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Reparar, reusar, reciclar: el rol en expansin de la autofagia en el mantenimiento del genoma

La macroautofagia es una va catablica que distribuye protenas u organelas congregadas,


daadas o en exceso hacia los lisosomas para su degradacin. La activacin de la autofagia se
produce como respuesta a numerosos factores de estrs celulares como, por ejemplo, altos
niveles de especies reactivas de oxgeno (ROS) y bajos niveles de nutrientes celulares as como
el dao del ADN e inestabilidad genmica. En los ltimos aos, nuestro entendimiento de la
interaccin entre la autofagia y la estabilidad genmica se ha incrementado considerablemente.
En esta publicacin resumimos los avances recientes en el entendimiento de los mecanismos
moleculares que unen la autofagia con la reparacin del ADN.
Introduccin
El mantenimiento de la integridad genmica es esencial para la supervivencia del organismo. El
ADN puede ser daado por diversos factores externos como la radiacin UV, la radiacin
inica, y compuestos qumicos; y por factores intrnsecos como radicales libres generados como
parte de un metabolismo normal y errores en la replicacin. Este torrente de perjudicadores
genotxicos resulta en la generacin de 19200 lesiones estimadas en el ADN por da. Es,
entonces, necesario para las clulas tener mecanismos efectivos para la deteccin y reparacin
de este dao para mantener su supervivencia.
As como la integridad genmica, el mantenimiento de la homeostasis proteica es un
requerimiento esencial para la supervivencia de las clulas y los organismos. Por consiguiente,
existen mltiples vas responsables del reemplazo de las protenas y organelas daadas e
indeseadas. El sistema ubiquitina-proteosoma es el responsable de la degradacin de protenas
solubles y de corto tiempo de vida, est activo en el ncleo y el citoplasma y se le atribuye la
mayora de los reemplazos de protenas dentro de la clula. La etiqueta de protenas objetivo
con cadenas de ubiquitina convierten al sistema proteosoma-ubiquitina en altamente selectivo.
Como resultado de su habilidad de controlar firmemente los niveles de protenas, el sistema
proteosoma-ubiquitina ha mostrado ser quien regula numerosos procesos celulares como el ciclo
celular, la transduccin de seales y la reparacin del ADN.
El trmino autofagia proviene del griego auto, que significa uno mismo y phagein, que
significa comer y describe a las vas celulares catablicas de degradacin conservadas durante
la evolucin que estn involucradas en la distribucin de carga del citoplasma hacia el lisosoma.
Existen tres tipos principales de autofagia en las clulas eucariotas: la microautofagia (la
engullicin directa y la degradacin de porciones del citoplasma mediante invaginaciones del
lisosoma), la autofagia mediada por un chapern (la translocacin directa de las protenas
objetivo que contienen KFERQ hacia el lisosoma va el receptor LAMP-2A) y la
macroautofagia (el secuestro de la carga citoplasmtica en vesculas de doble membrana
llamadas autofagosomas, seguido por el transporte a lo largo de los microtbulos y la fusin con
el lisosoma). La macroautofagia es el punto central de esta publicacin y se referir a ella aqu
solo como autofagia. Al igual que el sistema proteosoma-ubiquitina, el cargamento puede ser
elegido como objetivo para la autofagia debido a la accin selectiva de las protenas receptoras.
De igual manera que en el sistema proteosoma-ubiquitina, la seal principal para la degradacin
autofgica es la ubiquitinacin de la carga, permitiendo su enganche al autofagosoma debido a
los receptores. Dada la ausencia de autofagia en el ncleo y la creencia previa de que la
autofagia no era un proceso selectivo, por mucho tiempo se crey que el sistema proteosoma-
ubiquitina era la nica va de degradacin que impactada en la reparacin del ADN daado. Sin
embargo, recientemente la evidencia sugiere que la autofagia y la reparacin del ADN daado
podran estar unidos mecnicamente, sin importar que ocurran espacialmente en distintos
compartimientos celulares. En esta publicacin se provee un resumen del modelo actual de la
maquinaria del ncleo relacionada con la autofagia y la respuesta del ADN ante el dao. Luego,
nos centramos en el desarrollo reciente de nuestro entendimiento del rol de la autofagia en el
mantenimiento y la reparacin del ADN.
