CROMATOGRAFA-2011

INTRODUCCIN A LA CROMATOGRAFA

INTRODUCCIN

La cromatografa es una tcnica que permite la separacin de los

componentes de una mezcla debido a la influencia de dos efectos contrapuestos.

a) Retencin. Efecto producido sobre los componentes de la mezcla por una

fase estacionaria, que puede ser un slido o un lquido anclado a un
soporte slido.
b) Desplazamiento. Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por
una fase mvil, que puede ser un lquido o un gas.

El fenmeno de migracin de los componentes de una mezcla a lo largo

de la fase estacionaria, impulsados por la fase mvil, recibe el nombre de
elucin. La mezcla a separar se deposita sobre la fase estacionara, mientras que
la mvil atraviesa el sistema desplazando a los componentes de la mezcla a
distinta velocidad, dependiendo de la magnitud de sus interacciones relativas
con ambas fases. Las dos fases se eligen de forma que los componentes de la
muestra se distribuyan de modo distinto entre la fase mvil y la fase
estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase
estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase mvil; por el contrario
los componentes que se unen dbilmente a la fase estacionaria, se mueven con
rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la
muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa
y/o cuantitativamente.

Pgina 1
 CROMATOGRAFA-2011

TIPOS DE CROMATOGRAFA.

Dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase mvil se

pueden distinguir distintos tipos de cromatografa

a) Cromatografa slido-lquido. La fase estacionaria es un slido y la

mvil un lquido.
b) Cromatografa lquido-lquido. La fase estacionaria es un lquido
anclado a un soporte slido.
c) Cromatografa lquido-gas. La fase estacionaria es un lquido no
voltil impregnado en un slido y la fase mvil es un gas.
d) Cromatografa slido-gas. La fase estacionaria es un slido y la mvil
un gas.

Segn el tipo de interaccin que se establece entre los componentes de la

mezcla y la fase mvil y estacionaria podemos distinguir entre.

a) Cromatografa de adsorcin. La fase estacionaria es un slido

polar capaz de adsorber a los componentes de la mezcla
mediante interacciones de tipo polar.

Pgina 2
 CROMATOGRAFA-2011

b) Cromatografa de particin. La separacin se basa en las

diferencias de solubilidad de los componentes de la mezcla en las
fases estacionaria y mvil, que son ambas lquidas.
c) Cromatografa de intercambio inico. La fase estacionaria es un
slido que lleva anclados grupos funcionales ionizables cuya
carga se puede intercambiar por aquellos iones presentes en la
fase mvil.

CROMATOGRAFA DE ADSORCIN

La adsorcin es la propiedad que tienen ciertos slidos de aumentar la

concentracin en su superficie de otras sustancias. La separacin se debe a las
diferencias de adsorcin de los componentes de una mezcla sobre la fase
estacionaria. La fase estacionaria ha de ser un slido polar de gran superficie
(adsorbente). La fase mvil puede ser un gas o un lquido dando lugar a la
cromatografa gas-slido (CGS) o lquido-slido (CLS).

El grado de adsorcin vara segn la naturaleza y superficie especfica de

los adsorbentes y naturaleza de los solutos. Los enlaces entre molculas
adsorbidas y el adsorbente han de ser dbiles para que su fijacin sea reversible,
las uniones son debidas a fuerzas intermoleculares (interacciones dipolo-dipolo
o puentes de hidrgeno). Como regla general, las polaridades del adsorbente y
de los solutos han de ser opuestas.

Cromatografa lquido-slido (CLS).

La fase estacionaria est constituida por un slido polar poroso y que esta
finamente granulado. La superficie especfica contiene centros polares aptos
para la adsorcin de las molculas polares presentes en la fase mvil. Al

Pgina 3
 CROMATOGRAFA-2011

disminuir el tamao de las partculas, el nmero de centros activos por unida es

mayor, y la capacidad de adsorcin se incrementa. El adsorbente ms utilizado
es gel de slice aunque tambin se emplea almina activada. En el caso del gel
de slice la interaccin se establece entre los grupos Si-OH y Si-O-Si, y los
grupos funcionales polares de los compuestos orgnicos.

La fase mvil est constituida por un disolvente en el que los

componentes de la mezcla deben ser al menos parcialmente solubles. La
velocidad de elucin de un compuesto se incrementa al aumentar la polaridad de
la fase mvil y se puede utilizar un gradiente de polaridad aumentando con el
tiempo la proporcin del disolvente ms polar.

Propiedades de los disolventes ms comunes.

