades enzimticas en diferentes extractos de
clulas, la
anlisis de la composicin de protena intracelular [28,37,40,41] de la energa
cargar y de precursores o intermedios [9,42-44] dar una imagen importantes
de la existencia y la eficiencia de las vas metablicas [45]. Observado
dentro de las limitaciones de un camino que conduce directamente al producto
deseado se
se utiliza para optimizar la cepa an ms por modificaciones genticas apropiadas
(ingeniera metablica) [30,46-48]. Sin embargo, a menudo estas modificaciones
hicieron
no conduce al xito esperado [46]. Esto es al menos en parte debido a la
conexiones de diferentes vas a travs de sustratos comunes, productos
intermedios,
precursores o compuestos que regulan requieren un anlisis ms complejo de la
Clulas. Es por ello que en la actualidad, los nuevos mtodos para el anlisis de
las clulas estn bajo
investigacin [45]. stos van desde la evaluacin de nuevos sistemas en lnea
indicando la fisiologa celular a travs de los parmetros clave para el anlisis
fuera de lnea de
la fisiologa celular global. Entre estos nuevos enfoques son la aplicacin de
en lnea microscopa [49,50], en el infrarrojo cercano (NIR) [51,52], nuclear
resonancia magntica (RMN) [21,36], el anlisis de HPLC [8,42] y
sistemas de sensores enzimticos para compuestos clave del metabolismo celular,
gel
electroforesis para el anlisis de protenas [23,28,40] y chips de ADN para el gen
expresin (ARNm) de anlisis. Microscpicas y espectroscpicas mtodos son
atractivo, debido a que son aplicables como mtodos in vivo que permiten la
investigacin de las clulas sin la necesidad de muestreo o la ruptura celular.
Sin embargo, hasta ahora la microscopa y espectroscopa NIR eran slo
ocasionalmente
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Higo. 11.1. Posicin de los sistemas de anlisis bioqumicos para el control de
bioprocesos.
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utilizado para el seguimiento de bioprocesos en lnea [53]. Otros mtodos
espectroscpicos (en
en particular RMN) todava necesitan ms mejoras con respecto a la sensibilidad
y procesamiento de la seal antes de ser aplicables como mtodos de rutina
[34,51].
Teniendo en cuenta las tendencias mencionadas anteriormente en el anlisis de la
bioprocesos
siguiente artculo presentar y discutir
(a) los enfoques para la vigilancia y el control de sustrato y producto en lnea
concentraciones con electrodos enzimticos,
(b) las contribuciones de biosensores para la determinacin de la calidad del
producto,
(c) posibilidades de cuantificacin de ADN de plsmido,
(d) enzimas basado el anlisis en lnea de compuestos indicadores para la
fisiologa celular
o el estrs metablico,
(e) las matrices para el anlisis de la expresin gnica.
Una visin general de los diferentes aspectos cubiertos por estos temas se da en
Higo. 11.1.
11.2 Seguimiento y control del sustrato y el producto
Concentraciones con electrodos enzimticos
La fuente de carbono ms importante en ingeniera bioqumica es la glucosa, ya
que
se utiliza en la mayora de las fermentaciones microbianas, as como en cultivos
de clulas animales.
Por lo tanto, los sistemas de sensores de glucosa se aplican a la vigilancia de
bioprocesos para casi
20 aos [14,15] y alcanz una fiabilidad que permiti su aplicacin incluso
para el control del proceso (vase la seccin 11.2.5). Sin embargo, en particular,
algunos microbiana
procesos requieren sustratos alternativos. Ejemplos son fermentaciones de
cepas recombinantes de la levadura P. pastoris que se cultivan inicialmente en
glicerol y durante la fase de produccin en metanol [19,26,53,54]. Glicerol
es tambin un subproducto de la fermentacin alcohlica de levaduras, por
ejemplo, durante el
la produccin de vino. Combustible de etanol es el producto de la fermentacin
de la levadura con el
medio de fermentacin que contiene azcares, tales como glucosa, xilosa y
galactosa
resultante de la hidrlisis de la lignocelulosa. Es por ello que basan enzima
sistemas se han desarrollado no slo para el etanol [55,56], sino tambin para el
glicerol [57],
y varios monosacridos [56] (Seccin 11.2.1). De gran preocupacin para
sensores para ser aplicadas a la vigilancia de bioprocesos es la estabilidad de los
sensores
durante la aplicacin (Seccin 11.2.2) y la especificidad para el objetivo
analitos (Seccin 11.2.3). Este ltimo se puede mejorar, por ejemplo, por
la combinacin con cromatografa o con dispositivos de muestreo adecuados
(Seccin 11.2.4).
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Los biosensores para el control de bioprocesos