Autofagia
La autofagia tiene un rol fundamental en el mantenimiento de la homeostasis celular y est
activa en niveles basales pero variables en todas las clulas. La actividad autofgica basal es
dependiente de la funcin de la clula as como de la demanda de energa. La autofagia sirve
para desechar protenas y organelas que estn daadas o son indeseadas y que estn acumuladas
como consecuencia del metabolismo normal de la clula, como agregados de protenas txicas o
mitocondrias daadas. Su actividad est controlada por mltiples sensores que detectan cambios
en el entorno intra y extracelular; esto significa que la autofagia puede ser activada como
respuesta ante diversos factores de estrs de la clula, como inanicin, hipoxia, dao
mitocondrial e infeccin patognica. El propsito primario de esta activacin es mantener la
homeostasis celular y promover la supervivencia celular. La interrupcin o alteracin del
proceso autofgico est implicada es la patologa de muchas enfermedades humanas, desde el
cncer hasta la neurodegeneracin relacionada con la edad.
La activacin en exceso de la autofagia tambin ha sido observada en clulas en proceso de
muerte celular. El rol exacto de esta activacin se mantiene como rea de debate, ya que an no
est claro si es que las clulas mueren como consecuencia directa de la activacin de la
autofagia o si la autofagia se activa en clulas estresadas en extremo, solo como ltimo intento,
obviamente fallido, de promover la supervivencia. Recientemente, se ha sugerido que la
autofagia podra ser la causante de la muerte celular, formando parte de una va distinta a la
apoptosis o necroptosis. Aqu, la activacin excesiva de la autofagia a travs del tratamiento con
pptidos inducidores de autofagia, inanicin o hipoxia-isquemia cerebral induce la muerta
celular mediante un mecanismo dependiente de la Na +, K+-atpasa. Los roles a favor de la
supervivencia y los posibles roles a favor de la muerte celular sitan a la autofagia en el centro
del mantenimiento de la clula y de la homeostasis de los organismos en respuesta a distintos
estmulos estresantes.
Durante el proceso de autofagia, las membranas lipdicas, cuyo origen es debatido, se
ensamblan en el citosol y dan origen a una vescula autofgica naciente (el autofagosoma) que
engulle la carga que est destinada a ser degradada. Una vez que el autofagosoma es sellado, es
transportado a lo largo de los microtbulos y, eventualmente, distribuye su carga al lisosoma
para la degradacin, a travs de la formacin de una estructura hbrida denominada
autolisosoma. Este proceso no solo permite la remocin de componentes celulares daados y
potencialmente txicos, sino que tambin activa la liberacin de molculas bsicas como
aminocidos o lpidos de vuelta al citoplasma para que sean reusadas en procesos catablicos o
biosintticos como bloques de construccin y fuentes de energa.
Inicialmente considerada como un proceso no selectivo, ahora se sabe que la autofagia muestra
especificidad ante una diversidad de sustratos intracelulares. Esta especificidad est mediada
por receptores autofgicos como los miembros prototpicos de la familia p62/SQSTM1 as
como varias protenas relacionadas funcionalmente. La mayora de las protenas receptoras
contienen dominios que se unen a la ubiquitina, lo cual les permite interactuar con la carga
marcada para la degradacin autofgica con cadenas de ubiquitina, incluyendo Lys63-
poliubiquitina y otras clases de uniones. Mientras que no son consideradas como necesarias para
la biognesis del autofagosoma, las protenas receptoras median la unin de las membranas
autofgicas a la carga y promueven su secuestro a manos del autofagosoma naciente. Esta
funcin es mediada por patrones de la regin interactuante con el LC3-II, lo cual permite la
interaccin con las protenas autofgicas de la familia (Atg)8 en la superficie interna del
autofagosoma. La autofagia selectiva mediada por receptores puede seleccionar como objetivos
a diversos componentes celulares y puede ser clasificada en subtipos, incluyendo a la agrefagia
(limpieza de protenas propensas a la aglomeracin), mitofagia (mitocondria disfuncional) y
nucleofagia (componentes nucleares daados).