Punto de Constante
Disolvente Frmula qumica Densidad
ebullicin dielctrica

Disolventes no polares

Hexano CH3-(CH2)4-CH3 69 C 2,0 0,655 g/ml

Benceno C6H6 80 C 2,3 0,879 g/ml

Tolueno C6H5-CH3 111 C 2,4 0,867 g/ml

ter dietlico CH3CH2-O-CH2-CH3 35 C 4,3 0,713 g/ml

Cloroformo CHCl3 61 C 4,8 1,498 g/ml

Acetato de etilo CH3-C(=O)-O-CH2-CH3 77 C 6,0 0,894 g/ml

Disolventes polares aprticos

1,4-Dioxano CH2-CH2-O-CH2-CH2-O 101 C 2,3 1,033 g/ml

Pgina 4
 CROMATOGRAFA-2011

Tetrahidrofurano (THF) CH2-CH2-O-CH2-CH2 66 C 7,5 0,886 g/ml

Diclorometano (DCM) CH2Cl2 40 C 9,1 1,326 g/ml

Acetona CH3-C(=O)-CH3 56 C 21 0,786 g/ml

Acetonitrilo (MeCN) CH3-CN 82 C 37 0,786 g/ml

Dimetilformamida H-C(=O)N(CH3)2 153 C 38 0,944 g/ml

(DMF)

Dimetil sulfxido CH3-S(=O)-CH3 189 C 47 1,092 g/ml

(DMSO)

Disolventes polares prticos

cido actico CH3-C(=O)OH 118 C 6,2 1,049 g/ml

n-Butanol CH3-CH2-CH2-CH2-OH 118 C 18 0,810 g/ml

Isopropanol (IPA) CH3-CH(-OH)-CH3 82 C 18 0,785 g/ml

n-Propanol CH3-CH2-CH2-OH 97 C 20 0,803 g/ml

Etanol CH3-CH2-OH 79 C 24 0,789 g/ml

Metanol CH3-OH 65 C 33 0,791 g/ml

cido frmico H-C(=O)OH 100 C 58 1,21 g/ml

Agua H-O-H 100 C 82 1,000 g

La retencin se realiza en base a la competencia que se establece entre el

soluto a separar (S) y las molculas de la fase mvil (M) por adsorberse a los
centros activos polares (X) de la fase estacionaria. As las molculas de soluto se
adsorben a los centros activos de la fase estacionaria y van siendo desplazados
por las molculas polares presentes en la fase mvil.

Pgina 5
 CROMATOGRAFA-2011

Los tiempos de retencin y la selectividad en la separacin dependern de

la polaridad de los compuestos a separar (S), la naturaleza del adsorbente (X) y
la naturaleza de los disolventes que componen la fase mvil (M).

Cromatografa en capa fina.

La cromatografa en capa fina se basa en la preparacin de una capa,

uniforme de un absorbente mantenido sobre una placa, la cual puede ser de
vidrio, aluminio u otro soporte. La fase mvil es lquida y la fase estacionaria
consiste en un slido. La fase estacionaria ser un componente polar y el
eluyente ser por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que
los componentes que se desplacen con mayor velocidad sern los menos polares.

La mezcla a analizar se deposita a una pequea distancia del borde

inferior de la placa y se introduce en una cubeta que contiene la fase mvil, que
asciende a lo largo de la placa por capilaridad, desplazando a los componentes
de la mezcla a diferentes velocidades, lo que provoca su separacin. Cuando el
frente del disolvente se encuentra prximo al extremo superior de la placa esta
se saca y se visualiza.

La relacin entre la distancia recorrida por un compuesto y por el

disolvente desde el origen se conoce como Rf (rate factor).

Rf= Distancia recorrida por el compuesto

Distancia recorrida por el disolvente

Pgina 6
 CROMATOGRAFA-2011

La bsqueda del eluyente requiere probar con varios disolventes de

diferente polaridad o con mezclas. Para compuestos poco polares, que se
desplazan con mucha facilidad, se debe utilizar un disolvente apolar como el
hexano y en el caso de compuestos de polaridad media, mezclas de hexano y
acetato de etilo.

La mayora de las placas de cromatografa llevan un indicador

fluorescente que permite la visualizacin de los componentes activos a la luz
ultravioleta (254 nm). En el caso de componentes que no absorban a la luz
ultravioleta, la visualizacin requiere utilizar un agente revelador. El revelador
reacciona con los productos proporcionando productos coloreados.

Cromatografa preparativa en placa.

La cromatografa preparativa se lleva a cabo en placas de gel de slice de

1-2 mm de espesor sobre un soporte de vidrio. Se utiliza para la separacin y
aislamiento de los componentes de una mezcla en cantidades comprendidas
entre 100-200 mg.

