A LIMENTACIN. Utilizacin de cepas de Bacteroides spp.

como probitico en conejos

Alimentacin

Utilizacin de cepas
de Bacteroides spp.
como probitico en
conejos
A. Prez de Rozas1,2, J. Gonzlez2,
N. Aloy2, I. Badiola1,2
1
Institut de Recerca i Tecnologa
Agroalimentaries (IRTA), Barcelona, Spain.
2
Centre de Recerca en Sanitat Animal
(CReSA), UAB-IRTA, Bellaterra, Spain

INTRODUCCIN

Cuando surgieron los antibiticos se

consider que eran la panacea de la salud;
sin embargo, debido al uso intensivo,
y en algunos casos al uso inadecuado
que se ha hecho de ellos, ha hecho
aparecer un gran problema como es el
de las resistencias microbianas siendo
necesario el descubrimiento de nuevos
antibiticos o la implementacin de
medidas alternativas (Cotter et al., 2013;
Hooper and Gordon, 2001; Lapea, 1999).
Como medidas alternativas, las ms
habituales estn basadas en el uso de
prebiticos, probiticos o la combinacin
de ambos (simbiticos), sin olvidar la
necesaria implementacin de medidas de
bioseguridad, higiene y manejo.

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 A LIMENTACIN. Utilizacin de cepas de Bacteroides spp. como probitico en conejos

PREBITICOS Y PROBITICOS la microbiota endgena. Esta simbiosis adquiere

su mximo exponente en el sistema digestivo,
Los prebiticos son productos alimenticios no con la microbiota intestinal.
digeribles por el hospedador pero s fermentables Desde el nacimiento hasta la muerte, el
por algunos micoorganismos digestivos y que hospedador es colonizado por un vasto, complejo
pueden provocar la estimulacin del crecimiento y dinmico consorcio de microorganismos (Tuohy
o de la actividad de diferentes bacterias que et al., 2003). La relacin entre la microbiota y
producen efectos beneficiosos para la salud del el hospedador puede derivar de comensalismo
hospedador (Fotiadis et al., 2008; Gibson and a patogenicidad, dependiendo de las cepas de
Roberfroid, 1995; Guarner and Malagelada, 2003; microorganismos y de las condiciones fisiolgicas
Markovic et al., 2009; Quigley, 2010; Tuohy et al., del animal, y tambin puede producirse una
2003). Generalmente permiten cambios tanto en la disminucin de la tolerancia del hospedador a
composicin como en la actividad de la microbiota ciertos microorganismos de su microbiota (Hooper
digestiva, incrementando la salud intestinal (Hedin and Gordon, 2001), intolerancia que puede
et al., 2007). Afectan al hospedador estimulando provocar inflamacin intestinal crnica seguida
selectivamente el crecimiento y la actividad de una de importantes alteraciones metablicas (Pakandl,
o varias bacterias del colon (Kaur et al., 2009). 2009).
Los probiticos Nuestro grupo
son microorganismos trabaja a menudo
vivos, cuya ingestin con granjas de
en cierto nmero conejos y sabemos
produce efectos la problemtica que
beneficiosos no tienen en cuanto
inherentes a la a enfermedades
nutricin normal digestivas y el uso
(FAO/WHO, 2002; que se hace de los
Fotiadis et al., antibiticos, por lo
2008; Gorbach, que hemos hecho el
2002; Guarner and estudio sobre esta
Malagelada, 2003; especie.
Isolauri et al., 2004; En cuanto a la
Nomoto, 2005; especie de la micro-
Quigley, 2008; Tuohy biota para utilizar
et al., 2003). Para como probitico se
ser considerado necesita escoger una
como probitico, especie adecuada y
el microorganismo Bacteroides spp. mtodos que mues-
necesita sobrevivir, tren las diferencias
y multiplicarse, en el tracto gastrointestinal, por entre cepas de la misma especie para ver cules
lo que debe adaptarse al medio cido y a las sales son las ms tiles. Nosotros escogimos especies de
biliares (van de Guchte et al., 2012). Bacteroides spp.
En la prctica de campo, El inters de nuestro grupo
frecuentemente se administra La relacin entre en centrar el foco de atencin en
la combinacin de ambos, Bacteroides spp. fue el resultado
productos conocidos como
la microbiota y el de experimentos previos sobre
simbiticos (Fotiadis et al., 2008; hospedador puede animales con Enteropata
Hedin et al., 2007; Quigley, 2010; derivar de comensalismo Epizotica del Conejo (EEC) en
Tuohy et al., 2003). a patogenicidad, los que pudimos comprobar
que la administracin, bien en
MICROBIOTA dependiendo de las cepas el momento del destete bien
de microorganismos en el momento del inicio de la
Realmente no somos y de las condiciones sintomatologa, de diferentes
conscientes de que, en fisiolgicas del animal cepas de Bacteroides fragilis
condiciones fisiolgicas, los provocaban la reduccin del 50%
diferentes seres vivos somos, en la tasa de mortalidad en relacin
la asociacin de nuestra propia fisiologa con la observada en los grupos de animales que no
con la fisiologa de un enorme nmero de recibieron las cepas de B. fragilis.
microorganismos. Estos microorganismos forman Los Bacteroides spp. se encuentran en el