La reparacin de la ruptura de la doble hebra
Las rupturas de las hebras dobles son lesiones altamente txicas en donde ambas hebras de
ADN se rompen. Se ha probado que causan inestabilidad genmica y muerte celular. Para
protegerse de esto, los organismos han desarrollado mecanismos DDR altamente regulados para
la deteccin del dao y la activacin de vas de reparacin de las rupturas de las hebras dobles.
Los defectos en estos procesos conllevan a numerosas enfermedades, as como al desarrollo de
cncer.
Existen dos vas principales responsables de la reparacin de la ruptura de la hebra doble:
uniones no homlogas a los finales y recombinacin homloga. Las uniones no homlogas a los
finales estn activas durante todo el ciclo celular, mientras que la recombinacin homloga est
activa solo durante las fases S y G 2 en donde las cromtides hermanas estn disponibles como
plantillas para la reparacin. El uso de una plantilla homloga por la recombinacin homloga
permite una reparacin sin errores. Las uniones no homlogas, en contraste, dependen del
ligamiento de los finales de ADN sin el uso de una plantilla, resultando en un aumento de la
ocurrencia de productos errneamente reparados. La inhibicin o ausencia de la recombinacin
homloga conduce a la dependencia de la va de unin no homloga a los finales, que es una va
propensa a los errores, y esto genera el aumento de las mutaciones y las reestructuraciones
cromosomales. Los componentes clave de la va de recombinacin homloga como lo son el
BRCA2 y RAD51, son supresores tumorales conocidos, ya que inactivan las mutaciones
relacionadas a la inestabilidad genmica. Adems de para la reparacin de las rupturas de las
hebras dobles, los factores de la recombinacin homloga son importantes para la proteccin de
las horquillas de replicacin atascadas, en una forma independiente de recombinacin. La
RAD51 es dirigida hacia las horquillas de replicacin atascadas a travs de un mecanismo
dependiente de Mre11 y BRCA2. En un proceso sumamente balanceado, se piensa que el Mre11
aumenta la abertura de ADN de una sola hebra producida por el replisoma y facilita la
reparacin post-replicacin, mientras que el BRCA2 induce la carga del RAD51, lo que protege
a las horquillas de replicacin detenidas al prevenir la extensin excesiva de las aberturas de
ADN de una sola hebra.
En contraste, las uniones no homlogas a los finales no requieren de una plantilla homloga
para mediar la reparacin de las rupturas de las hebras dobles. En cambio, los finales del ADN
son unidos directamente por ADNligasas. Las uniones no homlogas a los finales no son
requeridas exclusivamente para reparar las rupturas de las hebras dobles generadas por estrs
tanto endgeno como exgeno; sino que tambin son necesarias para la ligacin de rupturas
generadas durante la recombinacin V(D)J, un proceso requerido para la diversidad de la
inmunoglobulina y los receptores de clulas T. Los genes de la inmunoglobulina y los
receptores de clulas T contienen secciones variables (V), diversas (D) y unidas (J, de joining)
que estn unidas por la maquinaria de las uniones no homlogas a los finales, dando origen a
exones V(D)J maduros en clulas B y T, respectivamente. Las rupturas de las hebras dobles son
generadas entre secuencias de recombinacin se seales y la codificacin del ADN por las
protenas RAG1 y RAG2. La ruptura resultante ha desafilado los finales del ADN con una
estructura parecida a una U, que requiere el procesamiento por Artemis antes de la ligacin va
NHEJ (uniones no homlogas a los finales). Las mutaciones en los genes que determinan la
funcionalidad de la va NHEJ pueden conllevar una severa inmunodeficiencia combinada
debido a la incapacidad para completar el V(D)J apropiadamente. Consecuentemente con su
importancia en el NHEJ, las clulas con una deficiencia de Artemis muestran una
radiosensibilidad considerable y anormalidades cromosomales significativas.
Autofagia e integridad genmica
La evidencia del rol de la autofagia en el mantenimiento del genoma fue observada por primera
vez en clulas tumorales con deficiencia de autofagia, donde la falta de la autofagia resulta en el
incremento de los marcadores de inestabilidad genmica como, por ejemplo, ADN daado,
amplificacin de los genes y aneuploida. Esto ha sido atribuido al aumento de los niveles de
ROS y p62, ya que la reduccin de cualquiera de los dos alivia el creciente dao observado en
clulas cuya autofagia se encuentra comprometida. La autofagia ha mostrado reducir los niveles
de ROS a travs de la eliminacin de mitocondrias daadas, en un proceso llamado mitofagia.