Pgina 7
 CROMATOGRAFA-2011

En la superficie del adsorbente (gel de slice), mediante una pipeta

Pasteur, se traza una lnea continua con la muestra disuelta y se introduce la
placa en posicin vertical en una cubeta. Durante la elucin debe permanecer
tapada para evitar la evaporacin del disolvente. Una vez se han separado los
productos que componen la muestra, se marca con una cuchilla el contorno del
compuesto a aislar y con ayuda de una esptula se desprende del soporte de
vidrio el gel de slice con el compuesto adsorbido. Una vez transferido a un
erlenmeyer se aade un disolvente en el cual sea soluble el producto, se filtra el
gel de slice y una vez eliminado el disolvente tenemos el producto puro.

Chromatotron.

Pgina 8
 CROMATOGRAFA-2011

Cromatografa en columna.

Es el mtodo ms utilizado para la separacin de compuestos orgnico a

escala preparativa. La fase estacionaria se deposita en el interior de una columna
de vidrio que termina con una placa porosa que impide su paso y en un
estrechamiento con una llave. La mezcla se deposita sobre la parte superior de la
fase estacionaria mientras que la fase mvil atraviesa el sistema. Los
compuestos van saliendo por separado de la columna y se recogen en fracciones,
los ms polares quedan ms retenidos y para que salgan generalmente hace falta
aumentar la polaridad del disolvente. El tiempo necesario para eluir un
compuesto de la columna se llama tiempo de retencin.

El adsorbente ms utilizado para cromatografa de columna es gel de

slice, aunque tambin se puede emplear almina y florisil. La elucin de la

Pgina 9
 CROMATOGRAFA-2011

cromatografa puede realizarse por gravedad o mediante presin (Flash

chromatography), la diferencia en ambos casos est en el tamao de las
partculas de gel de slice (0,063-0,200 nm, slice de columna, 0,040-0,063 nm,
slice flash). Debido a que la disminucin del tamao de las partculas de
adsorbente conduce a una separacin ms eficaz, la cromatografa a media
presin (flash) proporciona mejores resultados, adems de ser ms rpida.

Las variables que ms influyen en la eficacia de la separacin en

cromatografa de columna y utilizando gel de slice como adsorbente son las
siguientes;

a) Dimetro de la columna y cantidad de gel de slice. La altura del

adsorbente est relacionada con la diferencia de Rf de los componentes
de la mezcla. El dimetro de la columna con la cantidad de producto a
separar.
b) Eleccin del disolvente. El disolvente tienen que conducir a una buena
separacin de los componentes de la mezcla en capa fina, utilizndose
en muchos casos mezclas de disolventes y se realiza una elucin en
gradiente. Una de las mezclas ms utilizadas es hexano/acetato de
etilo.

Cromatografa en papel.

Es la ms sencilla de las tcnicas, pero slo nos dar resultados

cualitativos. Est casi en desuso. El mtodo se basa en un mecanismo de reparto,
y consiste en depositar una pequea cantidad de muestra en el extremo de una
tira de papel de filtro, que se deja evaporar. Luego se introduce la tira en una
cubeta que contenga el disolvente, de manera que ste fluya por la tira por
capilaridad.

Pgina 10
 CROMATOGRAFA-2011

Cuando el disolvente deja de ascender o ha llegado al extremo, se retira el

papel y seca. Si el disolvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color
propio se vern las manchas de distinto color separadas. Cuando los
componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de revelado.

Hay varios factores de los cuales depende una cromatografa eficaz: la

eleccin del disolvente y la del papel de filtro.

CROMATOGRAFA DE PARTICIN.

La cromatografa lquido-lquido, tambin llamada de particin se

caracteriza por emplear una fase estacionaria lquida, anclada a un soporte
slido, y una fase mvil tambin lquida. El soporte slido por lo general es gel
de slice, sobre cuya superficie se ha anclado una fase lquida con la
incorporacin de una cadena hidrocarbonada larga, mediante la transformacin
de los grupos silanol (Si-OH) de la gel de slice en grupos siloxano (Si-O-Si-R),
lo que proporciona una fase lquida estacionaria trmicamente estable y difcil
de hidrolizar en condiciones normales.