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intestino en recuentos de hasta 1011 cfu/g heces,
son capaces de colonizar el colon, la cavidad oral,
el tracto respiratorio superior y el tracto genital
femenino. B. fragilis tiene un polisacrido capsular
(PSA) que interviene en la colonizacin y que adems
participa en la maduracin del sistema inmune
asociado a la mucosa intestinal. Producen tambin
bacteriocinas que tienen actividad antimicrobiana y
que son muy estables.
PRUEBAS IN VITRO
Para obtener un producto probitico lo ms
importante es la seleccin de la cepa o cepas que
se incluirn en l. Este fue el objetivo principal de
este trabajo.
Basndonos en la coleccin de Bacteroides
spp. del CReSA, en este trabajo se han realizado
estudios in vitro para seleccionar cepas, con
ausencia de caractersticas negativas y presencia
de caractersticas positivas, que pudieran utilizarse
en estudios in vivo, en gazapos durante la fase
de lactacin, y poder analizar su rol como posible
probitico. De esta coleccin se seleccionaron
97 cepas para estudiar sus caractersticas y as ir
seleccionando unas cepas e ir desechando otras.
Los Bacteroides spp. podran tener actividad
probitica por dos mecanismos diferentes: bien
produciendo sustancias inhibidoras del crecimiento
de otros componentes de la microbiota intestinal
(bacteriocinas, metabolitos secundarios), bien
estimulando al sistema inmune, incrementando
las defensas de forma inespecfica (inmuno-
moduladores).
Pruebas:
produccin de sustancias inhibidoras
del crecimiento
presencia de PSA y grado de expresin
perfiles de antibiticos
deteccin de genes de resistencia a
antimicrobianos
presencia de secuencias de insercin
sensibilidad a coccidiostticos
presencia de mucinasa y grado de
expresin
deteccin genes de enterotoxinas
N de cepas incluidas en el estudio: 97
B. fragilis............................................ 29
B. thetaiotaomicron.......................... 29
B. acidifaciens.................................... 25
B. vulgatus............................................ 5
B. xylanosolvens................................... 3
B. dorei................................................. 2
B. massilliensis...................................... 2
B. intestinalis........................................ 1
B. fluxus................................................ 1
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La produccin de sustancias inhibidoras del
crecimiento fue un factor importante a estudiar.
En la mayora de muestras de granjas con EEC,
nuestro grupo observ un incremento significativo
de Bacteroides spp. en los animales afectados, un
signo que consideramos forma parte de los factores
asociados a la patogenia de la enfermedad y que
podra explicar el efecto positivo de algunas cepas
de Bacteroides fragilis en la reduccin de las tasas
de mortalidad de los animales con EEC.
Se usaron tcnicas de bacteriologa para
estudiar las resistencias a antimicrobianos y a
cocidiostticos. La resistencia a antimicrobianos
fue el factor determinante de la eleccin de ciertas
bacterias sobre otras.
Para estudiar produccin de PSA y su grado de
expresin, las secuencias de insercin, la deteccin
de genes de resistencias y la produccin de mucinasa
y su grado de expresin se utilizaron tcnicas
moleculares: extraccin de DNA y RNA, y se hicieron
PCR, Real Time-PCR.
Con los resultados obtenidos por la produccin
de sustancias inhibidoras del crecimiento, produccin
de PSA y una primera serie de antibiogramas, se
eliminaron muchas de las cepas y pasamos a tener 20.
Despus se estudiaron todos los resultados y
escogimos cuatro de las cepas estudiadas: CV-183,
CV-293, CV-315, CV-607.
PRUEBAS IN VIVO
Despus de seleccionar cuatro cepas, se
procedi al estudio in vivo, en una granja comercial,
examinando el efecto sobre la microbiota intestinal
y diferentes parmetros inmunitarios de la mucosa
intestinal. Se incluy tambin un grupo control
negativo (no contena ningn Bacteroides).
En cuanto a la microbiota intestinal, no hubo
cambios significativos en el perfil global y se observ
que el efecto de la madre fue muy superior al
efecto de la cepa inoculada. De este resultado pudo
inferir que, como ya habamos comprobado en
otras pruebas, la microbiota de la madre determina
claramente la microbiota de los gazapos.
No obstante lo anterior, los recuentos de
Bacteroides spp. en el contenido cecal de los
animales a los que se les administraron las cepas
CV-183, CV-293 o CV-315 tuvieron recuentos
significativamente inferiores al control negativo y
a los que recibieron la cepa CV-607. Este hallazgo es
de capital importancia y puede explicar la reduccin
de las tasas de mortalidad que ya habamos
observado por la inoculacin de la cepa CV-315 a
animales con EEC.
El efecto obtenido sobre marcadores
inmunitarios de la mucosa intestinal, en unos
casos con niveles de expresin inferiores al control
negativo (citoquinas proinflamatorias) y en otros
superiores (marcadores de superficie relacionados
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 Tabla 1. N de cepa, la especie de Bacteroides a que corresponde, el antibitico probado y su resultado en categoras sensible (S),

RIF=rifampicina, COL=colistina NAL=cido nalidxico, LIMENTACIN.