Tambin se ha demostrado que la degradacin dependiente de p62 de KEAP1 por la autofagia
provoca la liberacin de Nrf2 y la activacin de defensas antioxidantes. Por ello, es posible que
la inhibicin de la autofagia pueda conllevar a la inestabilidad genmica debido a que generara
altos niveles de ROS genotxica. Sin embargo, estudios recientes tambin sugieren que la
autofagia podra impactar la integridad genmica a travs de la degradacin de los componentes
nucleares y la modulacin de las vas para la reparacin de las rupturas de las hebras dobles.
La degradacin de los componentes nucleares a travs de la autofagia
En las clulas de los mamferos, la autofagia ha estado ampliamente implicada en el reemplazo
de las protenas y organelas citoplasmticas; no obstante, la degradacin de los componentes
nucleares tambin ha sido observada. En casos muy especficos, la degradacin mediada por la
autofagia de todo el ncleo ha sido observada en bajos organismos como el hongo Aspergillus
oryzae durante la formacin del sincitio y el organiso unicelular binuclear Tetrahymena
thermophila para eliminar a uno de sus dos ncleos. En la mayora de contextos celulares, se
espera que la degradacin nuclear al por mayor va autofagia genere la prdida de material
genmico, lo que resultara letal. En cambio, en grupo de evidencia creciente sugiere un
reemplazo autofgico selectivo y muy controlado de los componentes nucleares en las clulas
de mamferos. Las clulas con defectos en su envoltura celular (envelopatas) causados por
mutaciones en protenas tal y como la laminina A o como la emerina albergada en los
autolisosomas que contienen componentes nucleares. Autolisosomas similares fueron
observados en clulas salvajes, no obstante, en una frecuencia mucho ms baja, sugiriendo que
este proceso no est meramente confinado a las envelopatas nucleares. Es ms, se ha
demostrado que la autofagia contribuye a la remocin del microncleo, lo que resulta en una
segregacin cromosomal inadecuada durante la perturbacin del ciclo celular. Los microncleos
que son positivos para el marcador H2A.X son etiquetados para la degradacin autofgica
por la protena receptora p62. Interesantemente, las clulas con un genotipo aneuploide artificial
muestran una actividad autofgica incrementada as como niveles elevados de p62. La
inhibicin de la autofagia en el contexto de la envelopatas, perturbaciones del ciclo celular y
aneuploida artificial result en el incremento del dao del ADN y la inestabilidad genmica.
Todos estos datos sugieren que la autofagia cumple un rol de proteccin en el contexto de la
segregacin anmala de los cromosomas.
Recientemente, se demostr que la degradacin autofgica de los fragmentos de cromatina
citoplasmticos ocurre en clulas que siguen la induccin de la senescencia inducida por
oncogenes y de la senescencia replicativa. Aqu, los fragmentos de cromatina citoplasmticos
que surgen desde el ncleo negativos a la laminina A/C y positivos a la H2A.X y
H3K27me3 son procesados por la autofagia a travs de la interaccin con p62 mediada por
ubiquitina. Existe la hiptesis de que este proceso conduce a la perturbacin de la laminina B1 y
a la prdida de histonas asociada con la estabilizacin de la senescencia celular. Mecnicamente,
la laminina B1 y la cromatina asociada son transportadas desde el ncleo hacia el citoplasma y
degradadas por autofagia como respuesta a la activacin oncognica. Este proceso es mediado
por la interaccin directa de LC3 con la laminina B1 dentro del ncleo. La prdida o alteracin
de la interaccin entre la laminina B1 y LC3 o la inhibicin de la autofagia previenes la prdida
de la laminina B1 y atenan la senescencia inducida por oncogenes. Estos datos sugieren que la
degradacin autofgica de los componentes nucleares tiene un rol en el mantenimiento
genmico a travs de la estabilizacin de la senescencia celular, actuando como una barrera para
la tumorignesis siguiendo la activacin de oncogenes.