Pgina 11
 CROMATOGRAFA-2011

Tabla. Cadenas hidrocarbonadas ancladas a la gel de slice en cromatografa

lquido-lquido.
Funcionalidad Estructura Polaridad Tipo
Diamino -(CH2)3-NH(CH2)2-NH2 Muy alta Normal
Aminopropilo -(CH2)3-NH2 Alta Normal
Nitrilo -(CH2)n-CN Media Normal
Nitro -(CH2)n-NO2 Media Normal
Diol (CH2)3-OCH2-CH(OH)-CH2OH Dbil Normal
Dimetilamino -(CH2)3-N(CH3)2 Dbil Normal
Propilo -(CH2)2-CH3 Baja Inversa
Fenilo -(CH2)n-Ph Baja Inversa
Octilo -(CH2)7-CH3 Baja Inversa
Octadecilo -(CH2)17-CH3 Muy baja Inversa

La polaridad de la fase estacionaria puede modificarse en funcin de la

naturaleza de las cadenas hidrocarbonadas introducidas en la gel de slice, lo que
permite disponer de fases estacionarias con selectividad diferente. La separacin
en la cromatografa lquido-lquido se basa en la diferencia de solubilidad de los
componentes de la mezcla entre las dos fases lquida o en las diferentes
interacciones de los componentes de la mezcla con los grupos funcionales
presentes en la cadena enlazada al gel de slice. En funcin de la polaridad de la
fase lquida estacionaria, se distingue entre:

a) Cromatografa en fase normal. La fase estacionaria est constituida por un

lquido de carcter polar. Como fase mvil se emplean mezclas de
disolventes apolares (hexano, pentano), con disolventes polares (cloroformo,
diclorometano, T.H.F., etanol, metanol o acetonitrilo). Se utiliza para la
separacin de compuestos muy polares que quedaran demasiado retenidos
en una cromatografa slido-lquido. En este tipo de cromatografa el orden
de elucin est gobernado por interacciones de tipo polar: los solutos ms
polares quedan ms retenidos, igual que en la cromatografa de adsorcin.

Pgina 12
 CROMATOGRAFA-2011

b) Cromatografa en fase reversa. La fase estacionaria est constituida por un

lquido de carcter apolar. Como fase mvil se emplean mezclas de agua con
disolventes polares miscibles, como metanol o acetonitrilo siendo la fase
mvil ms polar que la fase estacionaria. Se emplea para la separacin de
mezclas de compuestos de polaridad baja, que se retienen muy poco en una
cromatografa slido-lquido, y para la separacin de compuestos de una
misma serie homloga. La retencin se explica en base a una adsorcin
preferencial del disolvente menos polar de la fase mvil a la superficie de las
cadenas apolares que constituyen la fase estacionaria, de manera que se
establece un mecanismo complejo que supone una combinacin de
equilibrios de solubilidad (particin) de la mezcla que se cromatografa entre
la fase lquida adsorbida a la fase estacionaria y la fase mvil.
La separacin ocurre como consecuencia de las diferencias en la superficie
apolar de los componentes de la muestra, los compuestos menos polares
sern ms solubles en la fase estacionaria que los ms polares. Por tanto, al
contrario que en la fase normal, los compuestos ms polares estarn menos
retenidos que los menos polares. Los tiempos de retencin disminuyen
cuando menor sea la proporcin de agua, cuando menos polar sea el
disolvente empleado.

Cromatografa de intercambio inico.

La cromatografa de intercambio inico (cromatografa inica) es un

proceso que permite la separacin de iones y molculas polares basado en las
propiedades de carga de las molculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo de
molcula cargada, incluyendo grandes protenas, pequeos nucletidos y
aminocidos. La solucin que se inyecta es usualmente llamada muestra y los

Pgina 13
 CROMATOGRAFA-2011

componentes separados individualmente son llamados analitos. Es usada a

menudo en purificacin de protenas, anlisis de agua o control de calidad.

La fase estacionaria (resina de intercambio) muestra en la superficie

grupos funcionales inicos que interactan con iones de carga opuesta. Este tipo
de cromatografa se subdivide a su vez en la cromatografa de intercambio
catinico y cromatografa de intercambio aninico:

La cromatografa de intercambio catinico retiene cationes cargados

positivamente debido a que la fase estacionaria muestra un grupo funcional
cargado negativamente (SO3-, CO2-). Las resinas cuyo grupo funcional activo es
un sulfonato (SO3-) se consideran resinas intercambiadoras cidas fuertes,
mientras que aqullas cuyo grupo funcional activo es un in carboxilato (CO2-)
se consideran resinas cidas dbiles.

R-A-H+ + M+ + B- <--> R-A-M+ + H+ + B-

La cromatografa de intercambio de aniones retiene aniones usando

grupos funcionales cargados positivamente, como un catin de amonio
cuaternario (R4N+).

