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Pueden utilizarse cualquier protocolo de obtencin de ADN, pero todos tienen que
producir un ADN libre de ARN, fenol, sales, etanol, EDTA, protenas, etc... Cada usuario
puede elegir el protocolo que ms se adapte a sus necesidades pero funcionan mejor los
que conllevan mtodos de purificacin con minicolumnas.
Por lo general todos los kits comercializados que comprenden una etapa de
purificacin en columna dan plsmidos de buena calidad para la secuenciacin
(Quiagen, Roche, Eppendorf, Biorad, etc...), a excepcin de algunas slicas/resinas
comerciales que dejan impurezas. Se recomienda centrifugar la columna dos veces
despus del paso de lavado y a continuacin eluir el DNA con agua. Para asegurar
la eliminacin del etanol presente en la solucin de lavado de la muestra.
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- Los mtodos de "lisis alcalina" no son recomendable a no ser que vaya
seguido de una purificacin posterior con un kit especfico o mediante
precipitacin.
La mezcla de PCR debe ser purificada (precipitacin, kits comerciales...) con objeto de
eliminar subproductos, cebadores y dNTPs contaminantes que impidan la secuenciacin.
La secuenciacin de fragmentos de pequeo tamao es algo problemtica por lo que se
recomienda que los productos sean de al menos 150 pb. Los fragmentos ms pequeos se
pueden comportar como primers y son difciles de purificar con buen rendimiento.
1.2.2. Precipitacin.
Este mtodo implica diluir una alcuota del producto de PCR entre 5 y 10 veces
en agua y emplearlo directamente en la secuenciacin automtica. Para ello, es
necesario emplear bajas concentraciones de dNTPs y primers en la reaccin de PCR,
de tal manera que, las concentraciones finales de los primers sean de 0,2 M o menos
y las concentraciones de dNTPs sean de 100 M o menos. La principal desventaja
de este mtodo es que se requiere una optimizacin individual de las condiciones
para cada producto de PCR.
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1.2.4. Purificacin del producto de PCR de un gel de agarosa.
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3. CEBADORES DISPONIBLES
Adems de los cebadores descritos se puede utilizar cualquier cebador sintetizado por
el usuario. Para un correcto diseo de cebadores que vayan a ser utilizados en
secuenciacin, recomendamos lo siguiente:
Los cebadores debern tener, al menos, 18 bases para asegurarnos que hibriden con
el ADN a secuenciar y evitar hibridaciones secundarias en el vector o en el inserto.
Deben tener una Tm entre 50 C-65 C. Se puede utilizar la siguiente frmula para
calcular la Tm . Tm=69.3+0.41x(%GC)-650/longitud del primer
Debe evitarse la utilizacin de cebadores con secuencias que formen estructuras
secundarias, especialmente en el extremo 3, o puedan hibridar formando dmeros
intercatenarios. Para ello, evitar en lo posible la utilizacin de cebadores que tengan
en su secuencia repeticiones de ms de 3 4 Gs Cs seguidas y % GC entre 40-50
%.
No deben emplearse cebadores con errores, ni cebadores que hibriden en ms de
un sitio en la secuencia o que puedan formar dmeros.
Disear el primer al menos 50 bases upstream de la secuencia de inters. La
secuencia inmediatamente posterior al primer o no se obtiene o puede ser bastante
imprecisa.
3. PROGRAMAS
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4. REPETICIONES
Las secuencias fallidas se facturan cuando se estima que las causas de error son del tipo
a o b. Las producidas por errores del tipo c se repiten. Si la repeticin vuelve a fallar se
asumir que no se trataba de un error operativo. Para cualquier duda o consulta ponerse en
contacto con la Unidad. Cuando las muestras enviadas sean repeticiones indicarlo en
el Formulario de Solicitud que se adjunta con las muestras para hacer los cambios
oportunos con el fin de conseguir un resultado satisfactorio.
Las causas de error ms habituales que se asocian con el DNA de partida y que afectan,
principalmente, a la calidad del mismo, son las siguientes:
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Para productos de PCR las impurezas ms habituales son los fragmentos que
copurifican con el molde como por ejemplo primer-dimers, que contienen sitios
de unin para los cebadores de secuenciacin.
Contaminacin por nucleasas: por ejemplo la DNasa causa un cambio de la forma del
plsmido superenrollada a lineal lo que reduce gradualmente la intensidad de la
seal y la longitud de la secuencia obtenida. Por lo tanto hay que evitar las cepas
hospedadoras que produzcan nucleasas.
Contaminacin por RNA: esto ocurre ms frecuentemente cuando los cultivos
han crecido demasiado tiempo y el tampn de lisis es insuficiente para lisar todas
las clulas. Las muestras contaminadas con RNA muestran un ruido de fondo
alto. El tratamiento del DNA molde con RNasa (libre de DNasa) degradar el
RNA con lo que se pueden mejorar los resultados de las secuenciacin. Por otro
lado, la presencia de RNA falsea la cuantificacin del ADN.
Contaminacin por sales: la presencia de sales inhibe la reaccin de secuenciacin
(disminuye la procesividad de la polimerasa). Sin embargo el tipo de sal influye en
la severidad del efecto: por ejemplo el cloruro de sodio o de potasio tiene un
efecto mayor que la misma concentracin de acetato de sodio. Un concentracin
de acetato de sodio mayor de 20mM inhibe severamente la reaccin de
secuenciacin. Las causas ms comunes de contaminacin por sales son: la
coprecipitacin de stas con el etanol en la precipitacin del DNA, sobre todo si
esta se realiza a baja temperatura; una eliminacin insuficiente del sobrenadante; o
un lavado con etanol 70% insuficiente. Por lo tanto la precipitacin del DNA
molde y los lavados deben realizarse muy cuidadosamente y a temperatura
ambiente.