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11.2.1 Enzima electrodos para alcoholes y sacridos
El etanol se determin a travs de la alcohol oxidasa aislada, ya sea a partir de P.
pastoris
[55] o Hansenula polymorpha [56] e inmovilizada en perlas de vidrio atrapados
en un reactor de enzima o adsorbido en polvo de grafito de una pasta de carbono
electrodo. Es bien conocido por los sistemas de sensores basados en la oxidasa de
que la
la determinacin del analito se puede basar en la determinacin de hidrgeno
perxido formado a partir de la reaccin de oxidasa. Una vez ms, varios
enfoques eran
utilizado: el perxido de hidrgeno se oxid directamente a potenciales de
TH700 mV usando
electrodos de platino hechas, por ejemplo, de la tecnologa de impresin por
serigrafa [55]
o se redujo en un enfoque bi-enzimtica por la peroxidasa de rbano picante que
fue re-reducido mediante transferencia directa de electrones desde un electrodo
de pasta de carbono [56]
o a travs de mediadores.
Un enfoque similar se utiliza para la deteccin de monosacridos [56]:
piranosa oxidasa entreg un sensor a base de oxidasa adecuados con el hidrgeno
perxido se determina de nuevo a travs de la transferencia directa de electrones
desde la
electrodo de pasta de carbono a la enzima peroxidasa de rbano. En todos bi-
enzima
sistemas, tanto las enzimas se atrapado dentro de la pasta de carbono. Estas
electrodos fueron utilizados como detectores en un sistema de cromatografa de
lquidos permitiendo
la determinacin simultnea no slo de varios hidratos de carbono, sino tambin
de
etanol dentro de aproximadamente 20 minutos. La produccin de etanol y
carbohidratos
el consumo se controlaron en lnea durante una fermentacin de P. stipitis para
16 h (vase tambin la seccin 11.2.3).
Para la determinacin de glicerol no oxidasa adecuado es fcilmente disponible.
Es por ello que se utiliz glicerol quinasa para convertir glicerol en glicerol-3-
fosfato, que se oxida en la siguiente por la oxidasa correspondiente
a glycerone-3-fosfato y perxido de hidrgeno [57] (Ecs. (11.1) y (11.2)).
Glycerokinase:
El glicerol ATP! glicerol-3-fosfato de ADP
D11: 1 Tes
El glicerol-3-fosfato oxidasa:
El glicerol-3-fosfato O
2
H
2
O! Gycerone-3-fosfato H
2
O
2
D11: 2
Para obtener la mxima sensibilidad y la estabilidad del sistema de ambas
enzimas tenan que
ser utilizado en diferentes compartimentos y, por lo tanto, la glicerol quinasa se
inmovilizada en perlas de vidrio y se mantiene en un reactor mientras que la
enzima
glicerol-3-fosfato oxidasa se inmoviliz sobre una membrana pre-activado
y se coloca directamente en frente del electrodo. El co-sustrato de la quinasa
de reaccin, ATP, se aadi junto con Mg
2
a la memoria intermedia de trabajo.
El sistema se aplic a la vigilancia fuera de lnea de produccin de glicerol
durante
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la fermentacin de S. cerevisiae en el mosto de la uva Trebbiano italianos.
Aplicaciones a cultivos de P. pastoris sin embargo, no se mencionan.
11.2.2 Estabilidad de sensores enzimticos
La estabilidad de los sensores de la enzima depende de la estabilidad de la
particular,
estructura de la enzima y puede ser influenciada por las condiciones elegidas
durante
inmovilizacin y almacenamiento [58]. Ya la inmovilizacin de la protena
puede mejorar su estabilidad en comparacin con la solucin de enzima
correspondiente,
debido a que la estructura de la enzima pierde flexibilidad debido al
acoplamiento a un slido
apoyan y por lo tanto, los movimientos de los dominios de protenas que
conducen a la desnaturalizacin son
disminuye y la estabilidad se aumenta [59,60]. Adems, la cantidad de
enzima inmovilizada influye en la altura de la seal y la estabilidad [61,62].
Comenzando con bajas cantidades de enzima inmovilizada, por ejemplo, con
menos de
una cobertura de monocapa de electrodo, las seales se incrementar con el
cantidad de la enzima, ya que la tasa de rotacin enzimtica limita el sensor
seales (rgimen de control cintico). Cuando una cierta enzima de carga en el
se consigue electrodo, molculas de sustrato que llegan a la superficie del
electrodo se
convertir instantneamente y la seal est limitada por la velocidad de difusin
de
el sustrato a la superficie del electrodo (rgimen de difusin controlada). A
medida que la
actividad de la enzima no limita la seal, se puede disminuir debido a la
desnaturalizacin
sin afectar a la altura de la seal y, por tanto, los sensores tienen un alto aparente
estabilidad. Por lo tanto, ya la eleccin de los mtodos de inmovilizacin que
permite
aumentar la cantidad de enzima, tal como el atrapamiento en pasta de carbn, en
membranas o en reactores de enzimas, pueden mejorar la estabilidad del sensor.
Por otra parte, se sabe que ciertos aditivos tienen un efecto beneficioso sobre la
estabilidad de la enzima [60], en algunos casos esto se combina con una mejora
de
la sensibilidad y lmites de deteccin ms bajos. Azcares, sales y polioles son
conocido para estabilizar protenas en soluciones o durante la liofilizacin
[63,64]. por
desarrollo de sensores, en particular, los efectos de los aditivos polimricos eran
investigado, ya que podran ser atrapados junto con la enzima en
membranas o pastas. Se observ que los polielectrolitos, tales como
polietilenimina, dietilaminoetilo (DEAE) dextrano, polilisina y
Gafquat (copolmero de vinilpirrolidona y dimethylaminoethylmethacry-
tarde) mejorar la estabilidad [65] y tambin la sensibilidad [66,67] de sensores,
justo
protenas como adicionales, por ejemplo, albmina de suero bovino (BSA) o
lisozima
[68] y alcoholes de azcar, principalmente lactitol. La razn para el efecto
estabilizador es
todava no est completamente entendido y para cada enzima particular, la
ptima
mezcla de aditivos tiene que ser encontrado [56,66,69]. A menudo se supone que
la
polmeros interactan con la protena a travs electrosttica o hidrfobo
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interacciones [70] formando una especie de jaula y por lo tanto lo protege de
despliegue
y la desnaturalizacin. Sin embargo, este modelo simple no puede explicar la
observada
dependencias en las concentraciones de los aditivos, la necesidad de una
especfica
optimizacin para cada protena y la observacin de que en algunos casos
ternarias
mezclas son beneficiosos. Adems, el modelado por ordenador de la interaccin
de
peroxidasa de rbano picante con los monmeros de Gafquat, DEAE-dextrano y
polietilenimina mostr sitios de unin especficos slo para polietilenimina [71],
que no fue notificado a tener efectos significativos sobre la estabilizacin de la
protena.
Sin embargo, la adicin de estos compuestos a la matriz de inmovilizacin
con frecuencia, mejora la estabilidad del sensor resultante de manera
significativa, de modo que
son aplicables a la supervisin en lnea de los cultivos, incluso durante perodos
de varios
semanas [20,69]. Incluso si no es posible incluir estos aditivos en la
inmovilizacin Matriz de su adicin a la solucin de almacenamiento result ser
beneficioso, que se extiende la vida til de la glicerol-3-fosfato oxidasa de 6 a
30 das [57].
11.2.3 Especificidad de sensores enzimticos
La especificidad de un electrodo de enzima se obtiene principalmente mediante la
especificidad de la
enzima. Las enzimas tales como el cido amino oxidasa [72], alcohol oxidasa
[73] o
piranosa oxidasa [56] a catalizar la oxidacin de varios sustratos y, por lo tanto,
los sistemas de sensores correspondientes tambin responden a una serie de
compuestos. Esta
se utiliz para el desarrollo de un sensor para la deteccin del total
cantidad de protena en una muestra [74]. Una proteasa se utiliz para la
degradacin de
las protenas a aminocidos, que podran determinarse posteriormente por la
aminocido oxidasa. Sin embargo, por lo general una baja especificidad de una
enzima evita
la determinacin especfica de analitos, a menos que se acopla con la separacin
de compuestos. Por lo tanto, Lidn et al. [56] acoplado el sensor de
monosacridos,
que se basa en piranosa oxidasa, a cromatografa lquida. esto permiti
la determinacin especfica simultnea de glucosa, galactosa y xilosa, ya que
todos
los tres compuestos fueron separados en la columna cromatogrfica y
fueron detectados despus de la columna por el electrodo modificado piranosa
oxidasa.
Los tiempos de anlisis de aproximadamente 20 minutos permiti la
determinacin en lnea
de estos compuestos durante la fermentacin de P. stipitis.
La aplicacin de sistemas cromatogrficos o electroforticos conduce a
la separacin no slo de varios sustratos, sino tambin de la muestra
constituyentes, lo que podra influir en la actividad de la enzima o dar lugar a
las seales de la enzima de forma independiente [75]. Un enfoque alternativo
para eliminar
estas interferencias es la restriccin de la conexin de compuestos que interfieren
a la enzima y el transductor. Esto se puede lograr mediante la adaptacin de la
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permeabilidad de la membrana de la enzima a travs de una porosidad adecuada
o va
propiedades hidroflicas e hidrofbicas adecuadas. Estos parmetros pueden
ser cambiado cambiando la composicin de la mezcla pre-polimrica que
se utiliza para la formacin de la membrana de la enzima [76]. Alternativamente,
adicional
Las membranas pueden ser utilizados, lo que podra cubrir ya sea directamente
con el electrodo,
tales como membranas Nafion [77], o insertarse en el sistema de flujo como
mdulos de membrana [55,69] o incluso como dispositivos de muestreo
[56,78]. Membrana
mdulos, que se insertan en un sistema de flujo, utilizan los principios de
dilisis [55,66,69,73] o pervaporacin [79]. Estos mdulos comprenden el
canal de donante a travs del cual se bombea la muestra y el aceptor
canal que contiene slo el buffer. Tanto los canales estn separados por una
membrana a travs de la que el analito tiene que difundirse (Fig.
11.2). Dependiente
en las propiedades del material de la membrana y de membrana, tales como el
grosor
y tamao de los poros, la permeabilidad para los compuestos es influenciada
[73]. As,
compuestos de interferencia estn separados por el uso de bro hidrfobo
branas, que permiten la permeacin de compuestos voltiles tales como
solamente
alcoholes [55,73]. Esta separacin de compuestos voltiles y no voltiles es
siendo amplificado en los mdulos de pervaporacin, ya que tienen un espacio de
aire entre
corriente de los donantes y de la membrana, que slo se puede pasar por la
muestra voltil
constituyentes. Mdulos de membrana siempre influyen en el intervalo lineal de
la
sistema, ya que slo una fraccin de la cantidad total de analito impregna el
la membrana y de los intervalos de anlisis generalmente se desplazan a mayor
concentraciones. Por lo tanto, la introduccin de mdulos de membrana es una
media
Higo. 11.2. Mdulo de membrana como interfaz entre los sistemas de
fermentacin y el detector.
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Los biosensores para el control de bioprocesos

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para reducir la influencia de posibles interferentes y para ajustar el lineal
gama del sistema para el intervalo de concentracin del analito en el verdadero
muestras evitando cualquier dilucin adicional. Mdulos adecuadamente
diseadas
se podra utilizar como interfaces con el medio de bioprocesos, es decir, como el
muestreo
mdulos. Enfoques correspondientes se describen en la Seccin 11.2.4.
11.2.4 Dispositivos de muestreo
Como electrodos de enzimas no se pueden esterilizar, sistemas de muestreo
adecuados son una
tema principal en todas las crticas que se ocupan de la aplicacin de biosensores
para
monitoreo de bioprocesos. Estos sistemas de muestreo mantienen la estril
integridad del bioproceso y permitir al mismo tiempo el acceso continuo
a analitos presentes en el medio. Yellow Springs Instruments ofrece una
sistema, que tira de las muestras directamente de un biorreactor para el anlisis
sistema y elimina la lnea de muestreo despus con una solucin asptica
(www.ysi.com). Ellos sugieren que la combinacin de este sistema con una
mdulo de filtracin para bioprocesos, en el que la prdida de clulas es una
preocupacin.
La aplicacin de membranas como interfaz entre el bioprocesos y la
sistema de anlisis, en general, un sistema de flujo a travs, tal como un FIA-
dispositivo, es
favorecida en la mayora de los enfoques. La fuerza impulsora para el analito que
pase
la membrana es o bien un gradiente de presin, es decir, las muestras se filtran, o
una
gradiente de concentracin, es decir, el analito pasa a la membrana por
difusin. En
los comentarios anteriores, principalmente se describen los mdulos de filtracin,
y algunos son
disponible comercialmente durante varios aos (por ejemplo,
www.applikon.com; www.
flownamics.com; www.trace.com). Sin embargo, la filtracin de medios de
cultivo
a travs de las membranas pueden causar ensuciamiento de la membrana y el
bloqueo de la membrana
debido a las clulas precipitadas. Es por ello que, hoy en da, los mdulos de
difusin son
recibiendo un inters creciente y primeros sistemas tambin estn disponibles
comercialmente
[78]. Las sondas de dilisis estn equipadas con una membrana de conocida
molecular
umbral de peso y perfundidos con un lquido de perfusin, por ejemplo, agua o
tampn. los
analito pasa la membrana impulsado por el gradiente de concentracin y la
permeabilidad de la membrana. Por lo tanto, el volumen total de lquido en el
reactor es
no afectados y las sondas de dilisis tambin se pueden aplicar a los
fermentadores de pequea escala.
Por otra parte, la eficacia de la transferencia a travs de la membrana depende de
la velocidad de flujo del lquido de perfusin y por lo tanto se puede adaptar a la
lineal
gama del sistema de anlisis [78]. Existen mdulos de muestreo adecuados en
diferentes diseos dependiendo de la aplicacin. Para una ms amplia
la discusin se remite al lector al Captulo 12 en los mdulos de microdilisis.
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11.2.5 El control de las concentraciones de sustrato
La fuente de carbono es uno de los componentes del medio ms importantes de
fermentaciones, como su disponibilidad influye en el crecimiento celular, el
metabolismo celular, clula
viabilidad y la productividad. Por lo tanto, un control de su concentracin es
altamente
deseable. Sin embargo, la falta de informacin fiable en tiempo real sobre el
sustrato
concentracin impedido su aplicacin en estrategias de control avanzado.
Hoy en da, la glucosa y los analizadores de metanol junto con el muestreo
adecuado
estrategias se mejoraron en un grado que el control de cultivo a travs de la
concentracin de sustrato es posible.
Ya en 1987, Mizutani et al. [18] se describe el control de la glucosa
concentracin en cultivos fed-batch de S. cerevisiae a dos niveles diferentes
(10 y 0,3 g / l) utilizando un analizador de glucosa, que se acopl al fermentador
el uso de una cermica o un filtro de membrana. Se midieron las concentraciones
de glucosa
a intervalos de 1 min y se controlaron usando un esquema de control on / off para
una
bomba peristltica por la alimentacin de una solucin de glucosa en el
fermentador. La glucosa
concentracin se mantuvo en el valor deseado dentro de 10% para el nivel de
glucosa ms alto
concentracin. El control de la glucosa en el nivel inferior de 0,3 g / l dio lugar a
las concentraciones de glucosa en el intervalo de 0,08 a 0,54 g / l. Para un cultivo
de
M. ruteus, el punto de ajuste para la glucosa fue 2,5 g / l y el intervalo de
variacin se
aproximadamente el 20%, que era probablemente debido a los intervalos de
medicin ms largos
de 7 min.
La influencia de la concentracin de glucosa en la expresin de una
protena recombinante de S. cerevisiae fue investigado por Iijima et al. [80].
Con una estrategia de control de adaptacin y las medidas para cada 5 minutos se
observado una bastante buena el crecimiento celular pero una expresin gnica
reducida cuando el
la concentracin de glucosa era 10 g / l, mientras que la expresin de genes se ha
mejorado
y tasa de crecimiento se redujo a niveles bajos de glucosa de 0,15 g / l. Adecuado
toma de muestras, sistemas de vigilancia y de control estn ahora disponibles
comercialmente
(www.ysi.com).
P. pastoris es otra levadura utilizada con frecuencia para la protena recombinante
produccin. Por lo general, el gen recombinante se encuentra detrs del gen de la
alcohol oxidasa (AOX1), y por lo tanto, la expresin se induce por metanol. en
federacin
cultivos por lotes el organismo se cultiv a alta densidad celular (80 g / l) en
glicerol [19]. En la siguiente fase de glicerol de alimentacin por lotes fue
sustituido por
metanol, la concentracin de los cuales se control a 1 g / l usando un Flow
a travs del dispositivo con un mdulo de membrana de difusin como interfaz
para el proceso de
(www.trace.de).
Debido a su larga duracin (10-60 das) y el alto costo de los medios de
comunicacin,
mantenimiento de la esterilidad es una preocupacin importante en el
seguimiento y el control de
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Los biosensores para el control de bioprocesos