CHL=cloranfenicol,A
intermedio (I) y resistente (R) segn el CLSI. (GEN=gentamicina, TCY=tetraciclina, TYL=tilosina, AMX=amoxicilina, TIO=ceftiofur,
cepas de Bacteroides spp.
Utilizacin de LIN=lincomicina, como probitico en conejos
ERI=eritromicina, PEN=penicilina,
BAC=bacitracina, NIT=nitrofurantoina, ENR=enrofloxacina, SUL=sulfonamida, FOS=fosfomicina, CLI=clindamicina, TEC=teicoplanina).
Cepa Especie GEN TCY TYL AMX TIO RIF COL NAL CHL LIN ERI PEN BAC NIT ENR SUL FOS CLI TEC
CV-0130 B. thetaiotaomicron R S S S R S R R S R R R R S I S R R R
CV-0183 B. dorei R S S S I S R R S R R I S S I S R S S
CV-0232 B. fragilis R R S S S S R R S S R R R S I S R S I
CV-0268 B. thetaiotaomicron R S S S R S R R S S R R I S I S R R R
CV-0293 B. fragilis R S S S S S R R S S R R R S I S R R R
CV-0294 B. fragilis R S S I S S R R S R R R R S S S R R R
CV-0295 B. fragilis R S S S S S R R S S R R I S R R R R I
CV-0309 B. thetaiotaomicron R S S S R S R R S R R R I S I S R R R
CV-0315 B. fragilis R S S I I S R R S S S R R S S S R R I
CV-0323 B. fragilis R S S I I S R R S S S R R S S S R R I
CV-0325 B. fragilis R R S S S S R R S S I R R S S S R S I
CV-0350 B. acidifaciens R S S S R S R R S I R I I S I S R R R
CV-0357 B. acidifaciens R S S S S S R R S R R I S S I I R R I
CV-0375 B. acidifaciens R S S S I S R R S S R I S S R S R R R
CV-0376 B. acidifaciens R I R S S S S R S R R I S S I S R R I
CV-0378 B. fragilis R S S I S S R R S S R R R S I S R S R
CV-0393 B. fragilis R S S I S S R R S S I R R S S S R S R
CV-0464 B. acidifaciens R S S S I S R R S R R R S S I S R R S
CV-0466 B. fluxus R S S S I S R R S R S S S S I S R S I
CV-0607 B. acidifaciens R S S I S S R R S R I I I S I S R R R

cambio positivo para las fases

posteriores de produccin.

CONCLUSIONES
Para realizar estudios de este
tipo se plantea la necesidad de
contar con granjas donde no se
utilicen antimicrobianos, para crear
ceparios de bacterias intestinales sin
marcadores de resistencia.
Las cepas CV-0183, CV-0293
y CV-0315 activaron funciones
relacionadas con la presentacin
de antgenos va MCH II y redujeron
la expresin de algunos genes
de citoquinas proinflamatorias.
Adems estas cepas fueron
capaces de reducir el recuento de
Fig. 2. Proceso de la prueba in vivo: inoculacin intragstrica de cada cepa a 10 gazapos Bacteroides spp.en el ciego de los
de 2 hembras. Sacrificio y necropsia a da 28. Extraccin de DNA en alcohol y de RNA en
RNA-later para las analticas posteriores.
animales tratados.
La cepa CV-607 present un
con la presentacin de antgenos va MHC II), nos comportamiento in vivo diferente
indica entre otras cosas que un buen probitico a las cepas CV-0183, CV-0293 o CV-0315 y, por lo
debera constar de ms de una cepa. general, similar al control negativo.
Adicionalmente, en este trabajo hemos De los resultados obtenidos podemos inferir
podido ver que la administracin de las cepas CV- que algunas de las cepas probadas, CV-0183, CV-0293
183 y CV-315 provocaron el aumento significativo y CV-0315, pueden ser candidatos para el desarrollo
del grado de maduracin de los fragmentos gnicos de un probitico para conejo, especialmente para
que formarn parte de las inmunoglobulinas, controlar EEC, aunque ser importante analizar
preparando al sistema inmunitario asociado a la tambin su papel sobre otras infecciones del sistema
mucosa intestinal para responder mejor a futuras digestivo del conejo.
agresiones de tipo infeccioso o no infeccioso.
El incremento en el grado de variabilidad de BIBLIOGRAFA
las inmunoglobulinas observado representa un Se enviar a quienes la soliciten.

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