Contaminacin por etanol: se produce por la resuspensin del DNA molde tras la
precipitacin sin que se haya secado suficientemente. La presencia de pequeas
cantidades de etanol (5%) puede causar la terminacin prematura de las cadenas y
por lo tanto la obtencin de secuencias cortas. Una contaminacin con etanol
superior al 10% tiene como consecuencia normalmente el fallo total de la
reaccin de secuenciacin.
Contaminacin con fenol: algunos mtodos de preparacin de DNA plasmdico
utilizan un paso de extraccin con fenol. La contaminacin con este reactivo tiene
como resultado la degradacin severa de la secuencia resultante, especialmente en
lecturas largas. Ms de un 1,4% de fenol en el DNA molde produce secuencias
totalmente inutilizables.
e. Problemas con los cebadores especficos del molde. La muestra puede contener
distintos sitios de unin, o el cebador no unirse al molde o cantidad insuficiente del
cebador, error en el clculo de la Tm, DNA subclonado que arrastre polilinker y
existan varios sitios diana para cebadores universales, etc
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Posible causa Posible solucin
No hay ADN o hay menos del necesario Aumentar la cantidad de ADN
No hay cebador o la concentracin es inferior a la Aumentar la concentracin o cantidad de
necesaria. El primer puede estar degradado cebador, Cambiar la alcuota.
El cebador no encuentra el sitio de hibridacin Cambiar el cebador. Asegurarse del diseo
El ADN presenta contaminacin Volver a preparar el ADN
El cebador est mal diseado o la temperatura de
Redisear el cebador
melting no es la adecuada
El sitio de unin del cebador en el vector se ha
perdido o daado. Durante la clonacin pueden
crearse artefactos con una delecin cerca del sitio Volver a clonar en el vector
de insercin del DNA a clonar o deleciones que
eliminan la secuencia del primer del vector.
En los productos de PCR puede que los
amplificados no sean el producto de la
amplificacin con los dos cebadores. Si el
amplificado se genera a partir de uno de los dos
primers slo se obtendr secuencia con ste. Este Cambiar de cebador
efecto se puede producir cuando se utilizan para
secuenciar los mismos primer que se han utilizado
en la amplificacin del DNA molde y alguno de
ellos no funciona correctamente.
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El cebador utilizado en la secuenciacin no es el
adecuado:
- Estructura secundaria (afecta ms en Cambiar el cebador
extremo 3)
- Tm del cebador demasiado baja (muy corto,
poco contenido GC, etc)
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secuenciacin debido a una mala purificacin
del producto. Cuando termina la secuencia de
los dmeros la lectura es correcta.
Cebador degenerado Cambiar de cebador
ADN subclonado existiendo dos sitios diana
Secuenciar con otro cebador
para el cebador universal utilizado1
Posible causa Posible solucin
PCR inespecfica: diana del cebador en ambos
extremos, es decir, amplicn inespecfico Cambiar de cebador
generado por un solo cebador
Hay ms de un ADN molde en la muestra3 Repreparar el ADN
-Primer Drimer
- En el caso de un clon mltiple: la mezcla de lecturas comienza a partir de las 30-90 pb de bases,
es decir, la lectura de ambas colonias coincide solo en el vector. Una vez comienza el inserto, si son
distintos, se mezclan las lecturas.
Ejemplo:
La reaccin comienza de
forma normal pero existe
doble lectura a partir de un
determinado punto (30-90
pb aprox.)
-Insercin/Delecin
La reaccin comienza de forma normal pero existe doble lectura a partir de un determinado punto
(ms de 150 pb aprox.)
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Posible causa Posible solucin
Regin heterocigtica para ese fragmento Digestin para eliminarlo
Mutaciones frame shift
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Posible causa Posible solucin
Terminadores no incorporados (entre 0-180 pb) Repetir la reaccin de secuenciacin
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Posible causa Posible solucin
Formacin de dplex que alteran estabilidad del Usar temperaturas de secuenciacin ms bajas
cebador que la estndar
Cuando se secuencien organismos con un alto contenido GC indicarlo en las tablas que se adjuntan
con la muestras a secuenciar
1. Las repeticiones de AG pueden ser problemticas pues la Taq produce una seal dbil de G
despus de A cuando se utilizan terminadores marcados. En este caso conviene secuenciar la
cadena complementaria.
K) Presencia de microsatlites
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L) Presencia de largos homopolmeros
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M)Primer N-1
N) Solo terminadores
Aparecen solo los terminadores debido a que la Poner mas cantidad de ADN o de mejor calidad
cantidad de ADN es insuficiente
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O) No inserto
G C + T C
A A
Heterozigot
o: GT
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SECUENCIACION MASIVA ( NGS)
La Unidad de Genmica tiene disponible la tecnologa Ion Torrent que utiliza chips de
sensores de tipo semiconductor que miden la liberacin de protones durante la reaccin de
polimerizacin del ADN. La deteccin se realiza en todos los sensores en paralelo y en
tiempo real, por lo que la duracin de las carreras es de solo unas horas.
Los equipos disponibles son el Ion PGM y el Ion S5 (Life Technologies-Thermo Fisher)
adems de los equipos Ion Chef y Ion One Touch 2, para la preparaciin automtica de las
muestras.
INFORMACIN ADICIONAL
En caso de dudas sobre cualquier punto, pueden ponerse en contacto con la Unidad a
travs de nuestro telfono o e-mail.
957 21 85 87 o genomica@uco.es
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