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perfusin cultivos de clulas animales. Por eso analizadores bioqumicos o
FIA-dispositivos estaban conectados al fermentador a travs de mdulos de
filtracin de flujo cruzado
en combinacin con una barrera estril purgado con un agente bactericida
(1 M de NaOH) entre las mediciones de muestras [12,81]. Glucosa casi constante
Se obtuvieron concentraciones en los puntos de ajuste elegido para 42-70 das en
cultivos de cultivos de clulas CHO usando un algoritmo de control PI para el
bomba de perfusin [12,20]. Esto condujo a una viabilidad celular de ms de
90%
durante todo el tiempo de cultivo que ilustra el mantenimiento xito
de condiciones de cultivo estables.
11.3 SISTEMAS DE EVALUACIN BIOSENSOR
DE LA CALIDAD DEL PRODUCTO
Los avances en la tecnologa del ADN recombinante hizo posible la gran escala
la produccin de protenas recombinantes de inters diagnstico o teraputico.
Debido al valor econmico de estas protenas son las estrategias de produccin
eficiente
requiri que se estableci mediante el control no slo la norma
parmetros de cultivos, sino tambin la concentracin de la protena diana.
De este modo, se describen una serie de mtodos para fuera de lnea o en lnea
protenas
determinacin durante bioprocesos que van desde la espectroscopia NIR [82], gel
electroforesis con la inspeccin visual o anlisis de imgenes de la banda de
protena
intensidades [28,54,83] a ELISA tcnicas [26] y FIA- a base de anticuerpos
sistemas de [14,15,17]. Estos mtodos proporcionan informacin cuantitativa
sobre el total
cantidad de la protena diana con diferentes grados de precisin.
Sin embargo, en particular, para aplicaciones mdicas la integridad estructural
y la actividad biolgica de las protenas recombinantes tienen que ser
garantizadas y
Por lo tanto, tambin la cantidad de protena activa tiene que ser
determinada. Dependiendo de
tipo de protena (enzima o ligando del receptor) diferentes formatos de ensayo
eran
estableci, la mayora de los cuales an no se automatizaron y se aplic a on line
seguimiento de cultivos. La actividad de las enzimas se determina por lo general
mediante ensayos enzimticos adecuados, es decir, se incuba la muestra bajo
investigacin
con un sustrato enzimtico y la formacin de producto se registra. La actividad
de la glucosa oxidasa se control en lisados de Aspergillus niger utilizando
1,1
0
-dimethylferricinium como mediador en una solucin desaireada por Luong et al.
[84]. La deteccin de actividad enzimtica se basa en la re-oxidacin de
el mediador en un electrodo de trabajo de platino a un potencial de 250 mV vs.
Ag / AgCl. Este ensayo amperomtrico era tan sensible como la norma
ensayo fotomtrico basado en la reduccin de diclorofenol-indofenol
(DCPIP) y fue aplicado con xito a la vigilancia fuera de lnea de una de A. niger
el cultivo sin ser afectadas por la turbidez de las muestras.
550
U. Bilitewski

pgina 13
La automatizacin de un ensayo enzimtico por la FIA permiti que van Putten et
al. [85]
monitoreo en lnea de la produccin de serina proteasa alcalina
B. licheniformis. Se utiliz un sustrato de enzima, de la que p-nitrofenol
se escindi por la enzima y por lo tanto se determin la actividad enzimtica
fotometra (340 nm). El correspondiente FIA-set-up se integr en
un FIA-sistema de seis canales, que tambin permite el monitoreo en lnea de
otra
los componentes del medio. Aunque el ensayo de la enzima lleva a cabo en la
FIA-
sistema fue idntico al ensayo utilizado para el anlisis fuera de lnea, enzima
actividades determinadas en lnea fueron siempre significativamente menor que
el off-
datos de la lnea, pero la dependencia general de la actividad de la enzima en el
tiempo de cultivo (total ca. 45 h) fue el mismo. Las diferencias fueron
atribuido a la suciedad de la unidad de muestreo membrana.
Combinacin de muestreo de clulas estril automatizado y la desintegracin de
clulas
por tratamiento con ultrasonido discontinua permitido monitoreo en lnea
incluso de actividad de las enzimas intracelulares, como lo demuestra Kracke-
timn
et al. [86]. b-galactosidasa se determin directamente en la celda sin purificar
extracto, que fue inyectado como muestra en un sistema de FIA. El sustrato se
o-nitrofenil-b-
re
-galactopyranoside (ONPG), que se hidroliza para
producir o-nitrofenol, que se determin fotomtricamente. ensayo total
incluyendo el tiempo de disgregacin celular fue de 18 minutos, lo que permiti
en lnea
determinacin de la protena durante un cultivo de E. coli. En esta configuracin,
el sistema en lnea entregado valores ms altos que el anlisis fuera de lnea
(9%),
que puede ser debido a la prdida de actividad de la enzima durante el
almacenamiento de la muestra
y gastos de envo.
Sin la necesidad de la actividad b-galactosidasa fue la desintegracin de clulas
determinado por Biran et al. [87], ya que utilizan el gen lacZ como reportero
gen para la induccin de la expresin gnica despus de b- isoproplico
re
-thiogalacto-
piransido (IPTG) adicin o despus de la entrada en la fase estacionaria. los
ensayo se bas en la deteccin electroqumica de p-aminofenol, la cual es
producido a partir del sustrato p-aminofenil-b-
re
-galactopyranoside por
b-galactosidasa. Electrodos serigrafiados fueron utilizados como detectores y
colocado directamente en el matraz Erlenmeyer utilizado para el cultivo de E.
coli. los
inicio de la expresin gnica podra ser seguido sin ninguna muestra adicional
tratamiento.
Otro ejemplo de monitoreo en lnea de las actividades enzimticas fue dada por
Knnecke et al. [88], cuando se utiliz un sistema FIA para la determinacin de
actividades de la enzima durante la purificacin de protenas por croma- lquida
rpida de protenas
tografa (FPLC). Los ensayos fotomtricos para cuatro diferentes oxidasas eran
establecido en un sistema FIA extiende el rango lineal de la llamada
mtodo de muestreo de la zona. El FIA-dispositivo fue acoplado a la unidad
FPLC detrs de una
551
Los biosensores para el control de bioprocesos

pgina 14
fotmetro de absorbancia de monitoreo de protena a 280 nm. Por lo tanto, el
paralelo
el seguimiento de las actividades de la enzima permiti la identificacin de la
enzima en
los diversos protena que contiene fracciones.
Una idea similar fue seguido por Bracewell et al. [89]. Sin embargo, su objetivo
analito fue un fragmento de anticuerpo especfico para la lisozima de huevo de
gallina. Esta protena
fue producido por una cepa de E. coli que albergaba una copia de alta
correspondiente
plsmido. La protena se encontr en el sobrenadante del cultivo y se purific por
cromatografa de afinidad. Un FIA-sistema se estableci que contena el
afinidad sistema de sensores pticos IAsys como detector. La cubeta fue sensor
reemplazado por una clula de flujo continuo que permite la entrega
automatizada de todos los reactivos a
la superficie del sensor. El sensor consta de dos clulas de medicin, uno de los
cuales
contenida gallina inmovilizada lisozima de huevo (clula de medida) y la otra,
lisozima de huevo de pavo inmovilizada (celda de referencia) (Fig. 11.3). La
muestra
abordarse simultneamente tanto las superficies y la respuesta de la
superficie de referencia se rest de la de la superficie de medicin. los
superficies tuvieron que ser regenerado por un pulso de cido. El tiempo de
medicin entera
fue de 30 s que permita el control de la carga de la columna y de la on-line
perfil de elucin. El avance de la protena que indica la saturacin de
Higo. 11.3. Esquema para el seguimiento del avance de una protena de unin a
partir de una
columna cromatogrfica usando el espejo resonante como sistema sensor de
afinidad.
552
U. Bilitewski