R4-N+L- + M+ + B- <--> R4-N+B- + L- + M+

Pgina 14
 CROMATOGRAFA-2011

R-H++ M+<--> R-M++ H+ Kd= [M+]R[H+] / [M+] [H+]R

Este tipo de cromatografa se basa en el equilibrio de intercambio inico

entre una fase slida que contiene grupos sulfnicos o carboxlicos (para la
separacin de cationes) o grupos amino cuaternarios, ternarios o secundarios
(para la separacin de aniones) y los iones presentes en la fase mvil. Por
ejemplo, para la separacin de cationes se puede utilizar una resina de cido
dbil donde se producir el siguiente equilibrio:

R-CO2H + M+ R-CO2M + H+

En este caso, el catin M+ puede ser eluido de la columna por un cido

fuerte en una concentracin capaz de desplazar el equilibrio representado en la
ecuacin anterior hacia la izquierda. El desarrollo de esta tcnica al estado de

Pgina 15
 CROMATOGRAFA-2011

cromatografa de alta resolucin, llamada cromatografa inica, fue posible a

partir de la dcada del 70 cuando se desarrollaron recubrimientos que contienen
los materiales tpicos para el intercambio (grupos sulfnicos para cromatografa
catinica y grupos aminos cuaternario para cromatografa aninica). Estos
recubrimientos se depositan sobre pequeas esferas de slice, vidrio o de algn
polmero que son capaces de soportar las altas presiones comnmente utilizadas
en cromatografa lquida de alta resolucin.

PRCTICA DE CROMATOGRAFA EN COLUMNA

En todo procedimiento en qumica orgnica reconocemos las etapas que
se muestran en el siguiente esquema para el aislamiento y caracterizacin de los
productos orgnicos.

Esquema: Esquema general de las etapas de aislamiento y purificacin de

los productos preparados en un proceso sinttico en qumica orgnica

A + B C + D

Otros
Reactivos Mezcla de reaccin

Productos de reaccin Purificacin Caracterizacin

Separacin Cristalizacin Pf
Extraccin
cromatogrfica Destilacin Peb

RMN

Pgina 16
 CROMATOGRAFA-2011

Una vez ha concluido la reaccin, la mezcla resultante se extrae para

separar los sustratos que nos interesan. A continuacin la mezcla obtenida, que
generalmente es el producto de reaccin, productos secundarios, reactivos y/o
algo del producto de partida, se separa por cromatografa de columna.
Finalmente los productos, para caracterizarlos correctamente, y por regla
general, requieren de una purificacin adicional que se lleva a cabo mediante
otra cromatografa ms cuidadosa y/o cristalizaciones-destilaciones, segn el
caso.

En ocasiones y por necesidades de tiempo en los laboratorios de prcticas

no se lleva a cabo la separacin cromatogrfica, aunque sea una operacin
necesaria en el trabajo de sntesis, como hemos indicado en prrafos anteriores.
Por esta razn hemos considerado oportuno incluirla como ejemplo en un curso
introductoria, de esta manera damos una visin real del trabajo sinttico en
qumica orgnica.

En esta experiencia se propondr la separacin de los componentes de una

mezcla hipottica de reaccin por cromatografa de columna. Las mezclas
estarn constituidas realmente por dos sustancias. Por ello, y como en casos
anteriores, se sugiere tener conocimiento de las caractersticas de los sustratos
antes de comenzar.

Las mezclas estarn constituidas por 0.2 g de cada uno de los productos y
antes de proceder a su separacin habr que decidir eluyente ms adecuado para
poder desarrollar una separacin aceptable.

Procedimiento general

Para el proceso de separacin-purificacin por cromatografa de columna se

Pgina 17
 CROMATOGRAFA-2011

siguen los siguientes pasos:

A) Se sujeta la columna a un
soporte y se rellena con la fase estacionaria
en forma de papilla o en seco segn se nos
indique.

B) Opcionalmente se puede aadir

arena hasta obtener una franja de unos 2-5
mm de espesor, para proteger el frente de la
fase estacionaria.

C) Se deposita la muestra en
disolucin o adherida a una pequea
cantidad de adsorbente sobre la arena,
procurando tener una franja horizontal.

D) Opcionalmente se puede poner

otra franja de arena como la primera o un
poco de lana de vidrio.

E) Aadir la fase mvil con

cuidado por la pared de la columna hasta
llenarla.

Pgina 18
CROMATOGRAFA-2011

F) Los componentes de la mezcla

deben eluirse manteniendo un flujo continuo
de disolvente.

G) Las fracciones recogidas

debern analizarse mediante una tcnica
cromatogrfica analtica: cromatografa de
capa fina para comprobar su contenido y
pureza. Las fracciones que tengan semejante
contenido se juntan en el mismo matraz,
previamente pesado y el disolvente se
elimina en el rotavapor.

Pgina 19