La autofagia y la reparacin del ADN
Recientemente, el rol de la autofagia en el mantenimiento del genoma ha sido extendido, ya que
la evidencia sugiere que cumple un rol ms directo en la reparacin del dao en el ADN.
El primero de estos estudios not que la inhibicin de histonas deacetilasas a travs del
tratamiento con cido valproico resultaba en la activacin de la autofagia y el incremento de la
degradacin autofgica de la ADN endonucleasa Sae2 en levaduras. Esto result en bajos
niveles de extirpacin de los finales y una disminucin de la supervivencia celular como
respuesta a agentes genotxicos. Es ms, la eliminacin de Rpd3 y Hda1 en levaduras sintetiza
fenotipos inducidos por VPA y esto podra ser aliviado por la eliminacin de la histona
acetiltransferasa Gcn5, lo cual sugiere que estn involucradas en la regulacin de la acetilacin
de Sae2 en respuesta al dao del ADN. La activacin de la autofagia con tratamiento de
rapamicina redujo los niveles de Sae2, lo cual indica que la acetilacin y la subsecuente
degradacin autofgica podra ser un nuevo mecanismo que une la reparacin del ADN y la
autofagia. Otros estudios proponen que el tratamiento con rapamicina podra suprimir la
reparacin de las rupturas de las hebras dobles. Sin embargo, se debe notar que la inhibicin de
la diana de rapamicina en clulas de mamfero impacta procesos celulares variados, como la
sntesis de protenas, la progresin del ciclo celular y la apoptosis, fuera de su rol regulador en
la autofagia.
Mientras que algunos descubrimientos sugieren que la activacin de la autofagia puede generar
deficiencia en la reparacin del dao del ADN, muchos estudios proponen que la inactivacin
de la autofagia puede tambin dar origen a la reduccin de la capacidad de reparar el ADN
daado. Por ejemplo, la prdida de la autofagia a travs de la eliminacin inducible de Atg7
conlleva a la deficiencia de la reparacin de las rupturas de las hebras dobles mediante la va de
recombinacin homloga (HR). Se propuso que este defecto se deba a una actividad
proteosomal acentuada, lo que acenta la degradacin del centro de control mediador de HR
kinasa 1. Las dos vas principales para la reparacin de las rupturas de las hebras dobles pueden
compensarse entre s cuando una va es perjudicada. De este modo, las clulas con deficiencia
de Atg7 son muy dependientes de NHEJ para la reparacin de las rupturas de las hebras dobles
y la inhibicin de NHEJ causa una muerte celular rpida y clulas con deficiencia de autofagia.
Esta relacin sinttica letal entre la autofagia y NHEJ presenta un camino teraputico
emocionante por el cual se podran marcar clulas con deficiencia de autofagia, las cuales son
una caracterstica comn de las enfermedades humanas relacionadas con la edad.
Adems, la inhibicin de la autofagia por la eliminacin gentica de la protena interactuante
con la familia 200-kDa FAK, una protena que interacta con la ULK1 y que es esencial para la
formacin del autofagosoma, suprime la reparacin del ADN daado y disminuye la viabilidad
celular siguiendo un tratamiento de radiacin ionizante y camptotecina. Aunque los mecanismos
moleculares exactos no han sido explorados, la eliminacin de p62 alivi el defecto en la
reparacin e increment la supervivencia celular. Lo segundo sugiere que el aumento de los
niveles de p62 debido a la inhibicin de la autofagia podra ser el responsable de la reduccin de
la reparacin de ADN daado.