pgina 15
la columna se podra supervisar slo por el biosensor ptico, porque el
protena diana era slo una pequea fraccin del total de protenas en la
alimentacin de
la columna y por lo tanto no se detect a 280 nm.
La aplicacin de tecnologas de sensores pticos afinidad es el mtodo de
eleccin, cuando la actividad biolgica de las protenas de unin, tales como
anticuerpos,
receptores, ligandos de receptores, es que se determine. ensayos estndar que
indican
la actividad biolgica de los ligandos del receptor son ensayos basados en clulas
con las clulas
ser estimulado para la expresin de protenas o la proliferacin por la bioactivo
protenas, y de clulas de estimulacin se determina ya sea radiactivamente [90]
o por
anlisis de expresin de la protena [83,91]. Alternativamente, los ensayos de
unin a receptores son
lleva a cabo en placas de microtitulacin, en la que el analito desplaza un
radiactivamente
ligando marcado [90]. Como la base de la actividad biolgica de estas protenas
es
su unin a un receptor adecuado, los sistemas de sensores pticos son ideales
afinidad
dispositivos para la determinacin cuantitativa de la actividad biolgica de la
protena recombinante, ya que el receptor puede inmovilizarse sobre la superficie
del sensor
y la unin del analito seguido en tiempo real. Se sigui Este enfoque
para la validacin y caracterizacin proceso de un anticuerpo quimrico para la
La interleucina-2 humana receptor [92] y para la caracterizacin de un artificial
receptor para un anlogo de insulina humana [93]. Adems, el proceso fuera de
lnea
se logr la vigilancia durante la produccin de la D1.3 fragmento de anticuerpo
Fv, que es especfico para la lisozima de huevo de gallina, por E. coli [94] y de la
vascular
factor de crecimiento endotelial por un pastoris cepa de P. recombinante [95]. los
importancia de estas investigaciones es evidente, como particularmente
recombinante
protenas a menudo no se secretan en el medio por el bacteriana producir
cepa (por ejemplo, E. coli) y el agregado de formacin de cuerpos de inclusin
intracelulares
que contiene protenas activas incorrectamente plegadas, no. As, las estrategias
de replegamiento
tienen que ser desarrollado y la actividad del producto resultante tiene que ser
demostrado [83,90]. El uso de un sensor receptor basado en el plasmn de
superficie
resonancia (SPR) el xito de los procedimientos de replegamiento, es decir, la
formacin de
protenas biolgicamente activas, podra ser seguido directamente durante el
replegamiento
los procesos sin ningn tratamiento previo de la muestra, adems de la dilucin
con el ejemplo
de 2 protenas (-2 rhBMP) produccin recombinante morfogentica sea humana
[96]. Se ha demostrado que en algunos casos la cantidad de protena activa era
slo una
fraccin de la cantidad total de la protena producida objetivo (menos del 30%)
[97].
La mayora de los informes mencionados anteriormente utilizar SPR como el
principio de medicin,
Sin embargo, otros sistemas de deteccin de afinidad son aplicables [89,94,98]
tambin.
En comparacin con investigaciones anteriores sobre las determinaciones de
protena por
inmunosensores [15,81,99], la unin de la protena recombinante al sensor
superficie con el receptor inmovilizado slo se produce cuando el sitio de unin
de la
protena recombinante se pliega correctamente, es decir, la protena recombinante
es
553
Los biosensores para el control de bioprocesos

pgina 16
presente en su forma biolgicamente activa. La unin a un anticuerpo se produce,
si la
eptopo reconocido por el anticuerpo est presente y accesible, lo que no lo hace
se refiere necesariamente a la actividad biolgica de la protena.
11.4 Cuantificacin de ADN de plsmido
La produccin recombinante de protenas por lo general sigue una estrategia de
dos pasos: en
la primera etapa, se genera la biomasa y en el segundo paso, la expresin de
se induce la protena diana. Esto se hace, porque la protena heterloga
la produccin interfiere con el metabolismo del husped (vase la siguiente
seccin) y
por lo general conduce a una reduccin del crecimiento celular. Un requisito
previo para esta estrategia son
plsmidos de alta calidad en la que se coloca el gen de la protena. Uno de los
objetivos de
optimizacin de la produccin de protena es la dosis de genes, es decir, el
nmero de
copias de genes recombinantes por genoma de acogida, que se puede aumentar
aumentar el nmero de copias del plsmido [100]. La replicacin de los
plsmidos es
depende de la propia secuencia del plsmido pero tambin de las condiciones de
crecimiento. As,
la necesidad de procesos validados y controlados [22] incluye el control
sobre el nmero de copias del plsmido que lleva a la necesidad de ensayos
adecuados [101].
las concentraciones de ADN se determinan generalmente por espectrofotometra
mtodos o por gel o electroforesis capilar. La absorbancia a 254 nm
[102] o 260 nm [103] permite la determinacin fiable de la concentracin
para los plsmidos purificados (50
metro
g / ml da una DO
260
1 [104]). La pureza de la
plsmido se controla mediante la relacin de las absorbancias a 260 y 280 nm
(SOBREDOSIS
260
/SOBREDOSIS
280
1,8 para el ADN purificado, disminuye con la contaminacin de protenas
[104]) o por electroforesis en gel o capilar. Un inconveniente de este mtodo es
la necesidad de ms altas concentraciones de ADN (.0.25
metro
g / ml [104]) de modo que
mtodos de fluorescencia se han desarrollado como alternativas. Se basan en
cambios
propiedades espectrales de los compuestos de unin al ADN, tales como
PicoGreen [103] o
bisbenzimide (Hoechst 33258 tinte) [102].
Un requisito previo para la determinacin de las concentraciones de plsmido es
la
lisis de las clulas, que normalmente se realiza mediante la mezcla de las clulas
con un alcalino
SDS-solucin, seguido de purificacin de plsmido por cromatografa de
intercambio inico
graphy despus de la neutralizacin con acetato de potasio. La incubacin de la
plsmido obtenido con PicoGreen permiti la determinacin del plsmido
concentraciones en el intervalo de 15 a 280 ng / ml [103]. Este mtodo era
Tambin aplicados a las muestras de proceso que muestra que no hay
interferencias eran
observado, si las muestras se diluyeron por un factor de 1/400. mientras que
Noites
et al. [103] realiz aislamiento del plsmido de forma manual, este procedimiento
era
automatizado utilizando un sistema de inyeccin de flujo por Nandakumar et
al. [102].
se hizo no slo de muestreo de clulas y la mezcla con la solucin de lisis
554
U. Bilitewski

pgina 17
de forma automtica, sino tambin la unin a una columna de intercambio inico
en miniatura
seguido de elucin. Un ciclo completo requiere aproximadamente 20-25
minutos. Con
un detector de fluorescencia, la determinacin era posible 1-40
metro
g / ml, la
rango se traslad a 20-100
metro
g / ml, se utiliz cuando el detector de UV. los
Se aplic sistema para monitorear la concentracin de plsmido en lnea durante
una
el cultivo de E. coli. Se observ que el anlisis fuera de lnea siempre dio mayor
valores que el anlisis en lnea. La razn de esta desviacin no era
dilucidado.
Estos mtodos analticos son mtodos inespecficos ya que dependen de
propiedades espectrales de ADN o de compuestos que se unen al ADN. La
identidad
del plsmido aislado ADN tuvo que ser confirmado por la digestin usando
enzimas de restriccin [103]. Una alternativa podra ser la aplicacin de ADN-
sensores, es decir, la deteccin de la hibridacin de cadena de la polimerasa
especfica
reaccin (PCR) los productos a oligonucletidos inmovilizados. La PCR conduce
a
una amplificacin de una secuencia de ADN delimitada por las secuencias de los
dos
Cebadores de PCR. Si se utilizan los dos cebadores en concentraciones casi
iguales
ADN-productos de doble cadena se obtienen, que, sin embargo, no puede
hibridar con oligonucletidos sin desnaturalizacin. Por lo tanto, las variantes de
la
convencional PCR se establecieron, por ejemplo, por la eleccin de secuencias de
cebadores
que conduce a dos ADN-cadenas complementarias de diferentes longitudes [105]
o por
al menos un exceso de 10 veces de un cebador que lleva a la sntesis preferida de
la secuencia correspondiente y por lo tanto a una cantidad significativa de un solo
productos varados [106]. Esta estrategia tambin fue seguido por Kuhlmeier
[107] que amplific una secuencia especfica de el plsmido pUC 19 por una
PCR asimtrica y podran seguir aumentando la cantidad de producto de PCR
con el aumento de los nmeros de PCR de ciclo utilizando un instrumento de
SPR (BIAcore) como
detector. Sin ninguna purificacin adicional plsmido que lleva a cabo la PCR
directamente en el lisado celular, que se obtiene a partir de la lisis trmica de E.
coli.
Por lo tanto, se combina la primera etapa del ciclo de PCR con la lisis trmica de
las celdas. En la Fig. 11.4a el xito de la PCR en estas muestras plsmido se
se muestra, y en la Fig. 11.4b las seales obtenidas con el sensor de cido
nucleico
basado en SPR usando las muestras de la PCR asimtrica [107]. Como se
esperaba
seales aumentaron linealmente con el aumento de los nmeros de ciclo de PCR.
La combinacin de muestreo automtico de clulas, lisis celular trmica, on-line
PCR asimtrica (como se sugiere por la tecnologa de microsistemas [108]) y
especfica
la deteccin de los productos de la PCR podra permitir en el futuro un mejor
control de
plsmido nmero de copias durante la fermentacin. Si, sin embargo, el producto
final de
el proceso es un plsmido puro para su uso en la terapia gnica, las
investigaciones adicionales
son necesarios para garantizar la ausencia de contaminacin de ADN genmico,
protenas o productos qumicos utilizados durante de aislamiento de plsmidos
[109].
555
Los biosensores para el control de bioprocesos

pgina 18
11.5 sistemas enzimticos BASADA EN LOS INDICADORES DE LA
CLULA
FISIOLOGA Y METABLICOS ESTRES
El anlisis de las redes de regulacin implicados en la adaptacin de la
metabolismo de los microorganismos a varias condiciones ambientales, tales
como el hambre, puesto de manifiesto la importancia particular de nucletidos y
aminocidos
cidos. Estos compuestos funcionan como seales de hambre, precursores de
vas metablicas, las fuentes de energa o estn involucrados en la actividad
enzimtica
la regulacin [10,32,33,42,44,110-112]. Estn determinados por lo general fuera
de lnea
por HPLC [8,10,32,33,42,44,112], como cromatogrfica o electrofortica
determinaciones permiten la determinacin simultnea de todos los compuestos
de
0
10
20
30
40
50
0
100
200
300
400
500
Unidades de Respuesta [RU]
Nmero de ciclos
(un)
(segundo)
Higo. 11.4. (A) electroforesis en gel de agarosa del producto de PCR 125 pb
resultante de
la amplificacin de una secuencia especfica en el plsmido pUC. Para la PCR
una gama de
Se utilizaron diferentes concentraciones de plantilla. Los carriles corresponden a
Escherichia coli
las clulas cultivadas a diferentes OD
600 nm
valores: carril 1, pUC19 purificado (1 ng); carril 2, DO a
0,028; carril 3, DO a 0.078; carril 4, la DO a 0,23 y el carril 5, DO a 0,63. LS
contiene una
marcador de peso molecular (escalera de 100 pb). (B) La dependencia de las
seales de los sensores en el
nmero de ciclos de PCR asimtrica, despus de 25 ciclos de una PCR
convencional, simtrica en
un primer paso. Despus de la hibridacin del producto de PCR para el plsmido
especfica inmovilizado
oligonucletido, la superficie del sensor se regener mediante NaOH.
556
U. Bilitewski

pgina 19
interesar. Sin embargo, para algunos de ellos se describen tambin mtodos
enzimticos,
que tambin se puede aplicar en el futuro para el seguimiento de bioprocesos.
Amino anlisis de cidos 11.5.1
Los electrodos enzimticos, en particular, para el glutamato y la glutamina son
conocidos por un nmero de aos y se aplica principalmente a la supervisin de
cultivos de clula animal [14,15, 112-115]. Se basan por lo general en el
glutamato oxidasa y / o la glutaminasa. Glutaminasa convierte glutamina a
glutamato y amonaco (ecuacin (11.3).):
glutaminasa:

Por lo tanto, la enzima puede estar acoplado a los electrodos de amonaco, de

efecto de campo transistores o mtodos qumicos de determinacin de amonaco
[115]. Alternativamente, un sistema bi-enzima se puede aplicar la combinacin
de la glutaminasa con glutamato oxidasa (ecuacin (11.4).):

Glutamato oxidasa

Esto permite que la combinacin con la deteccin amperomtrica de perxido de

hidrgeno. Sin embargo, si la glutamina y glutamato estn presentes
simultneamente en una muestra, se requiere una medicin diferencial.
Menos extendida que la determinacin enzimtica de estos aminocidos es la
aplicacin de los sistemas de sensores de la enzima para los precursores u otros
aminocidos. Collins et al. [116] describe un sistema de inyeccin de flujo para la
determinacin de a-cetoglutarato durante una fermentacin industrial. Los
sistemas estaban basados en glutamato deshidrogenasa (Ec. (11.5)) y glutamato
oxidasa (Ec. (11.4))

Glutamato deshidrogenasa:

Ambas enzimas fueron inmovilizados sobre perlas (125-315metrom) y en serie

utilizado en los reactores enzimticos ya sea como lechos de relleno o como
lechos expandidos. De nuevo la deteccin se basa en la deteccin amperomtrica
H2O2. Los co-reactivos, tales como NADH y NH3, se aadieron a la
portadora. Los reactores de lecho expandido mostraron una menor sensibilidad y
tiempos de respuesta ms largos en comparacin con el sistema de lecho
relleno. Sin embargo, el riesgo de obstruccin debido a la muestra constituyentes
557
Los biosensores para el control de bioprocesos
 pgina 20
fue mnima, por otra parte, las muestras celulares podran tambin ser analizados
mientras que para las clulas del sistema de lecho empacado tuvieron que ser
retirados por centrifugacin.
Gilis et al. [117] desarrollado biosensores para la determinacin de L alanina
y su precursor de piruvato. Se adaptaron el principio de un ensayo fotomtrico,
que se basa en la alanina deshidrogenasa (Ec. (11.6))

deshidrogenasa Alanina:

Esta reaccin se acopl a la oxidacin de NADH por hexacianoferrato (II)

catalizada por la diaforasa (Ec. (11.7)).

diaforasa:

La deteccin electroqumica utiliz la re-oxidacin de hexacyano-

ferrato (II) sobre un electrodo de platino. Para la determinacin de este ensayo de
piruvato se extendi a un sistema de 3-enzima mediante la adicin de piruvato
glutamato transaminasa, que produce alanina a partir de piruvato. Se usaron todas
las enzimas en solucin en una cmara de reaccin de aproximadamente 2
metro l directamente en frente del electrodo. El NAD cofactor fue acoplado a
dextrano con un molecular peso de 40.000 para evitar su sustitucin para cada
ensayo. A medida que el sensor respondido a L alanina y piruvato de nuevo una
medicin diferencial era requerido cuando una muestra contena ambos
compuestos. Se aplic a fuera de lnea seguimiento de un cultivo de S. cerevisiae
y los datos mostr una buena correlacin conlos ensayos fotomtricos.

11.5.2 Anlisis de nucletidos

Existen sensores enzimticos o ensayos para la determinacin de trifosfato de
adenosina
fosfato (ATP) y sus productos de degradacin inosina 5
0
monofosfato (IMP),
inosina (HxR), hipoxantina (Hx) y xantina (X) como ATP se utiliza como una
indicador de la presencia de microorganismos y las concentraciones de su
productos de degradacin se utilizan como indicadores para los peces y la
frescura de la carne en los alimentos
industria [118].
sistemas de enzimas para la determinacin de ATP difieren en la alcanzable
lmites de deteccin ms bajos en funcin de las enzimas y los principios de
deteccin. los
sistema enzimtico derivado del mecanismo de generacin de luz en las
lucirnagas
558
U. Bilitewski

pgina 21
utiliza la generacin de luz por el sistema luciferina-luciferasa (Ec. (11.8))
Luciferase:
ATP D-luciferina O
2
! Oxiluciferina PP
yo
AMP CO
2
luz
D11: 8
Gamborg y Hansen [119] sugiere un sistema de flujo de la inyeccin, en la que
que solucin de enzima, el reactivo y la muestra mezclada directamente en frente
de una
fotomultiplicador y alcanz un lmite de deteccin inferior de 10
210
M. Se enfrent
el problema de obtener soluciones estndar estables en esta baja concentracin
gama, lo que hizo imposible seguir mejorando.
se obtienen sistemas menos sensibles cuando se utilizan reacciones enzimticas,
en
que ATP es uno de los cofactores. Por ejemplo, la fosforilacin de la glucosa
por la hexoquinasa requiere ATP como cosustrato (Ec. (11.9)). Por lo tanto, una
glucosa
electrodo se combin con se observ reduccin de la hexoquinasa y la seal de
cuando el ATP estaba presente [120].
hexoquinasa:
La glucosa ATP! glucosa-6-fosfato de ADP
D11: 9
El acoplamiento de esta reaccin para reacciones enzimticas adicionales
convertir el ADP
(Ec. (11.10)) y la glucosa-6-fosfato (Ec. (11.11)) conducen a reciclaje de ATP
y amplificacin de la seal por factores 15-1000 [121122]. El ms bajo
lmite de deteccin estuvo en el intervalo de 10
29
METRO.
piruvato quinasa:
ADP fosfoenolpiruvato! ATP piruvato
D11: 10
glucosa-6-fosfato:
La glucosa-6-fosfato NAD