La observacin del traslado entre el ncleo y el citoplasma de p62 provee una unin interesante
entre el proceso citoplasmtico de la autofagia y el ncleo. Tanto una seal nuclear de
exportacin como dos seales nucleares de localizacin han sido identificadas. Dos estudios
recientes sugieren que la reparacin del ADN est influenciado por la p62 ubicada
especficamente en el ncleo, pero a travs de distintos modelos. En uno de los estudios, el
aumento de los niveles de p62 como resultado de la inhibicin de la autofagia provoc la
disminucin de la ubiquitinacin de la cromatina inducida por el dao al ADN. Mecnicamente,
este fenotipo fue explicado por la interaccin de p62 y RNF168 va el dominio de p62 LIM-
binding y el dominio de RNF168 MU1. Esta interaccin inhibi la actividad de la ligasa E3 de
RNF 168, resultando en una ubiquitinacin perjudicada de la cromatina y la reduccin del
reclutamiento de protenas reparadoras de ADN luego del dao al ADN. Al igual que en reportes
anteriores, la inhibicin de la autofagia, especficamente la reparacin de las rupturas de las
dobles hebras dirigida por HR, muestra clulas con disminucin en el reclutamiento de
protenas HR cono RAD51, RAP80 y BRCA1, mientras sugiere un mecanismo distinto del que
se mencion anteriormente. Finalmente, usando experimentos xenograft, la sobreexpresin del
p62(K7A/D69A/I314E) mutante relacionado con la exportacin del ncleo, conllev a la
disminucin de la supervivencia de las clulas tumorales luego de una irradiacin. Este fenotipo
era dependiente de la interaccin entre el p62 y el RNF168, ya que la supresin del dominio LB
del p62 aboli este efecto. Se debe notar que el RNF168 acta contrariamente al HR y NHEJ y
que la inhibicin de la ubiquitinacin de la cromatina mediada por la p62 provoca la
perturbacin de ambas vas mientras que la inhibicin de la autofagia solo afecta al HR. Un
trabajo ms intensivo es necesario para entender est aparente contradiccin.
Un mecanismo alternativo para la modulacin de la reparacin del ADN mediada por la
autofagia dependiente de p62 ha sido reportado. Aqu, se vio que la p62 inhiba la reparacin de
las rupturas de las hebras dobles dirigida por HR a travs de la degradacin proteosomal de la
filamina A y el RAD51 en el ncleo. La filamina A se ha visto previamente implicada en la
reparacin del ADN, especficamente a travs de la interaccin con el BRCA1/2 y el
reclutamiento de RAD52 en la va de reparacin HR. El efecto de la autofagia en la reparacin
del ADN pareca ser independiente de CHK, lo cual sugera un mecanismo distinto al que antes
se haba reportado. Es importante, sin embargo, notar que esto fue observado siguiendo bajos
niveles de induccin de dao; por lo tanto, los cambios en las seales descendentes como el
CHK1 pudieron ser menos aparentes. Finalmente, se sugiri que la inhibicin de la reparacin
del ADN mediada por p62 poda ser un impulsor del envejecimiento de los organismos, lo cual
puede ser revertido mediante la restriccin dietaria, un potente activador de la autofagia.
En resumen, la autofagia est directamente involucrada en la reparacin de las rupturas de la
doble hebra. Especficamente, la deficiencia de la autofagia puede inhibir la reparacin a travs
de la va HR, ya sea por niveles incrementados de degradacin proteosomal de la protena
mediadora del HR CHK1 o por altos niveles de p62, especficamente en el ncleo. La p62
nuclear impacta el HR mediante la inhibicin de la ubiquitinacin de la cromatina mediada por
RNF168, as como marcando a las protenas HR RAD51 y filamina A para la degradacin va
proteosoma. Un trabajo ms a fondo es requerido para entender la conexin entre estos
mecanismos para esclarecer si operan por separado o en cooperacin.
Conclusiones
Se est volviendo cada vez ms claro que, as sea un proceso citoplasmtico, la autofagia tiene
un rol fundamental en el mantenimiento de la estabilidad genmica. Un rango de mecanismos
parece estar involucrado donde la autofagia puede impactar indirectamente el mantenimiento
del ADN (por ejemplo, va la modulacin de ROS a travs de procesos como la mitofagia y la
defensa antioxidante), as como directamente (por ejemplo, a travs de una degradacin
selectiva de los componentes nucleares y la modulacin de la reparacin de las rupturas de la
doble hebra). No obstante, estos estudios iniciales derivan en preguntas sumamente importantes
que necesitan ser respondidas para poder seguir con la investigacin en esta rea. Cuando
nuestro entendimiento sobre la conexin entre la autofagia y el mantenimiento del genoma y su
impacto en la fisiologa se expanda, esto presentar potencialmente emocionantes y nuevas
oportunidades teraputicas.