! NADH gluconato-6-fosfato
D11: 11
No aplicacin a muestras reales, en particular, a la fermentacin de vigilancia, era
reportado.
La determinacin de las nucleobases IMP, HxR, Hx y X sigue la
va de degradacin natural de ATP (Ec. (11.12)).
5
0
-nucleotidase:
IMP! HxR
nuclesido fosforilasa: HxR P
yo
! hx
Xantina oxidasa:
HX O
2
! X ! cido rico H
2
O
2
D11: 12
Por lo tanto, se requieren mediciones diferenciales para determinar todos los
compuestos
separadamente. Sin embargo, como la xantina e hipoxantina son ambos sustratos
para
xantina oxidasa cada uno de ellos slo se puede determinar, si el otro es
559
Los biosensores para el control de bioprocesos

pgina 22
no presente. Para el anlisis de alimentos, hipoxantina generalmente es de gran
importancia
[118], y en el seguimiento de la fermentacin se observ que la hipoxantina
acumulado intracelular, mientras que la xantina se encontr en el medio [44].
Por lo tanto, era posible establecer un sistema FIA con xantina inmovilizada
oxidasa y un electrodo de platino serigrafiado como detector para determinar
xantina en muestras de un cultivo de E. coli [123].
11.6 arrays de ADN
Los microorganismos lograr la sntesis de precursores o bloques de construccin
requerida para adaptarse a las condiciones en el fermentador no slo por la
regulacin
de la actividad de las enzimas, sino tambin por la regulacin de la expresin de
genes
que conduce a cambios en las concentraciones de protena y permitiendo la
sntesis de
protenas requieren slo ocasionalmente. Por ejemplo, la tasa de crecimiento, la
densidad celular y
la composicin de los medios de comunicacin influyen en la exigencia de
enzimas implicadas en la
la respiracin [124-126], la sntesis de bloques de construccin [127,128], en el
centro
vas metablicas [124,129,130] o la traduccin de protenas [127]. En adicin,
un aumento de temperatura conduce a la induccin de las llamadas protenas de
estrs
o protenas de choque trmico [40,131,132], y protenas similares se inducen
como
respuesta a la produccin de protenas heterlogas [28,40,133,134] y otra
tensiones relacionadas con el proceso [135]. Un nmero de estas investigaciones
se basaron en
el anlisis de la fraccin de protena citoslica mediante electroforesis en gel 2D
[28,40,
128,129], otros, sin embargo, analizar el grado de transcripcin de genes
directamente en
el ARNm. Para el anlisis de protenas cada vez ms arrays de protenas se
vuelven
disponible, que se basan generalmente en el reconocimiento de la protena por
anticuerpos [136137]. Sin embargo, estas matrices todava no se aplicaron a
bioproceso
anlisis y por lo tanto no se consideran en esta contribucin aunque
utilizar los principios de biosensores.
La transcripcin de genes especficos (deteccin de mRNAs especficos) es
monitoreado para la optimizacin de la sobreexpresin recombinante de
heterloga
protenas ya por un nmero de aos [100]. La disponibilidad de mundial
mtodos, tales como los chips de ADN o de las membranas que cubren todo un
genoma o partes
de un genoma, permite un anlisis molecular ms general de fisiologas de
clulas,
completando conocimientos bioqumicos disponibles y los datos de anlisis de
protenas.
Varios mtodos para el anlisis global de la expresin de genes estn disponibles,
la mayora de
que no utilizan los estrictos principios de biosensores, ya que incluyen una serie
de
procedimientos de manipulacin manual por separado, la grabacin de la seal
despus del secado y algunos
incluso marcaje radioactivo [138] (Seccin 11.6.1). Sin embargo, se demostr
que
el uso de marcadores fluorescentes, junto con chips de vidrio como soporte para
sondas inmovilizadas da esencialmente los mismos resultados como marcadores
radiactivos
560
U. Bilitewski

pgina 23
en combinacin con soportes de membrana [139]. Por otra parte, hay primero
sugerencias a los escneres de fluorescencia pareja para sistemas de fluidos [140]
y hasta
expandir la tecnologa SPR a las matrices [141]. Por lo tanto, en los siguientes
informes sobre la
se mencionan aplicacin biotecnolgica de observacin de la expresin de genes
independientemente del principio de deteccin y el formato de ensayo (Seccin
11.6.2).
11.6.1 Fundamentos
11.6.1.1 Factores que influyen en la reaccin de hibridacin
arrays de ADN se basan en el apareamiento de bases especfica de
complementaria
nucletidos que conducen a secuencias de doble cadena de cidos
nucleicos. diferente a
anlisis tradicional de transferencia Northern, la hebra de ser especfico para el
gen bajo
investigacin se inmoviliza como sonda de captura y el correspondiente
homlogo, el objetivo, est aislado de la muestra y presente en la solucin.
Para la expresin de genes seguimiento de los chips se utilizan, ya sea con
inmovilizada
oligonucletidos (longitud, 70 nucletidos) (por ejemplo,
www.amershambiosciences.
com; www.mwg-biotech.com; www.chem.agilent.com; www.affymetrix.com)
o inmovilizada y los productos de PCR desnaturalizados (longitud de 400 a 1000
pb) (por ejemplo,
www.eurogentec.com; www.sigma-genosys.com; www.corning.com) repre-
ing todos los marcos de lectura abierta (ORFs) de un genoma o slo un conjunto
de genes [142143].
Como otras reacciones de afinidad, la reaccin de hibridacin de cidos nucleicos
o
oligonucletidos se caracteriza por la constante de afinidad y por la cintica
constantes de la reaccin de asociacin y disociacin. La afinidad es
influida en primer lugar por las secuencias de los cidos nucleicos, y en segundo
lugar por
condiciones experimentales. La unin de la guanina-citosina (G-C) es el par de
bases
ms fuerte que la de la adenina-timina (A-T) par de bases conduce a una mayor
afinidades de secuencias ricas en G-C. Por otra parte, ya que cada par de bases
contribuye
a la fuerza de los generales, los aumentos de afinidad de unin con la longitud de
las secuencias que interactan, es decir, el nmero de nucletidos que emparejan
[144].
Si la secuencia de pares de bases a juego es interrumpido por una falta de
coincidencia, esto hace
no impide totalmente la hibridacin de ambas cadenas pero conduce a un
reducido
la estabilidad [145]. El grado de desestabilizacin depende de las longitudes de la
restante perfectamente a juego secuencias y, por tanto, en la posicin de la
falta de coincidencia. Por lo general, los dobles hebras son menos estables,
cuando la falta de coincidencia es
localizada en una posicin interna en comparacin con los desajustes en el
extremo de la
secuencia [145,146]. Por lo tanto, la intensidad de seal aumenta con la longitud
de la
disminucin de la sonda y, si estn presentes desajustes [146].
Incluso para las cadenas de cido nucleico dada la afinidad puede ser
influenciada por
aditivos a la solucin de hibridacin [104147]. Se encontr que formamida
inhibe la formacin de enlaces de hidrgeno y por lo tanto reduce la estabilidad
de la
561
Los biosensores para el control de bioprocesos

pgina 24
hlice de doble cadena. Por otra parte, los cidos nucleicos estn cargadas
negativamente debido a la
los grupos fosfato de la cadena principal de nucletidos. Sin la compensacin
de este cargo por los iones de signo contrario, incluso complementarias
individuales son hebras
electrostticamente repelido que conduce a la estabilizacin de las hebras de
doble con
aumento de las concentraciones de cationes monovalentes (Na

). Otro importante
parmetro experimental es la temperatura de hibridacin [146147] como
el aumento de la temperatura conduce al aumento de las tasas de disociacin y
una separacin
de dobles hebras en un solo captulos, produce una reaccin llamada "fusin del
ADN". los
temperatura que conduce a una disociacin del 50% de los dobles hebras se
denomina
temperatura de fusin T
metro
de la secuencia y se utiliza para la caracterizacin de
la estabilidad de la doble hebra. Para los oligonucletidos que puede ser ms o
menos
calculado a partir de la secuencia mediante el uso de la aproximacin
T
metro
28C DA-TTH 48C DG-CTH;
D11: 13
con (A-T) es el nmero de pares A-T y (G-C) el nmero de G-C
pares de la secuencia.
Para los hbridos ms largos a la aproximacin
T
metro
81: 58C 16: 6 logc
N/A

De hacerlo 0: 41D% n d CTH 500 2 = n

D11: 14 de
se utiliza [104] con n es la longitud de la hebra de hibridacin y c
N/A

el
concentracin de Na

iones.
Si t
metro
excede la temperatura de hibridacin por 10-158C, eficiente
se observa la hibridacin. Si, sin embargo, la temperatura de hibridacin es
mucho menor que T
metro
; la hibridacin de hebras que contiene falta de coincidencias o siendo
slo en parte complementaria va a producir.
Las influencias de las secuencias de ADN en las especificidades de la
reacciones de hibridacin tienen que ser considerados cuando los chips de ADN
se han diseado.
La longitud y la secuencia de la sonda de captura tiene que ser elegido de modo
que es
especfico para un nico gen. Adems, las secuencias de oligonucletidos que
sean
combinado en una matriz no debera diferir mucho en el G-C-contenido para
obtener
Las temperaturas de fusin similares de los correspondientes dobles hebras. Kane
et al.
[148] investigaron la sensibilidad y especificidad de un chip que contiene
oligonucletidos con una longitud de 50 bases (50-meros). Podran identificar
condiciones experimentales de modo que slo las secuencias con la secuencia de
ms de 75%
similitud contribuyen a la seal por la hibridacin cruzada, y las secuencias de
que eran slo marginalmente similares no deben contener un tramo de
secuencia complementaria de .15 bases contiguas. Si los oligonucletidos
eran ms cortas de 50 bases, encontraron demasiadas secuencias no diana con
una
similitud de 0,75%, si fueran ms tiempo, por ejemplo, los productos de PCR con
.100 bases,
la probabilidad de que un nmero suficiente de bases complementarias tambin
aumenta.
562
U. Bilitewski

pgina 25
Estas observaciones son compatibles con las observaciones de transferencia de
northern
anlisis, donde ocasionalmente mltiples genes, no objetivo se indican mediante
el
elegido sonda marcada. Por lo tanto, si se utilizan oligonucletidos con 50 a 60
nt, es
supone que una nica sonda por gen permite el control especfico y fiable de
la expresin de este gen. Si se utilizan oligonucletidos ms cortos (20-25 nt),
por lo general varias sondas son que ser diseado para cada gen [147].
Sin embargo, la longitud de la sonda es importante no slo para la estabilidad de
la
De doble cadena y la especificidad de la hibridacin, sino tambin para la
cintica
de la reaccin. La velocidad de hibridacin se determina principalmente por el
acceso de
los objetivos a las sondas inmovilizadas, que est influenciada por la densidad de
la
sondas inmovilizadas [149], la longitud y la complejidad de la secuencia, y por
la velocidad de difusin, lo que depende de la temperatura, concentraciones y
viscosidad de la solucin objetivo. Adems, las condiciones experimentales ms
importantes
a una desestabilizacin de la doble cadena, tales como fuerza inica baja o
la presencia de desajustes, reducir la tasa de hibridacin, como la disociacin
es acelerado a medida que se pudo observar con un dispositivo de SPR
[107]. Creciente
la longitud de la sonda aumenta la estabilidad de la doble hebra. Sobre el
Por otra parte, las estructuras secundarias se pueden formar, la hibridacin
prevencin
con el objetivo, y la complejidad de la secuencia se incrementa, es decir, el grado
de secuencias no repetitivas, dando lugar tambin a una reduccin de la
hibridacin
tarifa. Por ejemplo, la unin de mRNA a un 24-mer que comprende solamente
timidina
(PoliT) result en un sistema de flujo pasante en seales significativamente
mayores
en comparacin con el mRNA capturado a travs de genes especficos de sondas
de captura [150]. Era
se encontr que el equilibrio de hibridacin se alcanza slo despus de al menos
24 h
tiempo de hibridacin, incluso si se utilizan sondas de oligonucletidos [146151].
11.6.1.2 La inmovilizacin
Los cidos nucleicos (oligonucletidos o productos de la PCR) se inmovilizan ya
sea por
fuerzas fsicas o reacciones qumicas (bio) [143]. Las principales sustratos son de
vidrio
diapositivas o membranas de nylon, en funcin del mtodo de deteccin elegido.
Sin embargo, tambin se describen ensayos en placas de microtitulacin [152].
A medida que los nucletidos estn cargadas negativamente, que interactan por
electrosttica
atraccin con superficies cargadas positivamente son los proporcionados por las
membranas de nylon
[131] o de vidrio portaobjetos tratados previamente con poli-
L
lisina [129153] (http: // CMGM.
Stanford.edu/pbrown/protocols) o aminopropyltri-etoxisilano (APTS) [154]
(Www.corning.com). sondas de captura son vistos en la superficie y se
secaron. Si
Los productos de PCR se utilizan, que se desnaturalizan, ya sea antes [154] o
despus de [124]
punteo. Por lo general, la irradiacin UV se recomienda como una cruzada
adicional
la vinculacin de paso, pero calentando a 60 y 1208C tambin es posible
[147]. Como cada
563
Los biosensores para el control de bioprocesos

pgina 26
nucletidos contribuye con un cargo adicional, las fuerzas electrostticas
aumentar al aumentar la longitud de los cidos nucleicos, lo que hace este
mtodo de inmovilizacin aplicable principalmente para productos de
PCR. Zammatteo et al.
[154] mostr que ya para una sonda de captura 255 pb la eficiencia de este
atraccin electrosttica super la eficiencia de la unin covalente an.
La alternativa a la inmovilizacin a travs de interacciones fsicas es covalente
Unin. Esto requiere la disponibilidad de grupos funcionales adecuados en tanto
la sonda que va a inmovilizarse y el sustrato de inmovilizacin, por lo general de
vidrio.
Se utilizaron chips de vidrio aminadas, que se activan an ms por carbodiimida
para permitir el acoplamiento de los cidos nucleicos carboxilados o fosforilados
[154] o
modificacin adicional antes de la inmovilizacin de cidos nucleicos
[155]. Adicionalmente,
productos oligonucletidos con funcionalidad amino o PCR se acoplan a travs
de
reactivos bifuncionales, tales como diisotiocianatos, derivados de
disuccinimidilo,
o triclorotriazina [155-157]. Con funcionalidad amino cidos nucleicos, sin
embargo,
puede acoplarse fcilmente a amina-grupos reactivos presentes en una cadena
larga
polmero hidrfilo [148158] o epoxi [159] o vidrio modificada con aldehdo
superficies. Bases de Schiff resultantes se pueden reducir mediante borohidruro
de sodio. Esta
mtodo se demostr ser muy eficaz y especfico y adecuado para la
aplicacin de volmenes muy pequeos de lquido, aunque la cintica de unin
mostr una eficiencia creciente al aumentar el tiempo de contacto de la
DNA-solucin a la superficie del cristal [154].
Tal como se conoce a partir de grupos funcionales adicionales de la qumica de
bioconjugados
puede ser utilizado para la unin de biomolculas. De este modo, el acoplamiento
a travs de grupos SH
[149,155,160], un benzaldehdo-semicarbazida-reaccin [161] o la reaccin de
entre una superficie recubierta con estreptavidina y un oligonucletido
biotinilado
[150162163] son slo algunos ejemplos.
La mayora de estos mtodos se aplican a cualquiera de los productos de PCR o
pre-
oligonucletidos sintetizados en combinacin con sistemas de lquido-manchado.
Esto permite el control y la optimizacin de la cantidad de la una sola
inmovilizada
filamento [149]. SH-acoplamiento o benzaldehdo-semicarbazida-acoplamiento
entregados
densidades mximas de aproximadamente 10 a 100 pmol / cm
2
[160,161], mientras
unin de productos de PCR con funcionalidad amino a una superficie de vidrio
aldehdo
resultado en solamente 600 fmol / cm
2
[154]. Sin embargo, slo el 10-30% de la inmovilizado
sondas tomaron parte en la reaccin de hibridacin de manera que la sonda
ptima
la densidad se redujo an ms [149]. La densidad de puntos en estas matrices es
limitada por restricciones mecnicas de suministro de lquido o manipulacin
superficie.
Como est bien establecida la sntesis en fase slida de oligonucletidos,
oligonu-
sondas de captura cleotide tambin se pueden sintetizar directamente sobre la
superficie del chip.
Este fue descrita por Pease et al. [164], y ms tarde por Weiler y Hoheisel
[165] y Blanchard et al. [166]. La reaccin bsica es la reaccin de
564
U. Bilitewski

pgina 27
desoxinuclesidos fosforamidita activado con grupos funcionales adecuados,
grupos hidroxilo, por lo general sobre la superficie de vidrio o polipropileno. en
Affymetrix
estos grupos hidroxilo se generan en sitios seleccionados del encendido de la
saltar a travs de una mscara apropiada [164,167]. Como primera etapa, el
soporte slido es
derivatizado con una molcula covalente enlazador terminado con un especial,
grupo fotolbil protector. Iluminacin conduce a desproteccin y
la formacin de grupos hidroxilo. En el siguiente paso, el derivado de nuclesido
para ser acoplado se aade, siendo el correspondiente 3
0
-phosphoramidite y
5
0
-photoprotected. Iluminacin con otra mscara genera una diferente
patrn de grupos hidroxilo que permite que cada secuencia deseable
sintetizado. Como el nmero de sondas en una matriz est limitado por la fsica
tamao de la matriz y la resolucin alcanzable fotolitografa, aproxi-
madamente 400.000 oligonucletidos fueron sintetizados en 1,28 1,28 cm
2
papas fritas.
Originalmente, estos arrays de alta densidad fueron diseados para la
secuenciacin por
hibridacin [164], pero tambin se utilizan para el control de la expresin gnica
[125130]. Una secuencia de bases 200-300 del gen de inters se elige y una
nmero de sondas que no se solapan 25-mer est diseado y sintetizado en el
junto con el chip de control de sondas desajuste que contienen una nica base de
diferencia
en la posicin central. Esta redundancia debera mejorar la precisin y
mejorar el ruido de relacin de seal a.
Hughes et al. [168], sin embargo, encontraron un nico oligonucletido 60-mero
por gen
adecuada cuando se determinaron las proporciones de abundancia de
transcripcin, lo que limita la
nmero de sondas requiere para cubrir todos los genes dentro de un genoma
entero en cierta
decenas de miles y hace que la fabricacin matriz mediante impresin por chorro
de tinta factible.
11.6.1.3 principios de deteccin
La hibridacin de un cido nucleico diana a la sonda inmovilizada es una
afinidad
reaccin entre dos parejas de reaccin complementarios. Por lo tanto, esta
reaccin
Se sigui en tiempo real por los sistemas de sensores de afinidad, tales como
dispositivos de SPR
[145149150169], espejos resonantes [144] o sistemas de acoplamiento de rejilla
[170].
Algunos sistemas ofrecen chips sensores cubiertos con un dextrano
carboximetilado
capa, lo que impide la inmovilizacin covalente directo de la sonda debido a
repulsin electrosttica del oligonucletido cargado negativamente de la
cargado negativamente polmero. El mtodo de inmovilizacin preferido es la
inmovilizacin bioqumica usando estreptavidina inmovilizada en el polmero
y sondas biotiniladas. Se obtuvieron eficiencias de unin de hasta 83% [162].
Control en tiempo real de la hibridacin permite el anlisis de la
influencia de la sonda y la longitud de destino, y la concentracin de la sonda y el
objetivo
posicin de desajustes no slo en la seal de estado estacionario resultante sino
tambin en
la velocidad de asociacin y disociacin. Se demostr que las constantes de
afinidad
565
Los biosensores para el control de bioprocesos

pgina 28
determinada por SPR correlaciona bien con la temperatura de fusin y la
disminucin
afinidades como la disminucin de las longitudes de la diana influenciados
principalmente la disociacin
tasa [145]. La mayor parte de estas investigaciones se realizaron con los
oligonucletidos.
Sin embargo, la determinacin de ARNm tambin era posible, aunque ms bien
alto
Se requieren concentraciones [150].
Por lo general, la deteccin de mRNAs utilizar las caractersticas especficas de
los cidos nucleicos,
es decir, la posibilidad de sintetizar una copia de ADN de hebra (ADNc) por una
inversa
reaccin de la transcriptasa que permite la integracin de los compuestos
marcados.
Esto se hace ya sea por el uso de cebadores marcados o etiquetados nucletidos
como
componentes de la mezcla de reaccin. Los marcadores adecuados son los
istopos radiactivos,
como
33
P [128] o
32
P, colorantes fluorescentes, tales como fluorescena [171], Cy3 o Cy5
[148172173], biotina [125158] o micro y nanopartculas [174,175].
Etiquetado con biotina requiere tincin adicional, por ejemplo, con estreptavidina
ficoeritrina [125], estreptavidina-Alexa647 [158] o antibiotina-anticuerpo o
estreptavidina-peroxidasa de rbano conjugados [173,176]. Este ltimo es uno
la base de la amplificacin denominada seal tiramida tecnologa (TSA), tambin
deposicin llamado reportero catalizada (CARD), que conduce a la deposicin de
colorantes fluorescentes como resultado de la reaccin de la peroxidasa. grupo
modificado con tiol
oligonucletidos se unen a nanopartculas de oro a travs de los grupos SH [174].
La hibridacin con oligonucletidos diana complementarias provoc una roja
cambio de color prpura en solucin [174] y las manchas de color rosa claro en
arrays [175] debido
a los aumentos locales de las concentraciones de partculas. Sin embargo, de tipo
sndwich
Se requieren ensayos con una hebra de ser inmovilizado y el otro ser
etiquetadas y ambos reticulados por la cadena diana. Las seales fueron
amplificadas por
un factor de 10
5
el uso de la reduccin de iones de plata por hidroquinona en la superficie de
nanopartculas de oro. Esto permiti la visualizacin y cuantificacin de incluso
el objetivo de hibridacin mediante un simple escner plano [175].
El examen de las etiquetas mencionadas anteriormente generalmente integrado en
ADNc
(Cy3, Cy5, fluorescena, Alexa647, ficoeritrina, biotina) muestran que la mayor
parte
detectores a menudo usados son detectores de fluorescencia que permiten el
anlisis de chip de
longitudes de onda surfaces.Lightsourcesarepreferably laserswiththeappropriate,
hoy en da los sistemas que comprenden ms de una fuente de luz y por lo tanto
permiten
la excitacin de diferentes tintes estn disponibles (por ejemplo, www.mwg-
biotech.com).
La fluorescencia emitida se captura ya sea por cmaras CCD o por foto-
multiplicadores con este ltimo que muestra la mayor sensibilidad que requiere,
sin embargo,
el movimiento de el chip o el detector para obtener una imagen del chip.
CCD cmaras permiten el anlisis de las reas ms grandes de la viruta a la vez,
pero debido
a los tiempos de integracin de sensibilidad extendida reducidos que sean
necesarios. Aunque
fichas planas dominan anlisis de la expresin gnica, los sistemas que utilizan
haces
de Tambin se describen fibras pticas [171].
566
U. Bilitewski

pgina 29
principios de deteccin electroqumicos, como una alternativa a la deteccin
ptica,
tambin se describen, por anlisis de ADN [163,177,178]. Ellos utilizan la directa
oxidacin electroqumica de la guanina, propiedades de transferencia de
electrones de ADN
dobles hebras o marcadores redox activos, tales como daunomicina o ferroceno
derivados. Sin embargo, estos enfoques que todava no se han desarrollado en
una matriz compleja
sistemas para ser utilizados para el control de la expresin gnica. Una
combinacin interesante
se present nacin de propiedades electroqumicas y pticas de los cidos
nucleicos
por Heller et al. [179]. Se generan campos elctricos por la polarizacin de solo
electrodos para un transporte activo de los cidos nucleicos cargados
negativamente. Objetivo
cidos nucleicos se concentraron mediante la aplicacin de una polarizacin
positiva y una
se observ aceleracin de la reaccin de hibridacin. La inversin de la
polaridad elimina los objetivos no ligados-y la aplicacin de un impulso de
corriente
aumento de la severidad de la hibridacin, la mejora de la especificidad del
sistema.
Deteccin, sin embargo, se bas en el seguimiento de la fluorescencia de Bodipy
de Texas
Red, que se utiliz para el marcaje de la sonda. El dispositivo se llama un "activo
microelectrnica dispositivo de chip de ADN "y contena 100 sitios de prueba.
El anlisis de datos 11.6.1.4
Con la elucidacin completa de secuencias genmicas de los organismos y el
aparicin de las primeras herramientas de chips de ADN estaban disponibles para
el anlisis global de
organismos y por lo tanto para una mayor comprensin de los sistemas
biolgicos. los
las expectativas eran altas, en particular, como el manejo de los chips de ADN y
generacin de datos parecan ser bastante fcil [180]. Sin embargo, la aplicacin
de
arrays de todo el genoma plantearon una gran cantidad de puntos de datos, por
ejemplo, los datos de este tipo para
la expresin de aproximadamente 6.200 genes de una sola muestra de una
levadura
cultivo, o de 4200 genes para un cultivo de E. coli, que slo pueden ser
analizada, si los mtodos de clculo adecuados estn disponibles [181]. Tienen
que
abarcan aspectos tales como el anlisis de imgenes, almacenamiento y
organizacin de los resultados,
comparacin de perfiles de expresin y la interpretacin funcional [182,183].
Por otra parte, el aumento de la aplicacin de matrices de frecuencia mostr un
limitado
reproducibilidad de los datos en bruto, incluso cuando se realizaron experimentos
en el
mismo sistema en el mismo laboratorio [184]. As, las estrategias de
normalizacin
se desarrollaron y probaron mtodos estadsticos para mejorar la calidad de los
datos
[181,185-187]. Teniendo en cuenta estos aspectos ya durante el diseo de
experimentos es el requisito previo para los datos fiables. Arfin et al. [187]
mostr
Slo se detectaron que los cambios estadsticamente significativos de la
expresin gnica
con una multiplicacin de cultivos y la aplicacin bien diseado de
diferentes matrices a las diferentes piscinas de ARNm que deben compararse.
567
Los biosensores para el control de bioprocesos

pgina 30
anlisis de la expresin gnica en 11.6.2 ingeniera bioqumica
La mayora de las aplicaciones biotecnolgicas de los mtodos para el anlisis de
la expresin gnica
fueron descritos para las cepas de E. coli [124,127,129,133-135,139,187-189]
debido a
su importancia para la produccin heterloga de protenas [6] y la resultante
disponible gran cantidad de informacin sobre las condiciones de cultivo [2], la
fisiologa celular,
gentica y el metabolismo de [190]. Sin embargo, las aplicaciones a B. subtilis
[128,191,
192], C. glutamicum [126,153], Streptomyces coelicolor [172] y la levadura
Tambin se describe S. cerevisiae [125130].
Varios aspectos de la influencia de las condiciones de cultivo en E. coli eran
investigado. Una de las principales preocupaciones en la optimizacin de
bioprocesos es el
la adaptacin de los microorganismos a los diversos aspectos de la tensin
impuesta a
las clulas durante el cultivo. Por lo tanto, el seguimiento de la expresin de
genes de estrs
fue el principal foco, en particular, en estas investigaciones que consideran
slo un subconjunto de genes [28124134135]. Se observ que los genes que
codifican
protenas de choque trmico y ser miembros de la s
32
-regulon (s
32
: Gen rpoH
producto), tales como dnaK, clpB, GroEL, IbpA, se indujeron al menos
transitoriamente
no slo debido al aumento de la temperatura [139], sino tambin debido a la
ampliacin [135],
el cultivo de clulas de alta densidad [129132] o expresin inducida por IPTG de
protenas heterlogas [28124]. La expresin de estos genes no se vio afectada
cuando se usaron diferentes fuentes de carbono (glucosa, glicerol, acetato) [124],
y
Se observ una baja regulacin de las clulas cultivadas en un fermentador de l-2
en
temperatura constante y pH de llegar a la fase estacionaria o estar en
la detencin del crecimiento [188]. Sin embargo, la respuesta al estrs en general
regulada por la
sigma factor de s
s
(Producto del gen rpoS) se indujo en estas condiciones y
fue suprimida, cuando una protena heterloga fue producido (6 l-fermentador,
fed-batch) [134]. Este reguln tambin fue inducida cuando los cidos grasos de
cadena corta,
tal como acetato, estaban presentes en el medio, por ejemplo, debido al cultivo en
medio mnimo, contribuyendo as a una mayor estabilidad de las clulas hacia
estrs cido [126,189]. El anlisis global de la expresin gnica destac la
influir sobre la expresin de genes adicionales, por ejemplo, de los implicados
en la gluclisis, TCA-ciclos, la respiracin o la biosntesis de los aminocidos y
de
aquellos con una funcin an desconocida [129]. Algunos resultados se
correlacionaron bien con
conocimientos previos, otros an no se comprenden, en particular, cuando los
genes
perteneciente a la misma regulon se encontraron ser regulado de manera diferente
[124133,
188]. Sobre la base de la informacin disponible, un genoma escala
computacional
modelo de la red de regulacin transcripcional y metablica fue con-
truido para E. coli [193] para permitir no slo la descripcin, sino tambin la
prediccin de reacciones celulares.